Báo cáo Cúc gai

BỘ CƠNG THƯƠNG VIỆN HĨA HỌC CƠNG NGHIỆP VIỆT NAM BÁO CÁO CẤP BỘ CÔNG THƯƠNG Đề tài: “NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT, TÁCH SILYMARIN TỪ HẠT CÂY CÚC GAI (SILYBUM MARIANUM) LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ” Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Thị Thu Hương Hà Nội, 2019 DANH MỤC VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribo Nucleic ARN Acid Ribonucleic ALT Alanine Aminotransaminase AST Aspartate Aminotransaminase CCI4 Cacbon Tetrachlorid EtOH Ethanol MeOH Methanol NaCl Muối Natriclorua cAMP ̉ ̉ Cyclic Adenosine Monophosphat- Chất truyền tin HPLC Sắc ki long hiêụ cao TPCN Thưcc̣ phẩm chưc WHO World Health Organization- Tổchức y tế thếgiới UV Ultravioler- Phổ tử ngoại ́ ̉ ́ MỞ ĐẦU Việc dùng th́c có nguồn gớc từ thảo dược phối hợp sử dụng thuốc đông dược và tân dược đươcc̣ cộng đồng rất coi trọng Do loại thuốc thảo dược và kết hợp đông –tây y chữa bệnh mà có tác dụng phụ Vì vậy, th́c có nguồn gốc thảo dươcc̣, đặc biệt là thuốc đã dùng rộng rãi theo kinh nghiệm cổ truyền để chữa bệnh nhà khoa học giới và Việt Nam quan tâm nghiên cứu Gan là một quan quan trọng về mặt chuyển hóa chất của thể người Mợt chức quan trọng của gan là tham gia vào q trình giải đợc chất nợi sinh và ngoaị sinh Trong trường hơpc̣ bênḥ lý hay sư c̣quá tải chất đôcc̣ gan, tế bào gan se ̃ bi c̣ hủy hoại, dẫn đến tổn thương gan, dần dần làm tổn thương không hồi phucc̣ làm cho gan bị xơ, và mất chức giải đôcc̣ Bệnh gan là môṭ bệnh phở biến cơngc̣ đồng Có nhiều loaị bênḥ gan thường găpc̣ là viêm gan siêu vi, là mợt bệnh trùn nhiễm phở biến nhất giới, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng thập niên này Hiện có loại virus gây viêm gan : A, B, C, D, E và G, phở biến và nguy hiểm nhất là siêu vi B và C Khoảng tỷ người giới đã nhiễm virus viêm gan B, tâpc̣ trung chủ yếu ởchâu Á và châu Phi Theo báo cáo của tổ chức y tếthếgiới, viêm gan B là môṭ mười nguyên nhân gây tử vong nhiều nhất, khoảng triêụ ca tử vong mỗi năm bênḥ này và 350 triêụ người mang virus này mãn tinh́ Có khoảng 3% dân sớ giới nhiễm virus viêm gan C và 170 triệu người mang virus này mãn tính Viêṭ Nam là mơṭ nước cótỷ lê c̣viêm gan B cao nhất giới Người bi c̣viêm gan maṇ tính có nguy ung thư gan cao gấp 20 lần so với người binh̀ thường và 40% số họ se ̃ tử vong ung thư gan Đã có chứng cho thấy silymarin kế sữa có tác dụng chữa bệnh xơ gan rượu Một hoạt tính triển vọng của silymarin là chớng ung thư, vậy sử dụng silymarin kết hợp với phương pháp hóa trị liệu Silymarin hoạt đợng chất chớng oxy hóa, bảo vệ mơ và loại bỏ chất gây đợc cho gan [1,2,11] Vì vây,c̣ để sản xuất một số loại sản phẩm tăng cường chức gan hỗ trợ điều trị bệnh liên quan đến gan Việt Nam, thay sản phẩm nhập ngoại, là sở để thực đề tài: “Nghiên cứu, xây dựng quy trình chiết, tách silymarin từ hạt cúc gai (Silybum marianum) làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng.” Mucc̣ tiêu đềtài: Nghiên cứu quy trình tách chiết Sylimarin từ hạt kế sữa và bào chế thành một sản phẩm thực phẩm chức cụ thể phục vụ cho người bị bệnh gan và ngăn ngừa bệnh liên quan đến gan CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung 1.1.1 Cây Cúc gai Cúc gai, gọi là Kế sữa, kế thánh, kế đức mẹ, là mợt loài thực vật có hoa họ Cúc.