Nghiên cứu tính chất Phytaza tự nhiên và tái tổ hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis

Nghiên cứu tính chất Phytaza tự nhiên và tái tổ hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis

Bộ giáo dục Và đào tạo viện khoa học và công nghệ việt nam Viện công nghệ sinh học Đỗ Thị Ngọc Huyền Nghiên cứu tính chất phytaza tự nhiên v tái tổ hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số : 62 42 40 01 Tóm tắt Luận án tiến sĩ sinh học Hà nội 2007 Công trình đợc hoàn thành tại: Viện Công nghệ sinh học. Ngời hớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thuỳ Châu PGS.TS Trơng Nam Hải Phản biện 1: GS.TS Phạm Văn Ty Trờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Phản biện 2: PGS.TS Ngô Xuân Mạnh Trờng Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội Phản biện 3: PGS.TS Ngô Tiến Hiển Viện Công nghiệp thực phẩm Luận án sẽ đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nớc họp tại Viện Công nghệ sinh học vào hồi 9 giờ ngày 31 tháng 8 năm 2007 Có thể tìm hiểu luận án tại th viện: Viện Công nghệ sinh học, Th viện Quốc gia Hà Nội 1 Mở đầu 1 Tính cấp thiết của đề tài Photpho là nguyên tố đa lợng cần thiết cho sự phát triển của ngời và vật nuôi. Nhng đa số thức ăn cho gia súc có nguồn gốc từ các hạt thực vật đặc biệt là ngũ cốc đều có chứa sẵn photpho. Tuy nhiên, photpho trong các nguyên liệu này có tới 80% nằm dới dạng phân tử phytat hoặc axit phytic (myo-inositol hexan photphat) rất khó tiêu hóa đối với các loài động vật dạ dày đơn nh gia cầm, lợn, cáDo đó, cần phải bổ sung những hợp chất chứa photpho vô cơ vào thức ăn để đáp ứng đủ nhu cầu của chúng . Lợng axit phytic và phytat không đợc tiêu hóa này theo phân của gia cầm thải ra ngoài là nguyên nhân gây ô nhiễm môi trờng. Chính vì vậy, việc sử dụng phytaza - một enzym có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân axit phytic (và các muối của axit này) giải phóng ra một hoặc nhiều gốc photphat vô cơ tự do và myo - inositol phân tử thấp, là các dạng chất dễ tiêu hóa hơn các hợp chất ban đầu là rất cần thiết. Bện cạnh việc ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi, phytaza còn đợc ứng dụng vào một số lĩnh vực khác nh thực phẩm, dợc phẩm và bảo vệ môi trờng. ở nớc ta, việc nghiên cứu công nghệ sản xuất phytaza mới bắt đầu, chủ yếu đợc triển khai tại các phòng thí nghiệm của Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, trờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh và trờng Đại học S phạm I. Các nghiên cứu này mới tập trung vào tuyển chọn, xác định tính chất của phytaza tự nhiên từ nấm mốc. Tuy nhiên cha có một công trình nào nghiên cứu về các tính chất của phytaza từ vi khuẩn B. subtilis để có đợc những hiểu biết sâu sắc về enzym này nhằm tiến tới sản xuất chế phẩm phục vụ chăn nuôi. