kĩ thuật tái tổ hợp dna

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM  BỘ MÔN : SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG ĐỀ TÀI : Lớp : ĐHTP4 GVHD : ThS Trần Đức Việt Sinh viên thực hiện : 1. 08243421 Bùi Thị Bích Hằng 2. 08104521 Nguyễn Thị Thu Hằng 3. 08212521 Nguyễn Bảo Khuyên 4. 08108721 Đỗ Trọng Lam 5. 08234201 Nguyễn Mỹ Linh 6. 08105241 Nguyễn Thị Thuỳ Linh Niên khoá : 2008-2012 T.P Hồ Chí Minh, 11/2009 PHẦN MỞ ĐẦU ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ Công nghệ tái tổ hợp DNA còn gọi là công nghệ di truyền - là sự kết hợp của sinh học phân tử và di truyền học - ra đời vào những năm đầu của thập niên 70 trong thế kỷ 20. Phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên được nhóm các nhà nghiên cứu Mỹ là Berg, Boyer và Cohen tạo ra năm 1972 Sau đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và tiến hành các thí nghiệm lắp ghép gen và đã thu được nhiều kết quả ứng dụng được trong thực tiễn. Kỹ thuật tái tổ hợp DNA ngày càng có nhiều ảnh hưởng đến nông nghiệp, công nghệ thực phẩm, y dược, bảo vệ môi trường, như: sản xuất thuốc kháng sinh, vác xin, kháng thể đơn dòng và các protein có hoạt tính sinh học dùng để chữa bệnh như insulin chữa bệnh tiểu đường, interferon chữa bệnh ung thư, các hormon tăng trưởng cho con người. Xác định vị trí của các gen mã hóa cho các tính trạng mong muốn, giúp cho việc lai tạo, chọn giống cũng như tạo ra các sinh vật chuyển gen nhanh và hiệu quả cao, Trong công nghệ thực phẩm, công nghệ tái tổ hợp DNA đóng một vai trò quan trọng trong việc tạo ra các vi sinh vật chuyển gen mang các tính trạng mong muốn nhằm tạo ra năng suất và chất lượng cao cho sản phẩm. Ví dụ: o Trong sản xuất rượu, ngày nay người ta đã dùng các chủng vi sinh vật có khả năng tạo rượu cao và cho hương vị tốt. Phần lớn các chủng đó được nghiên cứu, tuyển chọn, lai tạo bằng kĩ thuật tái tổ hợp DNA o Đối với các sản phẩm lên men sữa như phomat và sữa chua, trước kia, người ta thường sử dụng những vi sinh vật tự nhiên để lên men nên khó kiểm soát quá trình lên men và hiệu quả không cao. Ngày nay, với kĩ thuật tái tổ hợp DNA, người ta đã tạo được các chủng mới với các tính chất xác định và đã điều khiển được quá trình lên men theo định hướng mong muốn. 2 o Trong những năm gần đây, bằng cách sử dụng kĩ thuật tái tổ hợp, người ta đã tuyển chọn và tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme chịu nhiệt, chịu axit, chịu kiềm tốt để sản xuất enzyme. Enzyme λ - amylase chịu nhiệt đã và đang được sử dụng nhiều để sản xuất nha, đường glucose từ tinh bột Chính vì vậy nhóm chúng tôi đã quyết định chọn đề tài tiểu luận môn Sinh học đại cương là “Kĩ thuật tái tổ hợp DNA” để tìm hiểu rõ hơn và nắm vững phương pháp tiến hành của kĩ thuật này. Tiểu luận được thực hiện dựa trên việc tìm kiếm và tổng hợp các tài liệu. Đối tượng nghiên cứu chủ yếu là vi khuẩn 3 PHẦN NỘI DUNG ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 1. Nguyên lí cơ bản của kĩ thuật tái tổ hợp DNA Công nghệ di truyền sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để tách DNA từ một cơ thể sống và sau đó cắt, nối các gen trên DNA. Bằng cách như vậy, người ta có thể loại bỏ các gen không mong muốn và đưa vào các gen mới đặc hiệu theo chủ ý lựa chọn. Các thao tác cắt, nối trên DNA được thực hiện bên ngoài cơ thể sống