Được Gaertn miêu tả khoa học đầu tiên năm 1791 Cúc gai(Sylibummarianum(L.)Gaernt) là mợt loại thưc vật có hoa tḥc họ cúc, là loại thân thảocao 1-3m.Thân thẳng và phân nhánh Lá xanh, gân màu trắng, bóng láng, thường có nhiều đớm trắng dọc theo gân, mép có dạng gai, gai màu vàng và rất nhọn; phía và ơm lấy thân; rất to, có phiến chia thuỳ và có ćng Cụm hoa đầu đơn đợc, rợng 3-10cm Lá bắc ngoài và có mợt phần phụ hình tam giác màu lục thu lại thành một gai to, gớc có 4-6 gai nhỏ, ngắn hơn, mỡi bên Hoa màu tím, gặp màu trắng, giớng nhau, đều có cánh hoa, nhị và bầu với noãn và vịi nhuỵ phình gốc, đài hoa màu xanh mép sắc nhọn Quả bế hình bầu dục thn, dài 7-8mm, vỏ màu nâu bóng có vân vàng nhiều ít, tùy tḥc vào nguồn giống S.marianum và điều kiện canh tác Cây hoa vào tháng đến tháng 8, hạt màu đen thu hoạch vào cuối hè để phục vụ mục đích y học.[1,2] Cây có nguồn gớc Địa Trung Hải và mọc hoang dại nhiều nơi giới miền Nam và Trung Âu, Bắc Phi, Trung Đông, Ấn Độ, Trung Quốc, Bắc và Nam Mỹ [] Cây cúc gai di thực và nhân giống thành công Việt Nam với mục tiêu ứng dụng sản xuất chế phẩm thuốc và thực phẩm chức chữa bệnh gan thận tạo nguồn dược phẩm quý, mới, phong phú và rẻ tiền phục vụ bảo vệ sức khỏe cộng đồng Hiện cúc gai nhân giống và trồng đại trà Tam Đảo, Sapa…Cây cúc gai trồng cách gieo hạt trực tiếp xuống đất (sâu 3mm), khoảng hạt/ 1m Môi trường sinh trưởng của cúc gai là vùng khô ráo, nhiều ánh nắng mặt trời.Hạt nảy mầm sau -3 tuần Thời gian gieo trồng thích hợp là ći thu và xn Đây là loại thảo mọc có hoa phát tán Nó héo khô vào mùa đông và mùa thu Bông hoa của bay theo gió khắp nơi và sau rơi xuống mặt đất Đến mùa xuân mọc thành non và sinh trưởng phát triển Hình1.1 Cây cúc gai Hình 1.2 Hoa và hạt của cúc gai 1.1.2 Sơ lược lịch sử sử dụng cúc gai l àm thuốc Hạt của cúc gai(Sylibummarianum(L.)Gaernt.) đã sử dụng 2000 năm để chữa bệnh rối loạn gan và túi mật viêm gan, xơ gan, vàng da và bảo vệ gan khỏi tác đợng có hại của hóa chất và chất độc ngoài môi trường nọc rắn, côn trùng, ngộ độc nấm rượu Cao chiết hạt cúc gai đã sử dụng làm thuốc từ thời Hy Lạp cổ đại Dioscorides, một nhà dược thảo hoc̣c HyLạp kỷ thứ I đã viết rằng, hạt cúc gai pha thành trà ́ng chữa rắn độc cắn Pliney The Elder(năm 23-79 sau CN) ghi lại rằng, nước ép cúc gai trộn với mật ong làm th́c lợi mật rất tớt Đây là ghi nhận đầu tiên về tác dụng của cúc gai liên quan đến gan Nhiều kỷ sau, cúc gai đã trở thành một thuốc quen thuộc Đức và đã nhắc đến một thảo tiếng Đức cổ “Physica” của Hildegarde viết năm 1150 và xuất vào năm 1533 Tác giả đã viết về công dụng