6 Ứng dụng
6.4 Trong công nghệ thực phẩm
6.4.1 Trong công nghệ lên men
Đây là một lĩnh vực quan trọng trong sản xuất thực phẩm. Việc tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng lên men tốt, đem lại hiệu quả cao là rất cần thiết. Các nghiên cứu sử dụng công nghệ di truyền phục vụ cho công nghệ lên men chủ yếu đi vào hai hướng chính là:
- Phân tích di truyền các loại vi sinh vật sử dụng trong quá trình lên men, xác định các gen mã hóa cho các tính trạng mong muốn nhằm tạo ra năng suất và chất lượng sản phẩm lên men.
- Tạo ra các vi sinh vật chuyển gen phục vụ cho các qui trình lên men. Ví dụ:
Trong sản xuất rượu, ngày nay người ta đã dùng các chủng vi sinh vật có khả năng tạo rượu cao và cho hương vị tốt. Phần lớn các chủng đó được nghiên cứu, tuyển chọn, lai tạo bằng công nghệ di truyền.
Để sản xuất rượu vang, trước đây, người ta phải dùng hai loại vi sinh vật là S. Cerevisiae để tạo ra hàm lượng rượu trong dịch lên men và sau đó, sử dụn
Leuconostos trong lên men phụ ở quá trình tàng trữ, nhằm nâng cao chất lượng của rượu. Ngày nay, người ta tiến tới dùng một chủng vi sinh vật chuyển gen để thực hiện cả hai quá trình.
Công nghệ di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc tuyển chọn và tạo ra các vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, sử dụng trong công nghệ thực phẩm. Đối
với các sản phẩm lên men sữa như phomat và sữa chua, trước kia, người ta thường sử dụng những vi sinh vật tự nhiên có mặt trong sữa để lên men, do vậy, người ta khó lòng kiểm soát quá trình lên men và hiệu quả không cao. Ngày nay, với công nghệ di truyền, người ta đã tạo được các chủng mới với các tính chất xác định và đã điều khiển được quá trình lên men theo định hướng mong muốn.
6.4.2 Sản xuất enzyme
Trong những năm gần đây, bằng cách sử dụng công nghệ di truyền, người ta đã tuyển chọn và tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme chịu nhiệt, chịu axit, chịu kiềm tốt. Enzyme λ-amylase chịu nhiệt đã và đang được sử dụng nhiều để sản xuất nha, đường glucose từ tinh bột.
6.4.3 Enzyme tái tổ hợp có khả năng khử độc tố Aflatoxine
Độc tố vi nấm quan trọng và nguy hiểm nhất hiện nay thuộc nhóm aflatoxin. Các độc tố này là chất chuyển hóa của các loài vi nấm Aspergillus, nồng độ giới hạn đã được WHO qui định được có trong thực phẩm là 5ppb (5μg/Kg).
Tập đoàn China medicine của Trung quốc đã thực hiện một dự án nghiên cứu và sản xuất thành công một sản phẩm sinh học gọi là rADTZ (recombinant aflatoxin detoxifizym enzyme) - enzyme tái tổ hợp khử độc tính aflatoxin.
Toàn bộ cấu trúc gen của rADTZ được tái tổ hợp từ một loại vi nấm. Để chế tạo rADTZ phải làm nhiều công đoạn: nuôi cấy vi nấm, tinh chế protein, tạo dòng gen, tái tổ hợp gen, và lên men.
Hợp chất này là dẫn xuất của một enzyme ngoại tế bào, enzyme này có khả năng làm phá vỡ cấu trúc vòng bifuran làm mất độc tính, và có chức năng như là một chất đối kháng (antidote) của aflatoxin. Do đó, rADTZ có triển vọng dùng để làm một chất khử độc tố aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc
Những thuốc thử phát hiện sinh học dựa trên men rADTZ có thể được sử dụng trong kiểm nghiệm y học để ứng dụng vào việc giám định và kiểm tra chất lượng sản phẩm của ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm. Hơn nữa, hiên nay, người ta chưa thực hiện được việc khử độc tố aflatoxin bị nhiễm trong sữa. Việc xử lý bằng cách kiềm hoá và chiếu tia cực tím (UV) được sử dụng để khử aflatoxin trong dầu đậu phọng, cách xử lý này có thể ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm sau xử lý. Trong khi đó xử lý bằng rADTZ trong những điều kiện đặc biệt không làm ảnh hưởng đến chất lượng và điều kiện bảo quản của sản phẩm.
