Phương pháp PCR - (LUẬN văn THẠC sĩ) phân tích đặc- 123docz.net

2.5.2.1. Tách chiết DNA

DNA của CPVs được tách chiết sử dụng bộ Kít TopPURE® Genomic DNA Extraction của công ty TNHH Giải pháp Y sinh ABT, thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. Tóm tắt các bước thực hiện như sau:

Bước 1: Huyền phù mẫu trong 200 µL PBS. Thêm 20 µL Proteinase K và chuyển sang bước kế tiếp.

Bước 2: Thêm 200 µL CL buffer, vortex đều và ủ khoảng 10 phút ở 60°C. Bước 3: Thêm 200 µL Ethanol (96-100%), trộn đều và chuyển hỗn hợp sang cột silica đặt sẵn trong tube 2 mL. Ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút. Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới.

Bước 4: Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ. Thêm 500 µL WB1 buffer và ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút. Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới.

Bước 5: Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ. Thêm 500 µL WB2 buffer và ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút. Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới.

Bước 6: Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ. Làm khô cột bằng cách ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút.

Bước 7: Chuyến cột sang tube 1,5 mL mới. Thêm 50 µL EB buffer và ủ một phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút, thu phần dịch chứa DNA bên dưới.

Bước 8: DNA thu được sử dụng ngay hoặc bảo quản ở -20°C.

2.5.2.2. Thực hiện phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR)

DNA thu được sẽ được khuếch đại bằng phương pháp PCR với máy PCR (Mastercycler® X50-Eppendof) và các cặp mồi đặc hiệu CPVs với chu trình nhiệt tương ứng. Thành phần của phảng ứng PCR được mô tả trong Bảng 2.1.

Bảng 2.1 Các thành phần trong phản ứng PCR.

STT Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ cuối

1 2 3

Taq DNA pol PCR buffer dNTPs 1.25 U 2 1 2X 10 mM 4 Mồi xuôi 1 10X

5 Mồi ngược 1 10X 6 7 DNA khuôn Nước khử ion 5 13.75 10X Tổng thể tích (µl) 25

Các cặp mồi được sử dụng phát hiện Canine parvovirus là Pav-555F và Pav-

555R [6] với kích thước 583 bp và cặp mồi khuếch đại vùng gene VP2 để giải trình tự gene là cặp mồi đặc hiệu VP2 có kích thước là 1755bp (VP2-51F và VP2-R3) [28].

Bảng 2.2. Primers sử dụng trong phản ứng PCR.

Tên Trình tự Kích thước

(bp) Trích dẫn Pav-555F CAGGAAGATATCCAGAAGGA 583 [6] Pav-555R GGTGCTAGTGATATGTAATAAACA VP2-51F CCAACTAAAAGAAGTAAACC 1755 [28] VP2-R3 CCTATATCAAATACAAGTACAATA

Parvo-Seq-853F TTGGGCTTACCACCATTTCT 902 Nghiên cứu này

(giải trình tự)

Parvo-Seq-1059R AAATGGCCCTTGTGTAGACG 1059

Các cặp mồi sử dụng để khuếch đại trình tự genome được thiết kế trong nghiên cứu này dựa trên các vùng trình tự bảo thủ của các chủng CPVs (CPV/Y1/Japan/1993/D26079) thu thập trên dữ liệu NCBI-Genbank.

Bảng 2.3. Các cặp mồi sử dụng trong khuếch đại trình tự bộ genome CPV.

Tên Trình tự (5’-3’) Vị trí (5’-3’) thước Kích (bp) G/C (%) Tm (°C) Parvo-F1 TTAGAACCAACTGACCAAGTTCA CG (+), 6-30 1225 44 64.1 Parvo-R1 CACCTCCTGGTTGTGCCATC (-), 1230-1211 60 62.5 Parvo-F2 CAAAGCGCGGGAGAATTCAA (+), 1084-1103 1427 50 58.4 Parvo-R2 CAGAGCGAAGATAAGCAGCG (-), 2511-2492 55 60.5 Parvo-F3 GGACTTGTGCCTCCAGGTTA (+), 2385-2404 1358 55 60.5 Parvo-R3 CCCATTTGAGTTACACCACGTC (-), 3742-3721 55 62.1 Parvo-F4 AGAGCATTGGGCTTACCACC (+), 3630-3649 1387 55 60.5 Parvo-R4 CCTGGTTGGTTGCTCTGCTTA (-), 5016-4996 55 61.3 ParvoSeq-171R ATTAGCCCGCCACCTTTTCC (-), 171-152 171 60 60.5

ParvoSeq-4760F TTATGGTGTGGGTGGTTGGT (+), 4760-4779 256 50 58.4

Hình 2.3. Sơ đồ minh họa genome và vị trí các cặp mồi.