của rễ, toàn và cúc gai Một số tác giả khác Otto Brunfels(1534), HieronimusBock(1595), JacobusTheodorus(1664) và AdamLonicerus (1679) đã giới thiệu dùng cúc gai để trị bệnh về gan Vào cuối kỷ XVIII, Culpepper(1787) cho cúc gai là thứ thuốc tuyệt vời làm thơng tắc gan, lách và vậy dùng rất tốt để chữa bệnh vàng da Giữa năm 1772 đến 1850, mợt chế phẩm có tên gọi là “Cồn thuốc của Rademacher”, cao chiết cồn hạt cúc gai đã dùng phổ biến để trị rối loạn về gan, lách Tương tự, cuối kỷ XIX đầu kỷ XX, một trường đào tạo nhà dược thảo học tên là “Eclectic” đã dùng cao chiết cúc gai để điều trị sung huyết gan, giãn tĩnh mạch, rối loạn kinh nguyệt và bất thường của lách và thận Năm 1958, nhà khoa học người Đức bắt đầu ý nghiên cứu cúc gai Các nghiên cứu về tác dụng bảo vệ gan, thành phần hoạt chất và chế tác dụng đã thực hiện.Thành phần hoạt chất hạt cúc gai đã xác định là silymarin, một hỗn hợp flavonolignan mà chất là silybin, silychristin và silydianin Năm 1960, Hoa Kỳ, nhà khoa học bắt đầu quan tâm tới hoạt chất có cúc gai phát có tác dụng kỳ diệu giải độc thể, thông qua chế tác đợng nhanh chóng lên hệ tiêu hóa, đặc biệt là gan và mật.Từ năm1969, chế phẩm silymarin chiết xuất từ hạt cúc gai bắt đầu sử dụng rộng rãi điều trị Đức và sau là khắp giới Vào năm 1990, doanh số bán chế phẩm này Đức lên tới 180 triệu đôla/năm 31% số bệnh nhân mắc bệnh về gan Mỹ đã dùng dược thảo mà chủ yếu là dùng cúc gai.[7,8,17] 1.2 Silymarin 1.2.1 Giới thiệu Silymarin Silymarin lần đầu tiên phân lập Wagner và cợng Thành phần hóa học của hạt cúc gai là silymarin Silymarin là hỗn hợp flavonolignan: silybin, silychristin và silydianin, (hình1.3) Các dẫn chứng tài liệu cho thấy tỉ lệ của chất silymarin khác phụ thuộc rất lớn vào nguồn S.marianum(giống và điều kiện trồng) và trình tách chiết, xử lý Gần đây, silymarin nhận quan tâm hoạt tính có lợi của liên quan trực tiếp đến hiệu qua bảo vệ gan và chống oxy hóa Hình Thành phần của silymarin Trong sớ đồng phân, Silybin là thành phần chiếm khoảng 70-80%, là silychristin 20%, silydianin 10% và isosilybin 0,5% Công thức chung của hợp chất này là C 25H22O10, khối lượng phân tử 482 đ.v.C Về bản, cấu trúc flavonolignan gồm dihydroflavanol taxifolin liên kết với coniferyl alcohol qua mợt vịng epoxit Nhóm epoxit chịu trách nhiệm cho hoạt động sinh học của silymarin, mở vịng mất hoạt tính Chỉ có silybin và isosilybin có chứa nhóm 1,4-dioxan cấu trúc của chúng Silybin coi là thành phần chủ yếu và hoạt đợng nhất silymarin.[15,16] 1.2.2.Tính chất silymarin 1.2.2.1 Tính chất hóa học Với cấu trúc flavonolignan nên silymarin có tính chất của mợt flavonoid Do đặc điểm cấu tạo của flavonoid có nhóm hydroxyl phenolic, nhóm carbonyl,vịng thơm benzen nên chúng có khả phản ứng rất lớn.Tính chất hóa học của flavonoid cịn phụ tḥc vào vị trí nhóm OH, hệ nới đơi liên hợp và nhóm Sau là phản ứng hóa học đặc trưng của flavonoid: *Phản ứng nhóm hydroxyl(OH) Tính oxy hóa: Dưới tác