trong các ống nghiệm (in vitro). Phân tử DNA mới được tạo dựng sau các thao tác cắt, nối có một số đặc điểm khác với phân tử DNA ban đầu được tách ra từ tế bào sống, được gọi là DNA tái tổ hợp và kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật tái tổ hợp DNA. Sự tái tổ hợp DNA được xem là thành công chỉ sau khi đưa được phân tử DNA tái tổ hợp vào trong tế bào sống và chúng biểu hiện các hoạt tính di truyền và ở thế hệ con cháu sẽ mang phân tử DNA tái tổ hợp Kỹ thuật tái tổ hợp DNA được thực hiện qua nhiều bước: - Bước 1 : Nuôi tế bào cho plasmid để có vector chuyển gen và nuôi tế bào cung cấp gen cần chuyển - Bước 2 : Tách chiết DNA plasmid và DNA tế bào cho - Bước 3 : Phân lập hai loại DNA bằng cùng một loại enzym giới hạn - Bước 4 : Trộn chung hai loại DNA đã bị cắt - Bước 5 : Bổ sung enzym nối ligase để tạo ra ADN tái tổ hợp hoàn chỉnh. - Bước 6 : Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng. - Bước 7 : Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ mang ADN tái tổ hợp và theo dõi hoạt động, biểu hiện của gen thông qua sản phẩm của gen lấy từ tế bào cho. 4 Hình: Các bước tạo DNA tái tổ hợp 1,2: Cắt DNA của tế bào cho và plasmid bằng cùng một loại enzyme giới hạn 3 : Đưa DNA tái tổ hợp vào trong tế bào nhận 4 : Nhân dòng 2. Các enzyme sử dụng trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA 2.1 Enzyme giới hạn RE (Restriction Enzyme) Trong công nghệ di truyền muốn tạo ra ADN tái tổ hợp để đưa vào tế bào chủ cần phải có công cụ cắt plasmid hình vòng và đoạn ADN của tế bào rồi cho chúng nối lại với nhau. Công cụ cắt ADN là các enzym giới hạn 5 2.1.1 Khái niệm về enzym giới hạn Thông thường tế bào vi khuẩn bị nhiễm phage (thể thực khuẩn) thì vi khuẩn đó bị phage phá huỷ. Một số chủng vi khuẩn sau khi bị nhiễm phage lại không bị phá huỷ, do trong tế bào vi khuẩn này có loại enzym có khả năng cắt DNA phage thành những đoạn nhỏ. Năm 1970, Hamilton Smith là người đầu tiên tách được loại enzym này từ loại vi khuẩn Haemiphilus influenzae được gọi tên là HinII. Ngay sau đó, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng, phần lớn các loài vi khuẩn mang loại enzym có chức năng cắt DNA lạ xâm nhập để bảo vệ tế bào khỏi bị xâm nhập của các DNA lạ. Những enzym đó được gọi là enzym giới hạn. Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA nhất định và cắt DNA ở ngay điểm này hay ở điểm kế cận. Tuỳ theo phương thức cắt và nguồi gốc của enzym giới hạn mà người ta phân loại và đặt tên cho các enzym giới hạn đó 2.1.2 Phân loại enzym giới hạn Các enzym giới hạn được phân thành 3 loại: I, II và III. Các enzym giới hạn được dùng phổ biến trong công nghệ DNA tái tổ hợp thuộc kiểu II. Bao gồm những enzyme có trình tự nhận biết chuỗi nucleotide đặc hiệu. Khi nhận biết được trình tự đó, chúng cắt ngay tại vị trí nhận biết. Các enzym này cắt bên trong mạch DNA (không phân huỷ từ 2 đầu của DNA) nên còn được gọi là enzym endonuclease. Enzym giới hạn kiểu II thực chất là endonuclease giới hạn kiểu II. Các enzym giới hạn kiểu II: Cách gọi tên các enzym giới hạn kiểu II cũng như các enzym giới hạn khác dựa trên quy ước chung. Tên enzym giới hạn được ghép bởi chữ cái đẩu tiên là tên chi và hai chữ tiếp theo là hai chữ cái tên loài của vi sinh vật mà enzym được tách chiết. Nhưng chữ và số La mã tiếp theo là tên của chủng và