PHẦN KẾT LUẬN
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
Từ những nghiên cứu thuần tuý ban đầu, công nghệ di truyền đã chuyển thành một nghành công nghiệp trị giá nhiều tỷ USD
Bên cạnh những ứng dụng cực kỳ to lớn, có lợi cho con người, các nhà khoa học cũng cảnh báo một số hiểm hoạ tiềm ẩn mà các sinh vật biến đổi gen có thể gây ra, ví dụ như gen của các sinh vật biến đổi thất thoát ra ngoài tự nhiên, truyền sang sinh vật khác có thể gây nguy hiểm cho hệ sinh thái.
Tuy ngày nay, các nhà khoa học đã có thể tổng hợp được các gen nhân tạo hay ghép gen này hay gen kia vào bộ máy di truyền của một sinh vật nào đó, nhưng chắc chắn, còn rất nhiều vấn đề về những bí ẩn của sự sống, nhất là ở các sinh vật bậc cao vẫn chưa được khám phá. Người ta có thể chứng tỏ sự vô hại của các loại thực phẩm từ thực vật, động vật hay vi sinh vật chuyển gen qua các thí nghiệm, nhưng về lâu dài, người ta chưa thể khẳng định được sự vô hại đó, vì vậy, không ít người đã tỏ ra lo lắng khi sử dụng chúng thường xuyên với một số lượng lớn.
PHỤ LỤC
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
1. Restriction enzyme
Enzyme Source Recognition
Sequence Cut
EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC
3'CTTAAG
5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5' EcoRII Escherichia coli 5'CCWGG
3'GGWCC 5'--- CCWGG---3' 3'---GGWCC ---5' BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5'GGATCC 3'CCTAGG 5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5' HindIII Haemophilus influenzae 5'AAGCTT
3'TTCGAA
5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5' TaqI Thermus aquaticus 5'TCGA
3'AGCT
5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5' NotI Nocardia otitidis 5'GCGGCCGC
3'CGCCGGCG
5'---GC GGCCGC---3' 3'---CGCCGG CG---5' HinfI Haemophilus influenzae 5'GANTC
3'CTNAG
5'---G ANTC---3' 3'---CTNA G---5' Sau3A Staphylococcus aureus 5'GATC
3'CTAG
5'--- GATC---3' 3'---CTAG ---5' PovII* Proteus vulgaris 5'CAGCTG
3'GTCGAC
5'---CAG CTG---3' 3'---GTC GAC---5' SmaI* Serratia marcescens 5'CCCGGG
3'GGGCCC
5'---CCC GGG---3' 3'---GGG CCC---5' HaeIII* Haemophilus aegyptius 5'GGCC
3'CCGG
5'---GG CC---3' 3'---CC GG---5' HgaI Haemophilus 5'GACGC 5'---NN NN---3'
gallinarum 3'CTGCG 3'---NN NN---5' AluI* Arthrobacter luteus 5'AGCT
3'TCGA
5'---AG CT---3' 3'---TC GA---5' EcoRV* Escherichia coli 5'GATATC
3'CTATAG
5'---GAT ATC---3' 3'---CTA TAG---5' EcoP15I Escherichia coli 5'CAGCAGN 25 NN
3'GTCGTCN 25 NN
5'---CAGCAGN 25 NN ---3' 3'---GTCGTCN 25 NN---5' KpnI Klebsiella pneumoniae 5'GGTACC
3'CCATGG
5'---GGTAC C---3' 3'---C CATGG---5' PstI Providencia stuartii 5'CTGCAG
3'GACGTC 5'---CTGCA G---3' 3'---G ACGTC---5' SacI Streptomyces achromogenes 5'GAGCTC 3'CTCGAG 5'---GAGCT C---3' 3'---C TCGAG---5' SalI Streptomyces albus 5'GTCGAC
3'CAGCTG 5'---G TCGAC---3' 3'---CAGCT G---5' ScaI Streptomyces caespitosus 5'AGTACT 3'TCATGA 5'---AGT ACT---3' 3'---TCA TGA---5' SpeI Sphaerotilus natans 5'ACTAGT
3'TGATCA 5'---A CTAGT---3' 3'---TGATC A---5' SphI Streptomyces phaeochromogenes 5'GCATGC 3'CGTACG 5'---G CATGC---3' 3'---CGTAC G---5' StuI Streptomyces tubercidicus 5'AGGCCT 3'TCCGGA 5'---AGG CCT---3' 3'---TCC GGA---5'
XbaI Xanthomonas badrii 5'TCTAGA
3'AGATCT
5'---T CTAGA---3' 3'---AGATC T---5'
Key: * = blunt ends ; N = C or G or T or A ; W = A or T
2. H&Đ an toàn thực phẩm từ ADN tái tổ hợp
Hiện nay ngừời tiêu dùng khắp nơi trên thế giới đang quan tâm đến vần đề an toàn thực phẩm đối với các sản phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp. Thông tin đưa ra dưới đây dựa trên tài liệu của Institute of Food Technologists (USA). Đây là
một tổ chức phi lợi nhuận, với hơn 29.000 thành viên từ các nước khác nhau, thuộc lĩnh vực khoa học và công nghệ thực phẩm.