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR:

Bảng 2.4. Nhiệt độ và thời gian trong phản ứng PCR.

Kiểm tra sản phẩm PCR: Sau khi phản ứng PCR khuếch đại kết thúc, DNA sẽ

được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,2% (FMC, Rockland).

2.5.3. Giải trình tự gen

Sản phẩm PCR của các đoạn gene khuếch đại được tinh sạch bằng bộ kít QIAquick PCR Purification (QIAgen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR tinh sạch được sử dụng để giải trình tự theo phương pháp Sanger sequencing với cặp mồi khuếch đại đặc hiệu như trình bày tại bảng 2.5 và bảng 2.6 tại công ty FirstBase, Malaysia.

Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ

Tiền biến tính 95 5 phút 1

Biến tính 95 30 giây

Bắt cặp 52-58 30 giây

Kéo dài 72 30 giây - 1 phút

Kết thúc 72 5 phút 1

2.5.4. Phân tích trình tự gene

Kết quả giải trình tự gen được phân tích bằng phần mềm DNASTAR Lasergene (DNASTAR®). Trình tự nucleotide (nt) và amino acid (aa) của các chủng CPVs và các chủng tham chiếu được phân tích, so sánh bằng phần mềm BioEdit 6.0 [41].

2.5.5. Xây dựng và phân tích cây phát sinh loài

Trình tự di truyền gen CPVs của nghiên cứu này được so sánh với các chủng CPVs tham chiếu thu thập từ dữ liệu NCBI-Genbank. Trình tự gen được sắp xếp sử dụng chương trình CLUSTAL-X alignment [42]. Cây phả hệ được xây dựng dựa vào phần mềm Mega 7.0 với tham số Kimura-2 parameter mô phỏng sự thay đổi nt và Bootstrapre-sampling 1,000 lần [43].

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả thu nhận mẫu

Từ tháng 08/2019-08/2020 có tổng số 130 mẫu phân tiêu chảy cấp tính của chó với các triệu chứng điển hình bao gồm sốt, lờ đờ, ít vận động, nôn mửa, tiêu chảy và phân lẫn máu được thu thập tại một số Phòng khám Thú y trên địa bản Tp. Hồ Chí Minh. Trong đó 75 mẫu được thu thập từ Phòng khám Thú y tại quận Bình Tân và 55 mẫu được từ Phòng khám tại Quận 12.

Tại Phòng khám, mẫu bệnh phẩm được chẩn đoán nhanh với CPVs bằng Kít CPV-Ag theo yêu cầu của chủ vật nuôi. Tổng số 25/130 mẫu được thực hiện chẩn đoán nhanh (Bảng 3.1). Mặc dù đây là phương pháp xác định CPVs nhanh, có vai trò quan trọng trong hỗ trợ điều trị bệnh, tuy nhiên do giá thành tương đối cao nên đa phần các chủ hộ có chó nuôi giá trị kinh tế thấp thường không thực hiện. Bác sĩ Thú Y chủ yếu dựa vào các đặc điểm về dịch tễ và các triệu chứng đặc trưng kèm theo để quyết định phương pháp điều trị cho chó bệnh.

Bảng 3.1 Kết quả thu nhận mẫu phân chó tiêu chảy trong nghiên cứu này.

Địa điểm Chẩn đoán bằng Test CPV-Ag Triệu chứng lâm sàng

Bình Tân 15 60

Quận 12 10 45

Tổng 130

Chúng tôi đồng thời theo dõi tỷ lệ tử vong của số lượng chó được lấy mẫu thông qua hồ sơ bệnh án của chó được lưu tại phòng khám tại cơ sở thu mẫu. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.2. Trong đó tỷ lệ chết là 90.8% (118/130).