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: Nghiên cứu tính chất phytaza tự nhiên và tái tổ hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis. 2 2 Mục tiêu của đề tài Xác định đợc tính chất của phytaza tự nhiên từ B. subtilis và phytaza tái tổ hợp nhằm sản xuất phytaza ứng dụng trong chăn nuôi và một số lĩnh vực khác. 3 Nội dung nghiên cứu 9 Phân lập và tuyển chọn các chủng B. subtilis sinh phytaza cao từ một số nguồn đất và phân động vật nhằm thu đợc phytaza có tính chịu nhiệt. 9 Nghiên cứu thu nhận và xác định tính chất phytaza tự nhiên từ chủng B. subtilis. 9 Phân lập gen phyC mã hóa cho phytaza từ B. subtilis làm tiền đề cho việc biểu hiện chúng trong các hệ biểu hiện khác nhau. 9 Thiết kế và biểu hiện gen phyC trong vi khuẩn E. coli để thu nhận và xác định tính chất của PhyC tái tổ hợp. 4 Những đóng góp mới của luận án Bản luận án này có những đóng góp mới về khoa học và thực tiễn nh sau: 9 Xác định đợc các đặc điểm sinh học và đã phân loại đến loài chủng vi khuẩn phân lập từ đất và phân động vật ở Việt Nam có khả năng sinh phytaza cao. 9 Đã tạo dòng và xác định trình tự gen phyC mã hóa phytaza của vi khuẩn B. subtilis. Đây là gen mã hóa phytaza đầu tiên đợc phân lập và xác định trình tự từ vi khuẩn B. subtilis đợc phân lập ở Việt Nam. Trình tự của gen này đã đợc đăng ký trong Ngân hàng trình tự gen Quốc tế. 9 Lần đầu tiên trong điều kiện Việt Nam đã biểu hiện thành công gen phyC mã hóa phytaza từ B. subtilis trong vi khuẩn Escherichia coli. 9 Đã làm sáng tỏ đợc một số tính chất của phytaza tự nhiên từ chủng B. subtilis và PhyC tái tổ hợp, từ đó giúp cho các cơ sở sản xuất ứng dụng phytaza của B. subtilis một cách đúng đắn trong chăn nuôi. 3 5 Bố cục của luận án Luận án gồm 137 trang, 16 bảng và 28 hình; Mở đầu (2 trang); Chơng 1. Tổng quan tài liệu (34 trang); Chơng 2. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu (16 trang); chơng 3. Kết quả và bàn luận (58 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Tài liệu tham khảo (9 tài liệu tiếng Việt; 149 tài liệu tiếng Anh); Phụ lục (4 trang). Chơng 1- Tổng quan ti liệu 1.1 Những nghiên cứu về axit phytic Axit phytic là một axit hữu cơ, phân tử của nó có chứa các gốc photphat, tồn tại chủ yếu trong các loại ngũ cốc và hạt có dầu và chúng đợc xem nh là kho dự trữ photpho lớn trong các hạt thực vật (Lolas et al 1997) Một đặc tính bất lợi nhất của axit phytic đối với cơ thể động vật là hiệu ứng kháng dinh dỡng Pallauf và Rimbach (1996). Hiệu ứng này tạo nên do cấu trúc bất thờng của axit phytic. Khi phân tử axit phytic ở dạng phân ly hoàn toàn, 6 nhóm photphat của chúng sẽ mang tổng điện tích âm 12. Vì vậy, chúng có nhiều khả năng kết hợp với các ion dơng hóa trị 1, 2, 3 hoặc hỗn hợp của các ion đó, hình thành nên các hợp chất không hoà tan, rất khó tiêu hóa. Sự hình thành các hợp chất vô cơ không tan trong đờng ruột đã ngăn cản sự hấp thụ các khoáng chất của cơ thể động vật. Axit phytic khi kết hợp với các ion kim loại nh Fe 3+ , Mg 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ sẽ ngăn cản khả năng kết hợp của các ion kim loại này với các axit béo không no làm giảm khả năng tiêu hóa thức ăn của động vật và giảm giá trị dinh dỡng của nguồn thức ăn (Lei et al., 1993). Ngoài ra, axit phytic còn tác động đến một số enzym nh tripsin, pepsin, - amylaza, -galactosidaza và kết quả là làm giảm hoạt tính của các enzym tiêu hóa quan trọng này (Inagawa et al., 1987). 