Hỏi: Sử dụng thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp có an toàn không?
CÓ. Thực tế mà nói thì các quá trình của công nghệ ADN tái tổ hợp còn chính xác và dễ dự đoán hơn so với công nghệ lai tạo giống với kỹ thuật “cổ truyền” (conventional). Việc chuyển một hoặc vài gien đã được nghiên cứu đặc tính kỹ lưỡng thường có ít rủi ro hơn so với phương pháp lai tạo giống “cổ truyền”. Ở phương pháp cổ truyền, hàng trăm nghìn gien của mỗI cây tương tác lẫn nhau và tạo nên hàng loạt tái tổ hợp ngẫu nhiên. Ngoài ra, tất cả các thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp đều được kiểm tra nghiên cứu kỹ lưỡng trước khi đưa ra thương mại hoá. Nhiều tổ chức khoa học quốc tế đã nghiên cứu và đưa ra kết luận rằng “Sử dụng thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp là hoàn toàn an toàn”
Hỏi: Sử dụng thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp có làm biến đổi ADN của ngừơi sử dụng không?
KHÔNG. ADN bị phân cắt hoàn toàn và rất nhanh trong quá trình tiêu hoá.
Hỏi: Trong trường hợp sử dụng thực phẩm chuyển gien thì người tiêu dùng có ăn một lượng lớn ADN tái tổ hợp không?
KHÔNG. Các gien chuyển sử dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp chỉ chiếm 1/250.000 trên tổng số ADN của thực phẩm đó. Không có bằng chứng nào cho thấy có xảy ra sự chuyển gien từ ADN của thực phẩm “cổ truyền” sang sinh vật hay người tiêu dùng, nguy cơ xảy ra chuyển gien từ thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp còn thấp hơn rất nhiều lần so với ADN từ thực phẩm “cổ truyền”
Hỏi: Đã có trường hợp nào mà tiêu thụ thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp gây ảnh hưởng đến sức khoẻ chưa?
CHƯA. Cho đến nay chưa có báo cáo nào về vấn đề này. Tuy nhiên cũng có những trường hợp báo cáo không chính xác. Cụ thể vào năm 1980, đã có báo cáo về 1.500 người bị ngộ độc và 37 người chết do sử dụng L-tryptophan sản xuất bởi sinh vật có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp. Tuy nhiên, các nghiên cứu sau đó đã cho thấy rằng, đồng thời với việc đưa vi sinh vật có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp vào sản xuất Tryptophan, nhà sản xuất này đã bỏ bớt một bước quan trọng trong quá trình tinh
sạch, vì thế lượng carcbon hoạt hoá còn lại trong sản phẩm rất cao. Đây là nguyên nhân dẫn đến trường hợp trên.
Hỏi: Hiện nay những yếu tố nào được sử dụng trong việc đánh giá an toàn thực phẩm?
An toàn thực phẩm được đánh giá dựa trên nhiều yếu tố, trong đó bao gồm: vi sinh vật, độc tố, chất gây dị ứng, và thành phần dinh dưỡng. Để đánh giá độ an toàn của gien được chuyển, các nhà khoa học còn quan tâm đến nguồn gốc của gien. Gien phải có nguồn gốc an toàn đối với người tiêu thụ (V.D: gien bắt nguồn từ một thực phẩm khác). Độc tố và chất gây dị ứng đều được nghiên cứu trên các đối tượng chuyển gien trước khi đưa ra thương mại hoá. Ngoài ra, sự tương tác giữa protein của gien chuyển và protein của vật chủ cũng được nghiên cứu nhằm loại bỏ những trường hợp tương tác gây thay đổi đặc tính sản phẩm của gien chuyển. Cuối cùng, thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp còn được đánh giá, so sánh với thực phẩm “cổ truyền” cùng loại.