Bảng 3.2. Kết quả sau điều trị của có bị nhiễm CPV.

Địa điểm lấy mẫu Số mẫu thu thập Kết quả sau điều trị

Sống Chết

Bình Chánh 75 7 68

Quận 12 55 5 50

Tổng số 130 (100%) 12 (9.2%) 118 (90.8%)

Kết quả thu mẫu có thể cho ta thấy được tỷ lệ chó bị tiêu chảy cấp tính hiện tại ở thành phố Hồ Chí Minh xảy ra phổ biến đặc biệt là những nơi nuôi nhốt mật độ cao và điều kiện vệ sinh kém. CPVs thường gây bệnh thường theo mùa, tỷ lệ bệnh tăng nhanh vào mùa mưa (miền Nam) hoặc khi thời tiết thay đổi bất thường. Trong nghiên

cứu này, tỷ lệ chó bị chết khi xuất hiện triệu chứng tiêu chảy cấp tính là rất cao, khoảng 90.8 % (118/130). Tỷ lệ này cao hơn so với tỷ lệ trung bình gây chết do CPVs đã được công bố trong các nghiên cứu trước đó. Nguyên nhân chủ yếu là chó nghiên cứu đa phần là chó con, sức đề kháng yếu, phát hiện bệnh muộn do chủ vật nuôi tự điều trị tại nhà trong một khoảng thời gian khiến bệnh trở nặng hơn.

3.2. Kết quả PCR phát hiện CPVs trong mẫu bệnh phẩm

Những mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm CPVs thu được tại các phòng khám Thú Y được vận chuyển về phòng thí nghiệm. Tiếp theo, mẫu được tách chiết DNA và sử dụng cho phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu CPVs trên gen VP2 (Pav-555F và Pav-555R) (Bảng 2.2). Sản phẩm PCR được nhận diện trên trên gel agarose 1,2 % (FMC, Rockland) với kích thước 583 bp (Hình 3.1).

Hình 3.1 Kết quả PCR chẩn đoán CPVs. Mẫu thí nghiệm (làn 1-10), thang DNA (M) Kết quả PCR chẩn đoán CPVs trong các mẫu phân tiêu chảy thu thập được trình bày chi tiết trong Bảng 3.3.

Bảng 3.3 Kết quả PCR phát hiện CPVs trong mẫu thí nghiệm

Địa điểm Số mẫu thu thập

Kết quả PCR

Âm tính Dương Tính

Bình Chánh 75 6 69

Quận 12 55 14 41

Tổng số 130 (100%) 30 (23.1%) 100 (76.9%)

Trong nghiên cứu này, tổng số 130 mẫu phân tiêu chảy được thu thập tại các phòng khám Thú Y thuộc quận Bình Chánh và Quận 12, Tp. Hồ Chí Minh. Kết quả sau khi thực hiện phản ứng PCR cho thấy 100/130 (76.9 %) mẫu dương tính với CPVs (Hình 3.1, Bảng 3.3). So sánh với các kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Bích và

Cần Thơ, 84/184 (45.1%) mẫu cho kết quả dương tính với CPVs [16]. Trong khi đó, Nguyễn Thị Yến Mai và cộng sự (2018) đã khảo sát tỷ lệ nhiễm CPVs từ tháng 11/2017-5/2018 dựa vào kit chẩn đoán nhanh CPV-Ag với mẫu phân tiêu chảy có lẫn máu tại phòng mạch Thú y, chi cục Chăn nuôi và thú Tiền Giang, phòng mạch Thú y Nam Thủy Đồng Tháp và Bệnh xá Thú y Trường Đại học Cần Thơ. Kết quả cho thấy tỷ lệ chó tiêu chảy phân lẫn máu do CPVs trên chó tại các tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp và Thành phố Cần Thơ lần lượt là 30%, 34% và 30% [44]. Một nghiên cứu khác của Minh Hoàng và cộng sự (2019) điều tra về tình hình dịch tễ học do CPV-2 gây ra ở Việt Nam với tổng số 260 bệnh phẩm thu được ba vùng gồm miền Bắc, miền Trung và miền Nam Việt Nam từ tháng 11 năm 2016 đến tháng 2 năm 2018. Kết quả 260/260 (100%) mẫu bệnh phẩm xác định dương tính với CPVs bằng phương pháp PCR [11]. Điều này cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh do CPVs gây ra tại Việt Nam ngày càng tăng cao. Cần có các phương pháp chẩn đoán nhanh chính xác để phát hiện bệnh kịp thời nhằm đưa ra các phương án kiểm soát dịch bệnh và đưa ra các biện pháp phòng, điều trị bệnh hiệu quả.