1.2 Những nghiên cứu về phytaza Phytaza là một enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic thành các myo - inositol photphat phân tử thấp và các monophotphat vô 4 cơ. Khi phản ứng thủy phân xảy ra hoàn toàn sẽ giải phóng toàn bộ các gốc photphat trong phân tử axit phytic và tạo thành các myo - inositol tự do. Phytaza có tên gọi đầy đủ, theo quy ớc quốc tế là: myo - inositol hexan photphat photphohydrolaza. Mullaney và Ullah (2003) đã chia phytaza thành 3 nhóm dựa trên cơ sở cấu trúc và các đặc tính xúc tác khác nhau của nó, bao gồm các nhóm photphataza axit histidin (HAP), photphataza axit tía (PAP), phytaza -propeller (BPP). Phytaza thuộc nhóm HAP thờng có mặt ở nấm mốc, E. coli, ở một số loài thực vật và chuột. Chúng cùng có một trình tự hoạt động bảo thủ là RHGXRXP, đồng nhất đối với các enzym thuộc nhóm này. Phytaza thuộc nhóm PAP đợc biết là metalophotphoesteraza, có mặt chủ yếu ở rễ thực vật để giúp cho thực vật lấy đợc nguồn photpho trong đất, đáp ứng lại một cách bình thờng đối với tình trạng thiếu photpho. Phytaza thuộc nhóm BPP chỉ có ở vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Chúng có tính đặc hiệu cơ chất nhất, bền nhiệt và chỉ hoạt động ở pH trung tính (Kerovuo et al., 2000, Oh et al., 2001,Tye et al., 2002). Chơng 2 - vật liệu v phơng pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu 226 mẫu đất và phân động vật lấy từ các cánh đồng trồng ngô, lúa và khu chăn nuôi tại một số tỉnh miền Bắc. Chủng E. coli DH5, chủng E. coli BL21, vectơ tách dòng pCR2.1, vectơ biểu hiện pET22b(+). Các hóa chất sử dụng đều có độ tinh sạch (PA) và đợc mua từ các hãng có uy tín nh: Merck, In vitrogen, Sigma 2.3 Các phơng pháp nghiên cứu: Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh phytaza theo phơng pháp của Shimizu (1992) có cải tiến; Định loại vi khuẩn sinh phytaza dựa vào các đặc điểm hình thái và tính chất sinh lý, sinh hóa theo Bergey (1986). Nhân bản và xác định trình tự gen ARN 16S của chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng kỹ thuật sinh học phân tử theo (Weisburg et al, 1991). Xác định hoạt độ phytaza theo phơng pháp của Shimizu (1992). Tối u hoá sinh tổnghợp phytaza bằng phơng pháp quy hoạch thực nghiệm. Xác 5 định sinh khối protein theo (Vats et al., 2004). Xác định hàm lợng protein theo phơng pháp của Bradfort (1976). Nhân bản, xác định trình tự gen phyC và biểu hiện gen theo phơng pháp (Sambrook et al, 2001). Xác định tính chất của phytaza theo phơng pháp của Shimizu (1992). Chơng 3 - Kết quả v bn luận 3.1 Phân lập và định loại vi khuẩn sinh phytaza 3.1.1 Phân lập vi khuẩn sinh phytaza ngoại bào Từ 226 mẫu đất và phân động vật lấy ở một số địa điểm khác nhau, chúng tôi đã phân lập đợc 27 