dụng của chất oxy hóa (nitrat bạc, ferricyanit, persulfate, gớc tự do…) hay enzym polyphenoloxydase, flavonoid bị oxy hóa thành gốc phenoxy ArO*(gốc tự bền) Các gốc này dime hóa hay phản ứng oxy hóa và phản ứng làm bẻ gãy vịng Tính axit: Các flavonoid có tính acid yếu nên dễ dàng phản ứng với dung dịch kiềm để tạo thành muối tan nước đun nóng, cho màu vàng cam hay đỏ thắm Antoxyan dung dịch amoniac hay natri cacbonate cho màu xanh tím Sự tạo thành liên kết hydro: Khi khơng có trở ngại về mặt cấu trúc khơng gian liên kết hydro hình thành nhóm OH phân tử phân tử với Đặc điểm này làm ảnh hưởng đến tính chất hóa học như: Điểm sơi, điểm nóng chảy, đợ hịa tan, đặc tính phở tử ngoại, cấu trúc phân tử và khả phản ứng Phản ứng ete hóa: Ete thiên nhiên của phenol thường gặp thực vật, đặc biệt là ete etylic Những nhóm OH phenol dễ dàng tham gia phản ứng ete hóa.[30] *Phản ứng nhóm cacbonyl Phản ứng này đặc trưng cho chất flavonoid có nhóm cacbonyl vị trí C4 và có nới đơi C2 và C3, điển hình là flanonol, flavon khơng có OH C3 nên phản ứng khó và cho màu nhạt nên đơi khó phát Phản ứng tạo phức với kim loại: Khả tạo chelat với kim loại nặng là mợt tính chất quan troc̣ng của flavonoid, liên quan đến hoạt tính sinh học của chúng Các phức màu xanh đen với molipden và sắt Các flavonoid có nhóm cacbonyl vị trí C4 và hydroxyl vị trí C3-C5 dễ tạo phức với kim loại, đặc biệt với nhôm cho màu vàng vàng xanh, phát quang bước sóng 365nm 1.2.2.2 Một số tính chất vật lý silymarin - Độ hấp phụ : silymarin hấp thụ ánh sáng vùng UV-VIS Các đỉnh hấp phụ UV/nm : 217, 230, 288.Cực đại hấp phụ bước sóng 288nm - Điểm nóng chảy : 162-1630C - Độ quay cực : + 11,38( c 0,23, aceton) - Không tan nước, tan một số dung môi phân cực - Ở 1800C bắt đầu phân hủy 1.3.Tác dụng silymarin Bắt đầu từ năm 60 của kỷ trước, cúc gai đã nghiên cứu chuyên sâu Các nhà khoa học đã thành công việc xác định hoạt chất có thảo dược này mà nổi bật nhất là Silymarin - hoạt chất vàng làm nên công dụng bảo vệ gan tuyệt vời của cúc gai Vì mà năm 1985, cúc gai thức công nhận và đưa vào điều chế thành thuốc thảo dược điều trị bệnh về gan Đây là thảo dược nằm danh sách 10 loại thảo dược bán chạy 10 Quy trình gia cơng thử nghiệm sản phẩm viên nang cứng * Sơ đồ gia công sản phẩm • Thuyết minh quy trình gia cơng viên nang cứng SILYMACARE 69 Chuẩn bị nguyên phụ liệu, dụng cụ máy móc, người: * Dụng cụ máy móc: - Phịng làm việc, máy móc, dụng cụ cân, đong, pha chế phải khô, sạch, không lẫn mùi lạ, chống nhiễm chéo Các thiết bị phải an toàn về điện, sạch, khô và sẵn sàng làm việc * Nguyên liệu: Silymarin và phụ gia theo tỷ lệ * Cân chia nguyên phụ liệu: - Cân chia nguyên phụ liệu cân đồng hồ, trọng lượng theo yêu cầu * Pha chế: - Rây xen kẽ nguyên liệu: Rây nguyên liệu: qua máy rây KBC-SH2D-20A, lưới 1,0 mm -Trộn hoàn tất: cho hết nguyên liệu đã rây vào nồi trộn KBC- LP2G-250, đậy nắp lại, cho máy chạy 10 phút Tắt máy, trút cốm vào bao PE có