KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP ADN ADN tái tổ hợp được dùng để chỉ các phân tử ADN được tạo ra từ hai hay nhiều phân đoạn ADN xuất...
Báo cáo chuyên đề KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP ADN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BẠC LIÊU KHOA NÔNG NGHIỆP - MÔN DI TRUYỀN ĐẠI CƯƠNG LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP ADN LÀ GÌ? Khái niệm: ADN tái tổ hợp được dùng để chỉ các phân tử ADN được tạo ra từ hai hay nhiều phân đoạn ADN xuất xứ từ các nguồn gốc khác nhau. Kỹ thuật tái tổ hợp ADN còn được gọi là tạo dòng phân tử (molecular cloning) CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀNLỚP 2NT1 – TỔ 1 Kỹ thuật tái tổ hợp ADN được thực hiện như thế nào? Bao gồm 6 bước: 1. Hai loại ADN được ly trích: ADN có chứa gen cần tạo dòng và plasmid của vi khuẩn đóng vai trò của một vector. 2. Cả ADN và plasmid được xử lý với cùng một loại enzyme giới hạn. Enzyme giới hạn tạo ra đầu dính ở plasmid và ADN cần tạo dòng. 3. Đoạn ADN cần tạo dòng được trộn với plasmid. 4. Nhờ enzyme ligase, các base ở đầu dính của plasmid sẽ gắn với các base bổ sung ở đầu dính của ADN tạo thành plasmid tái tổ hợp. 5. Plasmid tái tổ hợp được chèn vào tế bào vi khuẩn. 6. Sự tạo dòng gen. Vi khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp sẽ sinh sản. Khi vi khuẩn tạo thành một dòng tế bào, tất cả các gen của plasmid tái tổ hợp cũng được tạo dòng. Hình 1: tr49 LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Các enzyme giới hạn Phương pháp điện di Các vector chuyển gen Sự tạo ADN tái tổ hợp Chèn ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN NỘI DUNG: LỚP 2NT1 – TỔ 1 Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhận biết những đoạn trình tự ADN nhất định và cắt ADN ở ngay thời điểm này hay ở điểm kế cận. Có 2 đặc tính: - Không cắt các liên kết photphodieste ở đầu tận cùng, thay vào đó là cắt bên trong phân tử ADN. - Chỉ cắt khi nhận ra các trình tự đặc thù (trình tự nhận biết) bao gồm 4 đến 8 nucleotide ( thường là 4 hay 6). CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀNLỚP 2NT1 – TỔ 1 Các enzyme giới hạn: (retriction enzyme) 1. Hiện tượng giới hạn: Các phage xâm nhiễm tế bào vi khuẩn và sinh sôi nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn. Khi số lượng phage tăng lên hàng triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên, trong một số trường hợp tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn và phage cũng không sinh sôi. Nguyên nhân là do ADN của phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập. Đây chính là hiện tượng giới hạn. CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀNLỚP 2NT1 – TỔ 1 2. Tên gọi: Nguyên tắc: - Chữ thứ nhất viết hoa là chữ đầu tên của giống vi khuẩn từ đó enzyme giới hạn được ly trích. - Chữ thứ hai và thứ ba không viết hoa, ứng với tên loài của vi khuẩn nói trên. - Chữ thứ tư viết hoa để chỉ chủng vi khuẩn sử dụng (nếu có). - Chữ số La mã chỉ thứ tự enzyme giới hạn được phát hiện ( trong trường hợp nhiều enzyme giới hạn cùng được tìm thấy ở một loài vi khuẩn). ☺Ví dụ tr50: enzyme EcoRI E = giống Escherichia co = loài coli R = chủng RYI3 I = enzyme đầu tiên được tìm thấy ở E.coli CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀNLỚP 2NT1 – TỔ 1 3. Phân loại: Có 3 nhóm chính: - Loại I: Khi enzyme nhận biết được trình tự, nó sẽ di chuyển trên ADN đến cách đó khoảng 1000 -5000nucleotide. - Loại II: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó. - Loại III: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ADN ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide. Enzyme giới hạn loại II được sử dụng chủ yếu vì nó cắt tại vị trí giới hạn. Thường cắt ở trình tự chiều xuôi – ngược như nhau. VD: EcoRI CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀNLỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀNLỚP 2NT1 – TỔ 1 ENZYME NGUỒN TRÌNH TỰ NHẬN BIẾT VÀ VỊ TRÍ CẮT Alu I Athrobacter lutues 5’ A G C T 3’ 3’ T C G A 5’ Bal I Brevibaterium 5’ T G G C C A 3’ 3’ A C C G G T 5’ Bam H I Bacillus amyloliquefaciens 5’ G G A T C C 3’ 3’ C C T A G G 5’ Eco RI Escherichia coli 5’ G A A T T C 3’ 3’ C T T A A G 5’ Hae III Haemophylus aegypticus 5’ G G C C 3’ 3’ C C G G 5’ Hind III Haemophylus influenzae 5’ A A G C T T 3’ 3’ T T C G A A 5’ Sau 3A Staphylococcus aureus 5’ G A T C 3’ 3’ C T A G 5’ Taq I Thermus aquaticus 5’ T C G A 3’ 3’ A G C T 5’ Bảng 1: Nguồn, trình tự nhận biết và vị trí cắt của một số enzyme giới hạn. (tr51) Phương pháp điện di: (electrophoresis) Phương pháp điện di là quá trình phân tách một hỗn hợp các phân tử ADN nhờ một chất nền cố định (gel) trong một điện trường. Điện di ADN: - Ở độ pH gần trung tính, ADN tích điện âm nên khi chịu tác động của điện trường chúng sẽ di chuyển về điện dương của điện trường. CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀNLỚP 2NT1 – TỔ 1 [...]