chủng vi khuẩn có khả năng sinh phytaza và có hình thái khuẩn lạc giống chi Bacillus. Trong đó, số chủng vi khuẩn có khả năng sinh phytaza ở các mẫu đất gần khu chăn nuôi gia cầm là lớn nhất, tiếp theo là mẫu đất trồng lúa. Các mẫu lấy từ đất gần chuồng trâu bò và phân của gia cầm có số lợng chủng vi khuẩn sinh phytaza phân lập đợc là thấp nhất. Điều này có thể lý giải rằng các động vật dạ dày đơn nh lợn, gia cầm đã không chuyển hóa hết đợc lợng axit phytic có trong thức ăn, chính lợng axit phytic thừa này theo phân của chúng thải ra ngoài môi trờng làm chất cảm ứng cho sinh tổng hợp phytaza. Nhng cũng chính nồng độ axit phytic quá cao trong phân gia cầm cùng một số chất ức chế khác có thể là nguyên nhân khiến cho số lợng vi khuẩn sinh phytaza phân lập từ nguồn này là thấp nhất. Theo một số tác giả đã công bố, hầu hết các chủng vi khuẩn có khả năng sinh phytaza ngoại bào mạnh đều đợc phân lập từ các mẫu đất trồng lúa, từ các sản phẩm đậu tơng lên men truyền thống và đất gần khu chăn nuôi [Kim et al., 1998, Powar và Jagannathan (1982), Shimizu (1992)]. Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi khi phân lập đợc các chủng chủ yếu ở đất gần khu chăn nuôi gia cầm là hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu nêu trên. 3.1.2 Sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh phytaza cao Để có thể dễ dàng tuyển chọn đợc chủng vi khuẩn sinh phytaza cao, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc định tính dựa vào vòng phân giải canxi phytat trên thạch đĩa. Kết quả chúng tôi đã thu đợc 4 chủng với 6 đờng kính vòng thủy phân nhỏ hơn 0,5 cm, 7 chủng có đờng kính vòng thủy phân lớn hơn 0,5 cm và 1 chủng có đờng kính vòng thủy phân lớn hơn 1 cm. Hoạt độ phytaza của các chủng vi khuẩn đợc xác định theo phơng pháp của Shimizu (1992). Kết quả 2 chủng B1 và B178 cho hoạt độ phytaza cao hơn các chủng khác. Hoạt độ phytaza do chủng B1 sinh ra là 0,135 U/ml và chủng B178 đạt 0,115 U/ml. Trong đó chủng B1 đợc phân lập từ đất trồng lúa và chủng B178 thu đợc từ đất gần khu chăn nuôi gia cầm. 3.1.3 Đặc điểm sinh học và phân loại của vi khuẩn sinh phytaza Sau khi quan sát hình thái khuẩn lạc và các phản ứng sinh lý, sinh hóa của 7 chủng vi khuẩn phân lập dựa theo khóa phân loại của Bergey (1986), chúng tôi nhận thấy chủng vi khuẩn B1 có các đặc điểm hình thái và sinh lý, sinh hóa giống với đặc điểm của loài B. subtilis. Để khẳng định chắc chắn chủng B1 trên là B. subtilis, chúng tôi cũng đã xác định một đoạn gen mã hóa ARNr 16S của chủng này. Kết quả gen ARNr 16S của chủng B1 có độ tơng đồng về nucleotit đến 99,37% so với 4 chủng B. subtilis đã công bố, trong đó có chủng vi khuẩn B. subtilis 168- chủng chuẩn. Từ những kết quả trên chúng tôi khẳng định chủng B1 chính xác là loài B. subtilis. 3.2 Nghiên cứu thu nhận phytaza từ chủng B. subtilis B1 3.2.1 ảnh hởng của các yếu tố môi trờng và tỷ lệ giống Để có thể thu nhận đợc một lợng lớn phytaza phục vụ cho xác định tính chất và làm tiền đề cho sản xuất phytaza sau này, chúng tôi đã nghiên cứu một số yếu tố ảnh hởng đến quá trình sinh tổng hợp phytaza từ chủng vi khuẩn B. subtilis B1 nh nguồn cacbon, nitơ và tỷ lệ giống đa vào lên men. Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn B. subtilis B1 có thể sử dụng một số phế phụ phẩm nông nghiệp làm nguồn cacbon để sinh tổng hợp phytaza. ở môi trờng có chứa cám gạo, hoạt độ phytaza đợc tạo ra đạt 0,101 U/ml. Ngoài ra, khi khảo sát ảnh hởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp phytaza, chúng tôi nhận thấy hoạt độ phytaza thu đợc cao nhất (1,34 U/ml) khi nuôi cấy chủng B. subtilis B1 trong môi trờng chứa NH 4 NO 3 và cazein với nồng độ 0,4 và 10 g/l. Điều này cũng phù hợp 7 với kết quả nghiên cứu của (Kerovue et al. 1998) khi lên men sản xuất phytaza từ chủng B. subtilis VTTE-68013, Powar và Jagannathan khi nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp phytaza từ chủng B. subtilis 2712. Bên cạnh các thành phần dinh dỡng ảnh hởng đến khả năng sinh tổng hợp của phytaza thì tỷ lệ giống và chất lợng giống cũng là một yếu tố quan trọng cho sản xuất enzym này. Lợng giống thích hợp để thu nhận phytaza là 7,5%. 3.2.2 Tối u hóa quá trình sinh tổng hợp phytaza Mục đích của quá trình này là tìm đợc các yếu tố ảnh hởng nhiều nhất đến sinh tổng hợp phytaza mà tại đó quá trình sinh tổng hợp đạt cao nhất. Kết quả tối u hóa môi trờng sinh tổng hợp phytaza từ chủng B. subtilis B1 cho thấy hoạt độ phytaza đạt cao nhất là 0,147 U/ml khi nuôi cấy trên môi trờng có chứa cám gạo với lợng 90 g/l và nồng độ cazein là 11 g/l. Nhng khi so sánh với hoạt độ phytaza tạo ra trong môi trờng có chứa cám gạo với lợng 80 g/l, nồng độ cazein là 9 g/l (0,135 U/ml) đã cho thấy mặc dù sử dụng nhiều cazein hơn khoảng 22% mà hoạt độ phytaza tăng lên không đáng kể, chỉ khoảng 8,8%. Do vậy, chúng tôi chọn môi trờng tối u cho sinh tổng hợp phytaza từ chủng B. subtilis B1 có thành phần nh sau (g/l): Cám gạo 80; cazein 9; CaCl 2, 2; KH 2 PO 4 0,5; K 2 HPO 4 0,4; NH 4 NO 3 0,4; MgSO 4 .7H 2 O 0,2. Lợng giống đa vào lên men thích hợp nhất là 8,5%. 3.2.3 Động học của quá trình sinh tổng hợp phytaza từ chủng B. subtilis B1 Chủng B. subtilis B1 đợc nuôi cấy trên môi trờng tối u và trong quá trình lên men, mẫu đợc lấy 8 giờ một lần, bắt đầu từ giờ thứ 6 để xác định hoạt độ phytaza. Kết quả cho thấy ở các giờ đầu tiên sinh khối của chủng B. subtilis B1 tăng chậm, nhng từ giờ thứ 26 trở đi sinh khối của chúng tăng mạnh và đạt cực đại ở giờ thứ 50. Sự sinh tổng hợp phytaza cũng tăng dần từ giờ thứ 6 và đạt cao nhất ở giờ lên men thứ 74 (0,136 U/ml). Sau đó hoạt độ phytaza đợc sinh ra lại giảm khi thời gian lên men vợt quá 74 giờ. 8 Chúng tôi cho rằng ở giai đoạn này lợng chất cảm ứng là axit phytic trong môi trờng đã cạn kiệt, bên cạnh đó ở thời điểm này sự sinh trởng của tế bào đã bắt đầu chững lại cho nên đã làm giảm hoạt độ phytaza trong dịch lên men. 3.2.4 Xác định khối lợng phân tử và hàm lợng phytaza của chủng B. subtilis