3.3. Kết quả PCR khuyếch đại gen VP2

Sau khi xác định được các mẫu dương tính với CPVs bằng phương pháp PCR, chúng tôi lựa chọn 15 mẫu thí nghiệm và mẫu vắc-xin thương mại VANGUARD ®PLUS 5 để tiến hành thực hiện phản ứng PCR nhằm khuếch đại đoạn gen VP2 với cặp mồi đặc hiệu (VP2-51F và VP2-R3) được mô tả trong Bảng 2.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR được quan sát trên gel agarose 1,2 %(FMC, Rockland).

Hình 3.2. Kết quả PCR khuếch đại trình tự đầy đủ gen VP2. M-thang DNA Kết quả khuếch đại gen VP2 của 15 mẫu thí nghiệm và vắc-xin lên đúng với kích thước 1755 bp. Sản phẩm PCR đều, rõ, không xuất hiện hiện tượng vệt mờ, thích

hợp cho việc giải trình tự. Sản phẩm PCR sau đó được tinh chế và giải trình tự bằng phương pháp Sanger Sequencing tại công ty First Base, Malaysia.

3.4. Kết quả PCR genome hoàn chỉnh của chủng CPVs trong nghiên cứu này

Từ kết quả xác định các mẫu dương tính CPVs trước đó, chọn 05 mẫu CPVs với kết quả PCR chẩn đoán lên đúng vị trí và không bị các vệt mờ để tiến hành khuếch đại trình tự genome hoàn chỉnh sử dụng các cặp mồi được thiết kế như mô tả trong Bảng 2.3. Chiều dài bộ gene CPV ước tính trong khoảng >5kb, do đó chúng tôi tiến hành khuếch đại 4 đoạn DNA với các cặp mồi và kích thước sản phẩm PCR dự kiến như sau: ParvoF1/Parvo-R1, 1024bp; Parvo-F2/Parvo-R2, 1427bp; Parvo-F3/Parvo- R3, 1358bp; Parvo-F4/Parvo-R4, 1193bp. Kết quả khuếch đại cho thấy các cặp mồi thiết kế có độ nhạy và đặc hiệu với các chủng CPVs trong nghiên cứu này. Sản phẩm PCR được nhận diện trên trên gel agarose 1,2% với kích thước tương đương với các kích thước dự kiến (Hình 3.3).

Hình 3.3 Sản phẩm PCR khuếch đại genome hoàn chỉnh chủng CPVs trong nghiên cứu này. Thứ tự từ trái qua phải, từ trên xuống dưới trình bày sản phẩm PCR khuếch đại với các cặp primers Parvo-F1/Parvo-R1; Parvo-F2/Parvo-R2; Parvo-

3.5. Kết quả giải trình tự gen VP2

Chúng tôi chọn ra 15 mẫu khuếch đại gen VP2 để tiến hành giải trình theo phương pháp Sager Sequencing tại công ty 1st Base, Malaysia và trình tự được đánh giá bằng phần mềm Seqman 5.0 DNASTAR. Kết quả thu được gene VP2 của toàn bộ 15 mẫu nghiên cứu có độ dài là 1755 bp. Trình tự các mẫu được tiến hành so sánh trên hệ thống BLAST NCBI Genbank. Kết quả cho thấy tất cả 15 mẫu nghiên cứu giống nhau đều thuộc CPV genotype 2c (CPV-2c) (Hình 3.4).