dòng của loài sinh vật cụ thể đã tách chiết enzym: Ví dụ: E.coRI (thuộc chi Escherichia, loài coli, chủng Ry 13) Một số loại khác như E.coRV, BamHI, HaeIII, Smal, … 6 2.1.3 Tính đặc hiệu vị trí - Trình tự nhận biết của RE: Đặc trưng quan trọng nhất của các trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc đối xứng nghịch đảo (palindromic), nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng được đọc theo chiều 5’ đến 3’ ở mỗi sợi đơn. Các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn được cấu tạo từ 4 đến 6 đôi base. Ví dụ như đoạn DNA được đóng khung sau: - Các kiểu cắt của RE: Cắt đầu bằng: Một số RE tạo vết cắt trên phân tử DNA ngay chính giữa palindrom, tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng. Sau khi cắt, hai đầu không có khả năng tự kết hợp trở lại. Ví dụ: Cắt đầu dính (đầu lệch): Cắt bên này và bên kia của tâm đối xứng để tạo ra hai đầu lệch nhau một vài base. Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bị bắt cặp trở lại.Ví dụ: 7 2.2 Nuclease Các enzym nuclease phân hủy các axit nucleic bằng cách làm đứt các liên kết phosphodieste là liên kết nối các nucleotit cùng một mạch với nhau. Các nuclease có khả năng phân cắt phân tử DNA hoặc RNA. Có ba kiểu phân loại các nuclease: 1 - Dựa vào bản chất của cơ chất mà nó tác dụng, người ta chia nuclease làm 2 loại: - Deoxyribonuclease (DNase), cơ chất của nó là DNA - Ribonuclease (RNase), cơ chất của nó là RNA 2 - Dựa theo kiểu liên kết mà enzyme thủy phân, người ta cũng chia ra làm hai loại: - Nuclease "a": Thuỷ phân đặc hiệu liên kết phosphodiester giữa cacbon (C3’) và nhóm phosphate. - Nuclease "b": Thuỷ phân đặc hiệu liên kết phosphoester giữa cacbon (C5’) và nhóm phosphate Hình: Phân loại nuclease theo liên kết bị cắt 8 3 - Dựa theo hoạt tính enzyme, người ta cũng chia ra làm hai loại exonuclease và endonuclease: - Exonuclease: Cắt các liên kết phosphoester từ hai đầu của chuỗi polynucleotide và từ đó cắt dần từng nucleotide, chúng đòi hỏi là phải có nhóm OH (3’) hoặc OH (5’) tự do ở hai đầu chuỗi. - Endonuclease: Thường thuỷ phân liên kết phosphoester ở vị trí bất kỳ bên trong chuỗi và tạo ra các oligonucleotide. Các loại nuclease chủ yếu: - Enzym ADNase I (endonuclease) tách chiết từ tụy của bò, xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết ngay sau một bazo nito ở cả mạch đơn và mạch kép hoàn toàn ngẫu nhiên. - Enzym S1 nuclease (endonuclease) là enzym tách chiết từ nấm mốc Aspegillus oryzae. S1 nuclease BAL 3 (endonuclease) phân cắt cả 2 đầu 5’ và 3’ của ADN và không có khả năng cắt nội liên kết. - Enzym exonuclease III là một 3’ exonuclease cắt đầu 3’ của mạch đơn và tạo thành các đoạn ADN có đầu 5’ nhô ra. - Enzym ARNase tách chiết từ tụy bò. Enzym này thường được sử dụng để loại bỏ ARN trong hỗn hợp ADN và ARN. - Enzym ARNase H dùng để loại bỏ ARN trong các phân tử lai ADN-ARN, nhất là sau phản ứng phiên mã ngược để hình thành mạch thứ hai của cADN, từ đó tạo nên phân tử cADN kép. 9 2.3 Enzyme nối 2.3.1. Ligase Để kết nối hoặc hàn hai mảnh DNA hoặc RNA người ta phải sử dụng enzyme ligase trong sự có mặt của ATP. Khi đó tạo ra một liên kết ester giữa một mảnh chứa 5’ −phosphat và một mảnh chứa 3’−OH => liên kết phosphodiester. Chúng thường được sử dụng kết hợp với enzyme khác như kinase và alkaline phosphatase. Thông thường, chắp