B1 Chúng tôi tiến hành điện di SDS-PAGE và thử hoạt tính phytaza bằng phơng pháp điện di không biến tính NATIVE-PAGE. Dịch enzym thô từ môi trờng không đợc xử lý biến tính để chạy điện di. Sau khi điện di, phần gel dùng để thử hoạt tính đợc rửa lại bằng nớc, đệm v đợc ép lên môi trờng thạch có chứa cơ chất của phytaza để quan sát xem băng nào có hoạt tính. Việc xuất hiện vòng trong mờ trên nền thạch có bổ sung cơ chất chứng tỏ rằng băng tơng ứng là phytaza. Kết quả ở đờng chạy 3 trên hình 3.7 cho thấy xuất hiện một băng duy nhất có hoạt tính phytaza với khối lợng khoảng 43 kDa. Khối lợng này tơng đơng với khối lợng của phytaza đợc tách ra từ chủng B. subtilis VTTE-68013 (Kerovuo et al., 1998). Trong khi đó phytaza ngoại bào từ chủng B. subtilis (natto) N-77 đợc thông báo có khối lợng là 36 kDa, Shimizu (1992). Khối lợng của phytaza ngoại bào của chủng Bacillus sp. DS11 là 45 kDa (Kim et al ., 1998). Hình 3.7. SDS - PAGE và NATIVE - PAGE phytaza từ chủng B. subtilis B1 SDS - PAGE Đờng chạy 1. Protein chuẩn; 2. Dịch phytaza thô; NATIVE - PAGE 3. Băng hoạt tính của phytaza 1 2 3 kDa 116 66 45 35 25 18,4 14,4 PhyC [...]... để xác định các tính chất của enzym 3.7.2 Xác định tính chất của PhyC tái tổ hợp ảnh hởng của pH đến hoạt độ và độ bền của PhyC tái tổ hợp Nhìn chung, PhyC tái tổ hợp có khả năng hoạt động mạnh trong khoảng pH từ 5,5-7 và enzym này hoạt động tối u ở pH 6,5 và khá bền trong khoảng pH từ 5,5-6,5 Chính vì PhyC tái tổ hợp hoạt động tốt ở pH 20 5,5-7 cho nên enzym này thích hợp để bổ sung vào thức ăn cho... độ tơng đối (%) 120 20 Độ bền phytaza 0 0 30 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Hình 3.28 ảnh hởng của nhiệt độ đến hoạt độ và độ bền của PhyC tái tổ hợp 21 ảnh hởng của các ion kim loại và chất khử đến PhyC tái tổ hợp ảnh hởng của ion kim loại và chất khử đến hoạt độ PhyC tái tổ hợp đợc kiểm tra bằng cách sử dụng natri phytat làm cơ chất Bảng 3.12 ảnh hởng của ion kim loại và chất khử đến hoạt độ PhyC Ion... giữa phytaza của nấm mốc với phytaza của vi khuẩn sẽ giải quyết đợc vấn đề trên Động học enzym Giống nh hầu hết các phytaza của Bacillus, PhyC tái tổ hợp trong luận án này cũng tuân theo phơng trình của Michaelis-Menten Giá trị Km, Vmax của PhyC tái tổ hợp đợc xác định là 0,48 mM và 180 mol/phút Trong khi đó giá trị Km của phytaza đối với natri phytat của Bacillus sp DS11 là 0,55 mM và B subtilis natto... (nơi phytaza của vi khuẩn không hoạt động đợc) cũng nh pH ở ruột non (nơi phytaza của nấm mốc bị mất hoạt tính) 23 Kết luận 1 Đã phân lập đợc 27 chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp phytaza cao từ đất và phân động vật lấy tại một số tỉnh miền Bắc Vi t Nam Dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý hóa học và phơng pháp xác định trình tự ARNr 16S đã khẳng định chủng vi khuẩn B1 có khả năng sinh tổng hợp phytaza. .. 