PHẦN II THỰC NGHIỆM 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ thí nghiệm
2.5.5. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu theo phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây độc bằng paracetamol
Nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan của bột Silymarin được thực hiện trên mô hình gây độc bằng Paracetamol trên chuột nhắt trắng theo phương phápcủa Liu và cộng sự (2010). Ở liều gây độc hại, paracetamol nhanh chóng làm cạn kiệt GSH, dẫn đến sự tích tụ N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI), sau đó hình thành các chất protein NAPQI do kết quả của sự hình thành liên kết hóa trị giữa NAPQI và nhóm sulfhydryl (-SH) của protein tế bào gan. Sự tích tụ của các chất NAPQI-protein này dẫn đến việc hình thành các loại oxy phản ứng (ROS) tấn công các viphân tử của tế bào gây ra peroxid hóa lipid và hoại tử gan. Sự phá hủy tế bào gan này cuối cùng dẫn đến sự rò rỉ của chúng và sự gia tăng các enzyme chức năng của tế bào gan trong lưu thông
trong máu. Từ những lý do trên, để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan, ngoài việc đánh giá một số chỉ tiêu ALT, AST, chúng tôi còn đánh giá thêm các chỉ tiêu chống oxy hóa nhờ xác định hàm lượng malondialdehyde (MDA).
Thiết kế thí nghiệm: 24 chuột chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 6 con. • Lô 1 (Đối chứng bệnh lý): uống nước cất,
• Lô 2 (Đối chứng tham khảo): uống Silymarin (Sigma) liều 100 mg/kgP/ngày.
• Lô 3 (Mẫu thử): uống mẫu bột silymarin liều 100 mg/kgP/ngày • Lô 4 (mẫu thử): uống mẫu bột silymarin liều 300 mg/kgP/ngày
Cách tiến hành và đánh giá:
Cho chuột thí nghiệm uống với thể tích ở tất cả các lô như nhau, uống vào một giờ cố định (buổi sáng), trong 7 ngày liên tục. Ngày thứ 7, sau khi uống mẫu 3 giờ, tiến hành gây độc bằng Paracetamol qua đường uống liều 300 mg/kg thể trọng cho tất cả các lô. Paracetamol được pha trong dung dịch Tween 80 0,01%. Sau khi gây độc 48 giờ, lấy máu xác định hoạt độ ALT, AST bằng máy định lượng sinh hóa bán tự động của Beckman Coulter AU680. Sau đó, giết chuột tách lấy gan, rửa sạch bằng nước muối sinh lý lạnh, cân khối lượng gan, 1 phần gan được cố định trong formol 10% để làm tiêu bản mô bệnh học (nếu cần), 1 phần cất trữ trong tủ ở -20oC cho thí nghiệm xác định hàm lượng MDA trong gan.
Xác định hàm lượng MDA trong gan
Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15 % theo tỉ lệ 1 : 10 (gan : dung dịch đệm) ở nhiệt độ 0 - 50C. Lấy 1 ml dịch đồng thể, thêm 0,5 ml đệm Tris-HCl, ủ ở 370C trong 1 giờ. Kết thúc phản ứng bằng 0,5 ml acid tricloacetic 10%, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút, lấy 0,5 ml dịch trong cho phản ứng với 0,5 ml acid thiobarbituric 0,8%, ủ ở 95-1000C trong 15 phút và đo màu ở λ = 532 nm.
Tính toán kết quả:
Hàm lượng MDA (nM/ml) được tính theo phương trình hồi qui chất chuẩn MDA: y = 0,0637x - 0,0029 (R2 = 0,9981).
Trong đó: y là giá trị mật độ quang OD, x là hàm lượng MDA. Vậy hàm lượng MDA là (nM/ml dịch đồng thể) = (y + 0,0029)/0,0637.
Xử lí số liệu
Các số liệu được sử lí trên Excel, thuật toán thống kê so sánh sự sai khác của hai giá trị trung bình Data Analysis để kiểm tra sự sai khác có ý nghĩa so với đối chứng Paracetamol và đối chứng tham khảo (Silymarin). Nếu P< 0,05 được coi là sai khác có ý nghĩa, nếu P > 0,05 sự sai khác là không có ý nghĩa thống kê.