Hình 3.4. Kết quả so sánh tương đồng trình tự trên hệ thống BLAST NCBI

3.6. Kết quả giải trình tự genome hoàn chỉnh chủng CPVs nghiên cứu

Sản phẩm PCR khuếch đại bằng các cặp mồi đặc hiệu cho trình tự genome hoàn chỉnh được tinh chế bằng bộ kít QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm tinh chế được giải trình tự bằng phương pháp Sanger Sequencing tại công ty FirstBase, Malaysia.

Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm DNAstar cho thấy trình tự genome thu được là 4559 bp. Trình tự được sử dụng để so sánh trên cơ sở dữ liệu BLAST-NCBI cho kết quả 05 mẫu vi-rút phân lập được là thuộc chủng Canine parvoviruses, thuộc genotype CPV-2c với mức độ tương đồng cao từ >99%. Khi so

sánh với chủng tham chiếu CPV-SH1516/China/2017/MG013488 phân lập tại Trung Quốc với trình tự đầy đủ của bộ gene là 5059 bp thì các chủng CPVs trong nghiên cứu này xuất phát từ nucleotide 208 đến 4599 (Hình 3.5). Trình tự thu được chứa đầy đủ các gene mã hóa cho các proteins VP2, VP1, NS1 và NS2 với các kích thước tương

ứng 1755 nt (nt 2784-4538), 2256 nt (nt 2283-4538), 2007 nt (nt 270-2276) và 1977 nt (nt 300-2276).

Hình 3.5. So sánh trình tự genome của các chủng trong nghiên cứu này với chủng tham chiếu CPV-SH1516 phân lập tại Trung Quốc.

Phân tích trình tự genome chủng HCM2019-01 cho thấy tỷ lệ % các nucleotide A, T, G, và C lần lượt là 36.1%, 27.8%, 20.1%, và 16%. Trong đó, tỷ lệ A+T và G+C lần lượt là 63.9% và 38.1%. Trong cấu trúc DNA, các liên kết hidro tạo nên giữa A- T và G-C lần lượt là 2 và 3 [45]. Do đó, tỷ lệ G+C trong trình tự CPV tương đối thấp, và đây có thể là nguyên nhân làm cho DNA của CPV kém ổn định và dễ phát sinh biến dị trong quá trình tiến hóa [25] [45]. Tỷ lệ đột biến của CPV tương tự như các RNA vi-rút vào khoảng 10-4 vị trí/năm [45].

3.7. Kết quả so sánh trình tự gen VP2 và trình tự genome hoàn chỉnh của các chủng CPVs trong nghiên cứu này

Gene VP2 của CPVs có độ dài 1755 bp mang đột biến rất phong phú và đóng vai trò quan trọng trong quá trình kích thích đáp ứng miến dịch của cơ thể vật chủ. Các phân tích về trình tự của gene VP2 đóng vai trò quan trọng trong việc xác định các kiểu huyết thanh của CPVs và hỗ trợ phân tích xác định các dạng CPVs ngoài tự nhiên [46]. Trong đó các genotypes -2a, 2b, và -2c được phân biệt tại vị trí amino acid số 426 (426Asn cho CPV-2a, 426Asp cho CPV-2b, và 426Glu cho CPV-2c) [6]. Những khảo sát về protein VP2 của CPVs là điều kiện cần thiết nhất để xây dựng các biện chiến lược vắc-xin trong phòng và điều trị bệnh [13].

Trình tự hoàn chỉnh gene VP2 của 20 mẫu CPVs trong nghiên cứu này được xác định nhằm mục đích phân tích về sự đa dạng di truyền và mối quan hệ giữa các chủng CPV-2c của Việt Nam với các chủng CPVs khác trong cơ sở dữ liệu NCBI- GenBank. Trình tự VP2 trong nghiên cứu này được xác định có độ dài là 1755 bp tạo ra khung đọc mở để mã hóa cho 585 amino acids. Vị trí amino acid 426Glu xác định các chủng CPVs trong nghiên cứu này thuộc vào genotype CPV-2c. Đối với gene VP2, trình tự nucleotide giữa các chủng trong nghiên cứu chia sẻ mức độ tương đồng là từ 99,4%-100%. Khi so sánh với các chủng CPV-2 khác, trình tự gene VP2 của