3.6.1 Kiểm tra tính tan của PhyC tái tổ hợp Hầu hết các enzym chỉ thể hiện hoạt tính của mình khi ở dạng tan Tuy nhiên, các enzym nói chung và phytaza nói riêng đợc tổng hợp bởi hệ biểu hiện E coli thờng tồn tại một số vấn đề nh không tạo cấu trúc đúng nh trong tự nhiên và các protein đợc biểu hiện cao thờng ở dạng không tan Chính vì vậy vi c tiến hành kiểm tra tính tan của PhyC tái tổ hợp là cần thiết... (1992) Nhìn chung, các tính chất của PhyC tái tổ hợp rất thích hợp dùng trong vi c sản xuất chế phẩm đa enzym để bổ sung vào thức ăn cho động vật dạ dày đơn nhằm làm tăng khả năng hấp thụ photpho và muối khoáng sẵn có trong thức ăn của chúng Vi c sử dụng kết hợp giữa phytaza của nấm mốc với phytaza của vi khuẩn đã giải quyết đợc vấn đề phytaza bị bất hoạt bởi enzym đờng tiêu hóa và chúng có thể hoạt... XP 22 ảnh hởng của tripsin và pepsin đến PhyC tái tổ hợp PhyC tái tổ hợp không bị tác động bởi tripsin bởi vì khi ủ enzym này với tripsin trong 1 giờ, hoạt độ PhyC tái tổ hợp vẫn còn lại là 100% Trong khi đó, PhyC tái tổ hợp lại mẫn cảm với pepsin vì hoạt độ PhyC còn lại sau khi xử lý với pepsin chỉ còn 23% Trong khi đó, Papp phytaza tái tổ hợp đợc sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Pseudomonas putida thì... bởi vì diều của gia cầm có pH từ 6-7 100 80 80 60 60 40 40 Hoạt độ phytaza 20 Hoạt độ còn lại (%) 120 100 Hoạt độ tơng đối (%) 120 20 Độ bền phytaza 0 0 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 pH Hình 3.27 ảnh hởng của pH đến hoạt độ và độ bền của PhyC tái tổ hợp ảnh hởng của nhiệt độ và độ bền nhiệt đến hoạt độ của PhyC tái tổ hợp Bên cạnh vi c xác định ảnh hởng của pH đến hoạt độ PhyC tái tổ hợp, chúng... thấy rằng phytaza từ B subtilis B1 là enzym một cấu tử Kết luận này phù hợp với kết quả nghiên cứu về phytaza từ chi Bacillus đã đợc một số tác giả công bố Lợng phytaza tự nhiên thu đợc sau khi lên men chủng B subtilis B1 trên môi trờng tối u có hàm lợng đạt xấp xỉ 6 mg/lít 3.3 Nghiên cứu tách chiết phytaza từ dịch lên men Với mục đích nghiên cứu thu nhận phytaza thô để xác định tính chất và làm tiền... nhất là vi khuẩn B subtilis 2 Đã khảo sát và tối u hóa đợc điều kiện nuôi cấy cho sinh tổng hợp phytaza của chủng B subtilis B1, hàm lợng phytaza đạt 6 mg/l Phytaza thô từ chủng B subtilis B1 có nhiệt độ tối u là 50oC, pH tối u là 6,5, bền với tripsin và bị bất hoạt bởi pepsin 3 Đã phân lập, tạo dòng và xác định trình tự nucleotit gen phyC mã hóa cho phytaza từ chủng vi khuẩn B subtilis B1 ở Vi t Nam . tài: Nghiên cứu tính chất phytaza tự nhiên và tái tổ hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis. 2 2 Mục tiêu của đề tài Xác định đợc tính chất của phytaza tự nhiên từ B. subtilis và phytaza tái. dục Và đào tạo vi n khoa học và công nghệ vi t nam Vi n công nghệ sinh học Đỗ Thị Ngọc Huyền Nghiên cứu tính chất phytaza tự nhiên v tái tổ hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis. và trờng Đại học S phạm I. Các nghiên cứu này mới tập trung vào tuyển chọn, xác định tính chất của phytaza tự nhiên từ nấm mốc. Tuy nhiên cha có một công trình nào nghiên cứu về các tính chất