hai mảnh đầu dính dễ hơn hai mảnh có đầu phẳng. Có 3 loại enzym nối thường dùng trong công nghệ di truyền: - Enzym E.coli ADN ligase được tách chiết từ vi khuẩn E.coli, xúc tác phản ứng nối hai đoạn trình tự ADN có đầu sole. - Enzym T 4 ADN ligase được tách chiết từ phage T 4 xâm nhiễm vào E.coli, có chức năng giống như E.coli ADN ligase nhưng lại có khả năng nối hai đoạn trình tự ADN có đầu bằng và là enzym nối được ưa chuộng nhất hiện nay. - Enzym T 4 ARN ligase tách chiết từ phage T 4 xâm nhiễm E.coli, có khả năng nối hai trình tự ARN bằng các liên kết phosphodiester. Ngoài các loại enzym nối kể trên, hiện nay người ta còn sử dụng các đoạn nối (đầu dính–adaptor) cho các enzym cắt đầu bằng. Adaptor xúc tác nối các đoạn ADN do có các enzym giới hạn cắt đầu bằng từ đó tạo nên đầu so le. Mỗi đoạn enzym cắt đầu bằng đều có các loại adaptor đặc trưng riêng. 2.3.2. Các enzyme dephosphoryl hoá ( khử nhóm PO4-3 ) Alkaline phosphatase: Được trích ly từ E. Coli hay từ ruột bê. Đặc tính của enzyme này là hoạt động ở pH kiềm và có khả năng xúc tác khử nhóm phosphate 5’ của một chuỗi DNA hoặc RNA và các nucleotide tự do. Alkaline phosphatase được ứng dụng để: - Loại bỏ nhóm phosphate 5’ trên trình tự DNA hoặc RNA trước khi đánh dấu phóng xạ 5’ của chúng bằng P32 làm mẫu dò phân tử lai. - Loại bỏ nhóm phosphate 5’ trên một vector vừa mới bị cắt bởi enzyme RE. Nhằm tránh vector này đóng kín trở lại, khiến cho việc cài mảnh DNA ngoại lai vào bị cản trở. Trong trường hợp này, sợi kép được cài vào có mang hai nhóm phosphat ở 5’ sẽ tạo ra hai trong bốn liên kết este để hình thành một DNA tái tổ hợp kép vòng kín có chứa hai khe hở. 10 [...]... được cài mảnh DNA lạ để tạo ra DNA tái tổ hợp Các DNA lạ này được gọi là đoạn cài hay DNA ngoại lai Nó chính là 23 một mảnh (đoạn) DNA hay là gen mà người nghiên cứu quan tâm và ghép nó vào DNA của plasmid hay DNA của virus Hình: Mô hình biểu diễn sự tạo ra DNA tái tổ hợp 5.1.2 Công đoạn chính tạo DNA tái tổ hợp Năm 1973, Staley Cohen và Annie Chang đã tạo ra những phân tử DNA tái tổ hợp từ các loài... lạc từ trắng sang đỏ) khi có mặt của DNA lạ Đây là dấu hiệu về sự hiện diện của YAC tái tổ hợp trong tế bào nấm men Các nhiễm sắc thể này được đưa vào tế bào chủ (nấm men), nó được nhân lên như NST khác ở trong tế bào nấm men và ta có được những gen mong muốn 22 5 Các bước tiến hành trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA 5.1 Tạo DNA tái tổ hợp 5.1.1 DNA tái tổ hợp là gì? DNA gồm 3 thành phần chính: base nitơ... plasmid tái tổ hợp có hai chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamHI Ưu điểm của phương pháp là ghép DNA lạ đầu bằng vào plasmid để tạo DNA tái tổ hợp và chế tác được DNA đầu lệch từ DNA đầu bằng 29 Hình: Cách tạo DNA tái tổ hợp dùng enzyme terminal transferase 5.2 Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận 5.2.1 Hoá biến nạp Theo Mandel và Higa cho thấy rằng, E Coli trở nên rất dễ bị biến nạp bởi DNA ngoại... G/AATTC với cDNA và enzyme DNA ligase để tạo phân tử lai Cắt phân tử DNA lai bởi enzyme EcoRI, ta được phân tử lai có hai đầu lệch 3 - Tạo vector tái tổ hợp: Để tạo vector tái tổ hợp, người ta ghép phân tử DNA lai đầu lệch vào plasmid mà cũng được cắt bởi cùng một enzyme EcoRI Nhờ tác dụng của enzyme DNA ligase mà vector tái tổ hợp được tạo thành Hình 4.5 