Hỏi: Thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp an toàn như vậy, tại sao vẫn có một nhóm người không ủng hộ?
Đây quả thật là một câu hỏi khó trả lời, mỗi người nhìn nhận sản phẩm mới, công nghệ mới dựa trên nhiều yếu tố khác nhau như, khoa học, an toàn, giá thành, độ thuận tiện, tính phổ biến, v. v. và “what’s in it for me?”. Thậm chí những công nghệ mới trong y học chữa bệnh cũng còn cần trải qua nhiều năm mới được công nhận hoàn toàn. Đối với thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp, nhiều vấn đề do người tiêu dùng thể hiện đều không có những bằng chứng khoa học ủng hộ.
Hiểu biết đầy đủ về công nghệ ADN tái tổ hợp là cần thiết để hiểu biết đúng về an toàn của thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp.
Thông tin thêm về vấn đề này hiện có ở http://www.ift.org
(Translated by Le Tien Dung 2002)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. ThS Lò Thanh Sơn, Bài giảng Công nghệ di truyền, Trường Đại hoc Tây Bắc 2. Phạm Thành Hổ, Sinh học đại cương, NXB Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí
Minh, 2002 3. http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme 4. http://highered.mcgraw- hill.com/sites/dl/free/0072437316/120060/ravenanimation.html 5. http://www.cynosura.org/index.php? option=com_content&view=article&id=10:ha-an-toan-thc-phm-t-adn-tai-t- hp 6. http://www.ihph.org.vn/DownloadFolder/AFLATOXIN%20chau%20vinh %20thi.pdf MỤC LỤC
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
PHẦN MỞ ĐẦU 2
PHẦN NỘI DUNG 4
1. Nguyên lí cơ bản của kĩ thuật tái tổ hợp DNA 4
2. Các enzyme sử dụng trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA 5
2.1 Enzyme giới hạn RE (Restriction Enzyme) 5
2.1.1 Khái niệm về enzym giới hạn 6
2.1.2 Phân loại enzym giới hạn 6
2.1.3 Tính đặc hiệu vị trí 7
2.2 Nuclease 8
2.3 Enzyme nối 10
2.3.1. Ligase 10
2.3.2. Các enzyme dephosphoryl hoá ( khử nhóm PO4-3 ) 10
2.4 Các enzym polymerase
11 2.4.1 Khái niệm 11
2.4.2 Phân loại 12
3. Thu nhận gen 12
3.1 Tách chiết DNA trực tiếp từ tế bào 12
3.2 Tổng hợp bằng phương pháp hoá học 12
3.3 Tổng hợp từ mRNA của gen tương ứng 13
4. Vector chuyển gen 14
4.1 Yêu cầu của vector chuyển gen 14
4.2 Vector chuyển gen là plasmid 15
4.2.4 Các plasmid thế hệ thứ nhất 15
4.2.5 Plasmid thế hệ thứ hai 15
4.2.6 Các plasmid thế hệ ba 16
4.3 Vector chuyển gen là phage 19
4.4 Các vector chuyển gen khác 21
4.4.2 Các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC 22
5. Các bước tiến hành trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA 23
5.1 Tạo DNA tái tổ hợp 23
5.1.1 DNA tái tổ hợp là gì? 23
5.1.2 Công đoạn chính tạo DNA tái tổ hợp 24
5.1.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu 24
5.1.3.1 Công đoạn cắt 24
5.1.3.1 Công đoạn nối 25
5.1.3 Các phương pháp tạo DNA tái tổ hợp 26
5.1.3.1 Dùng đầu lệch 26
5.1.3.2 Sử dụng đoạn nối (linker) 27
5.1.3.3 Sử dụng enzyme terminal transferase (ETT) 29
5.2 Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận 30
5.2.1 Hoá biến nạp 30 5.2.2 Điện biến nạp 31 5.2.3 Bắn gen 31 5.2.4 Vi tiêm 32 5.2.5 Tải nạp 32 5.3 Tạo dòng phân tử 32
5.3.1 Phương pháp lai axit nucleic(sử dụng gen đánh dấu) 33
5.3.2 Phương pháp sử dụng kháng thể 33
5.3.3 Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn 33
5.3.4 Phương pháp phát hiện do thay đổi kiểu hình 34
6 Ứng dụng 34
6.1 Trong y dược 34
6.2 Trong nông nghiệp 35
6.3 Trong bảo vệ môi trường 36
6.4 Trong công nghệ thực phẩm 37
PHẦN KẾT LUẬN 40 PHỤ LỤC