silicagel đựng bao nhơm có dán nhãn phiếu kiểm soát ghi đầy đủ chi tiết Cân kiểm tra Báo phòng Kiểm nghiệm đến lấy mẫu * Vơ nang: Thực sau có giấy báo thức của phòng Kiểm nghiệm về chất lượng sản phẩm Thiết bị: máy vơ nang NJP-800 Thực đóng nang theo thông số sau: - Cảm quan viên: viên nang sớ 1, màu vàng - cam, cịn ngun vẹn khơng móp, rách, tét hay thụng đầu nang - Khới lượng: 500 mg ± 10% (Cân Sartorius) - Lấy mẫu kiểm nghiệm Lau nang: nang đạt chuyển sang lau nang máy YPJ-II-7000 trước cho vô lọ Sản phẩm sau đóng viên thành phẩm đưa phân tích theo tiêu bảng sau của Cục An toàn Thực Phẩm – Bộ Y Tế Giới hạn vi sinh vật: STT Tên tiêu Đơn vị tính 70 Mức tối đa Tởng sớ vi khuẩn hiếu khí CFU/g 10000 Coliform CFU/g 10 Cl.perfringens CFU/g 10 E.coli CFU/g 10 Salmonella CFU/25g Tổng số bào tử nấm men - Mốc CFU/g 100 Đơn vị tính Mức tối đa Chì ppm Cadimi ppm Thủy ngân ppm 0,1 Giới hạn kim loại nặng: STT Tên tiêu Bảng 3.17 Kết phân tích sản phẩm TPCN dạng viên nang cứng có chứa Silymarin 71 Đới chiếu với tiêu chuẩn về TPCN Cục An toàn Thực phẩm đưa ra, sản phẩm thử nghiệm viên nang cứng Silymacare đã đạt yêu cầu về tiêu cho một sản phẩm TPCN 3.6.Tính tốn sơ giá thành ngun liệu Silymarin Số TT Diễn giải Đơn VT Số lượng Đơn giá Thành tiền Giá thành ĐV Chi phí cho mợt ca sx (4.6kg Silymarin) Hạt cúc gai kg 100 60,000 6,000,000 n-Hexan Etanol 85% Than Nước cất Điện nước Cơng Tổng chi phí kg kg kg kg kw 105 158 30 20 12,000 15,000 3,600 300 1,260,000 2,370,000 108,000 6,000 100,000 100,000 9,944,000 1,304,347.8 273,913 515,217.39 46,956.52 1,304.35 21,739.13 43,478.26 2,206,957 Bảng là tính tốn sơ bợ cho cho mợt ngày sản xuất theo quy mô 50kg nguyên liệu/mẻ Do dung môi quay vịng liên tục và khép kín nên tổn hao dung môi là không đáng kể Từ quy mô 50kg nguyên liệu/mẻ triển khai sản xuất công nghiệp lớn chi phí 01kg sản phẩm giảm đáng kể, hiệu suất thu hồi sản phẩm cao 72 KẾT LUẬN Đề tài đã đạt kết sau: Xây dựng quy trình chiết Silymarin phịng thí nghiệm quy - mơ 01kg nguyên liệu/ mẻ với thông số sau: Tách dầu hạt cúc gia n-Hexan 6h Dung môi chiết: EtOH 85% Cách chiết: đun hồi lưu Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi= 1: 3(g/ml) Thời gian đun hồi lưu để chiết: x lần chiết Hiệu suất thu hồi Silymarin thô đạt 4,55% - Hoàn thiện quy trình chiết Silymarin quy mơ 50kg nguyên liệu/mẻ Loại dầu phương pháp ép và chiết loại bỏ dầu n-Hexan Dung môi chiết: EtOH 85% Cách chiết: đun hồi lưu Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi= 1: 9,5(kg/l) Thời gian đun hồi lưu để chiết: x lần chiết 73 Xác định đồng phân của silybin, isosilybin silychristin là thành phần bợt silymarin thành phẩm Bợt silymarin và viên nang TPCN có chứa silymarin phân tích theo tiêu chuẩn của Cục ATTP và đạt chất lượng đề Hoạt tính bảo vệ tế bào gan và hạ men gan thực nghiệm chuột liều 300 mg/kg/ngày đã thể hoạt tính bảo vệ gan tớt mơ hình gan bị gây độc Paracetamol làm giảm mạnh hai số AST, ALT (P