Dùng các đoạn nối linker tạo DNA tái tổ hợp 28 5.1.3.3... trong hai sợi của phân tử DNA khác nhau thì chúng có thể nối lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung Vào những năm 70, người ta đã tạo được những phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên bằng nhiều phương pháp khác nhau DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) là DNA lai - được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau Phân tử DNA tái tổ hợp được tạo ra nhờ kỹ thuật ghép nối các đoạn DNA của các cá thể khác... EcoRI Trong trường hợp này, chỉ có đoạn nối bị cắt còn cDNA vẫn còn nguyên vẹn (do được metyl hóa) Đưa cDNA vào vector tạo DNA tái tổ hợp - Ghép cDNA đầu dính vào vector thích hợp đã được mở EcoRI và đã khử nhóm phosphat 13 - Hàn kín mạch nhờ enzyme phosphoryl hóa và enzyme ligase để tạo vector tái tổ hợp - Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và nuôi cấy trong các điều kiện thích hợp để tạo dòng Ưu... phương pháp sử dụng vi kim và kính hiển vi để đưa DNA tái tổ hợp vào mỗi tế bào nhất định Đây là quá trình lai ghép cho tế bào bậc cao hoặc tế bào hợp tử Tùy thuộc từng trường hợp cụ thể, người ta có thể chọn phương pháp sao cho việc đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào có hiệu quả cao Ưu điểm: Có thể tối ưu lượng DNA tái tổ hợp đưa vào tế bào và quyết định đưa DNA vào loại tế bào nào Đưa chính xác và thậm chí... nhiệm tổng hợp 3.3 Tổng hợp từ mRNA của gen tương ứng Tổng hợp cDNA từ mRNA nhờ kỹ thuật của Gubler và Hoffman với sự có mặt của enzyme phiên mã ngược (Rever transcriptase) Sau đó, cDNA (complementary) gắn vào plasmid và biến nạp vào vi khuẩn để tạo dòng cDNA Phương pháp: - Tổng hợp cDNA sợi kép đầu bằng từ mRNA dưới tác dụng của enzyme sao chép ngược - Metyl hóa các vùng hạn chế (có trong đoạn cDNA... transcriptase): Có khả năng tổng hợp DNA một mạch gọi là DNA bổ trợ (cDNA) từ khuôn mARN, hoặc từ một đoạn polynucleotit được tổng hợp bằng con đường hóa học Nhờ có con đường phiên mã ngược này mà có thể tổng hợp được hầu hết các gen riêng biệt nào đó nếu như có mặt mARN của gen đó Các cDNA mạch đơn có thể biến thành mạch kép nhờ DNA polymerase và được gọi là cDNA mạch kép (c -DNA duplex) Đoạn cDNA mạch kép có... tạo dòng gen mã hoá tổng hợp globine của người, động vật và chim, protein thủy tinh thể mắt bò, ovalbumine (protein lòng trắng trứng) và fibroin tơ tằm Phương pháp tổng hợp gen từ mRNA ngày càng được phát triển, nó kết hợp với các phương pháp khác của sinh học phân tử và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Hình: Sơ đồ tổng hợp gen từ mRNA 4 Vector chuyển gen Trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA, chúng ta không . bào sống, được gọi là DNA tái tổ hợp và kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật tái tổ hợp DNA. Sự tái tổ hợp DNA được xem là thành công chỉ sau khi đưa được phân tử DNA tái tổ hợp vào trong tế bào. tạo DNA tái tổ hợp 1,2: Cắt DNA của tế bào cho và plasmid bằng cùng một loại enzyme giới hạn 3 : Đưa DNA tái tổ hợp vào trong tế bào nhận 4 : Nhân dòng 2. Các enzyme sử dụng trong kĩ thuật tái tổ. nối ligase để tạo ra ADN tái tổ hợp hoàn chỉnh. - Bước 6 : Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng. - Bước 7 : Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ mang ADN tái tổ hợp và theo dõi hoạt động,