... được tạo dòng LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Sự tạo ADN tái tổ hợp LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN ... có màu xám, có thể phát hiện dễ dàng LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Điện di: - Gel được đặc trên giá đỡ, cho vào hộp điện di có dung dich đệm - Dung dịch ADN được cho vào các giếng - Cho điện trường chạy qua gel LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Các đoạn ADN sau khi điện di được nhuôm ethidium bromide LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Các vector chuyển gen: Muốn chuyển... Điện di ADN - Bản gel hoạt động như một giá thể phân tách các đoạn ADN - Các lỗ được tạo ra trong bản gel được xem như các giếng chứa dung dich ADN - Hai loại gel thường được sử dụng trong nghiên cứu ADN là gel polyacrylamide và gel agarose LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Điện di ADN - Dung dịch ADN chứa hỗn hợp các đoạn ADN có kích thước khác nhau được đổ... thước đoạn ADN mà vector có thể tiếp nhận lớn hơn (20 kb) LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Các vector chuyển gen: VD: - Vector plasmid: pBR332 do Bolivar và Rodiguez (1977) thiết kế cho phép mang đoạn ADN dài đến 6 kb - Phage: M13 thường được sử dụng làm vector tách dòng nó có ADN sợi đơn chứa 10 gen, có kích thước khoảng 6.4 kb, chỉ sâm nhiễm vào E.coli LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI... 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Các vector chuyển gen có các ứng dụng chủ yếu: - Tạo dòng, nhân dòng các đoạn trình tự hoặc gen để tạo nhiều bản sao giống nhau - Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự ADN, hoặc một gen - Chuyển gen vào tế bào vi sinh vật khác ( vật chủ nhận) - Sản xuất các ARN - Sản xuất protein được tổng hợp từ gen đã được tạo dòng LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT... gel khó khăn hơn và sẽ bị chậm lại so với các phân tử AND nhỏ LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Điện di ADN Tốc độ di chuyển phụ thuộc bào kích thước của đoạn ADN, điện thế, thành phần dung dịch đệm, nồng độ của gel và nhiệt độ LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Phương pháp điện di: (electrophoresis) Các đoạn ADN trong gel sẽ được hiện hình dưới tia tử ngoại nhờ một hoá chất có... kháng sinh LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Các vector chuyển gen: Có nhiều loại vector: plasmid, thực khuẩn thể, cosmid, YAC… Loại vector được chọn sử dụng tùy thuộc vào kích thước của đoạn ADN cần tạo dòng và mục đích tạo dòng Plasmid là những đoạn ADN ngắn (2-5 kb), dạngv òng, mạch đôi, nằm ngoài NST, sao chép độc lập với sự sao chép NST của vi khuẩn Có thể nhận các ADN tạo dòng tới 10... Các vector chuyển gen: Cosmid là vector lai của plasmid và phage, mang các ưu điểm của hai vector: (1) khả năng tự tái bản số lượng lớn của plasmid, (2) có khả năng đóng gói in-vitro như phage Có khả năng mang các đoạn ADN có kích thước dài đến 35 – 45 kb LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Các vector chuyển gen: Các NST nhân tạo của nấm men (YAC- Yeast Artificiak Chromomes) Ở nấm men các... chúng sẽ phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia tử ngoại (bước sóng 260 nm), các đoạn ADN hiện hình dưới dạng những vạch màu đỏ cam Ngoài ra thì còn một phương pháp khác để hiện hình các đoạn ADN trên bản gel điện di đó là phương pháp nhuộm bạc Phương pháp nhuộm bạc: Bản gel sau điện di được ngâm vào dung dich AgNO3, ADN sẽ tương tác với AgNO3, khi bổ sung formaldehyt ở pH kiềm, ion bạc chuyển thành... DI TRUYỀN Các vector chuyển gen: Muốn chuyển được gen mong muốn từ thể cho sang thể nhận hoặc tách dòng gen, điều cơ bản là cần phải có vật chuyển gen (vector chuyển gen) Vector chuyển gen là phân tử ADN có khả năng mang được gen cần thiết, thường có dạng vòng và có một số đặc tính sau: - Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication) để tự sao chép mà tồn tại độc lập trong tế bào - Có các đoạn . Kỹ thuật tái tổ hợp ADN còn được gọi là tạo dòng phân tử (molecular cloning) CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀNLỚP 2NT1 – TỔ 1 Kỹ thuật tái tổ hợp ADN. đề KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP ADN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BẠC LIÊU KHOA NÔNG NGHIỆP - MÔN DI TRUYỀN ĐẠI CƯƠNG LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN KỸ THUẬT TÁI