Xác đinh Coliforms

PHẦN II THỰC NGHIỆM 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ thí nghiệm

2.3.3. Xác đinh Coliforms

Xác định Coliforms theo TCVN 4882:2007 Phương pháp xác định

Thông thường lấy một tổ hợp ba ống đối với mỗi độ pha loãng. Tuy nhiên, đối với một số sản phẩm và/hoặc các kết quả yêu cầu có độ chính xác lớn hơn, mà có thể cần thiết phải cấy một loạt nhiều hơn ba ống (ví dụ: năm ống).

Lấy ba ống môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép. Dùng pipet vô trùng chuyển 10 ml mẫu thử nếu là chất lỏng hoặc 10 ml huyền phù ban đầu, nếu là các sản phẩm ở dạng khác vào từng ống trên.

Lấy ba ống môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn. Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml mẫu thử nếu là chất lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu, nếu là các sản phẩm ở dạng khác vào từng ống nghiệm nói trên.

Đối với mỗi độ pha loãng tiếp theo, tiếp tục như mô tả trong. Sử dụng mỗi pipet vô trùng cho mỗi độ pha loãng. Trộn kỹ dịch cấy với môi trường.

Để ống môi trường nồng độ kép trong tủ ấm ở 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h.

Để ống môi trường nồng độ đơn trong tủ ấm ở 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h, hoặc nếu ở giai đoạn này mà không thấy sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí thì ủ tiếp 24 h ± 2 h.

Dùng que cấy vòng cấy dịch cấy thu được vào ống môi trường thử khẳng định . Đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h, nếu không sinh khí ở giai đoạn này thì ủ tiếp 24 h ± 2 h.

Tiến hành theo cùng một trình tự như trong đối với các ống đã được ủ ấm từ có biểu hiện sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí, khi quan sát lần thứ nhất (tức là sau 24 h ± 2 h hoặc sau 48 h ± 2 h).

Diễn giải kết quả

Đối với mỗi độ pha loãng, đếm tổng số các ống quan sát thấy có sinh khí trong các ống dương tính sau 24 h ± 2 h và sau 48 h ± 2 h (nếu có).

Tính và biểu thị kết quả

Theo các kết quả diễn giải chỉ rõ sự có mặt hay không có mặt coliform trong phần mẫu thử x g hoặc x ml của sản phẩm

Tính số lượng N vi sinh vật có trong mẫu thử theo trung bình khối lượng từ hai độ pha loãng liên tiếp bằng cách sử dụng công thức :

Trong đó

C là tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa được giữ lại từ hai độ pha loãng liên tiếp, trong đó ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc;

V là thể tích chất cấy được đưa vào mỗi đĩa, tính bằng mililit (ml);

d là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng đầu tiên được giữ lại (d =

2.3.5. Xác định E.Coli

Hàm lượng E.Coli được xác định theo TCVN 6846:2007 Cách xác định:

Cấy và ủ môi trường tăng sinh chọn lọc (canh thang lauryl sunfat)

Chuẩn bị một dãy ba ống nghiệm đối với mỗi độ pha loãng. Đối với động vật giáp xác hoặc các sản phẩm đặc biệt khác và/hoặc khi yêu cầu các kết quả có độ chính xác cao hơn thì cần phải ủ một dãy năm ống nghiệm

Lấy ba ống nghiệm môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép . Dùng pipet vô trùng chuyển vào mỗi ống nghiệm 10 ml huyền phù ban đầu. Các phần thử nghiệm này tương ứng với 1 g mẫu thử trên một ống.

Lấy ba ống nghiệm môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn . Dùng pipet mới vô trùng chuyển vào mỗi ống nghiệm 1 ml huyền phù ban đầu. Các phần thử nghiệm này tương ứng với 0,1 g mẫu trên một ống.

Đối với mỗi độ pha loãng tiếp theo (bằng 0,01 g, 0,001 g, v.v...mẫu thử trên một ống), thì tiến hành tiếp theo. Sử dụng mỗi pipet vô trùng mới cho một độ pha loãng. Trộn cẩn thận dịch cấy và môi trường.

Ủ các ống nghiệm môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép đã được cấy theo trên và các ống nghiệm môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn đã được cấy như trên trong tủ ấm ở 37 oC trong 24 giờ ± 2 giờ. Nếu trong giai đoạn này không sinh khí cũng không bị mờ đục thì ủ tiếp đến 48 giờ ± 2 giờ. Đối với giáp xác và nhuyễn thể, thì thời gian ủ có thể đến 48 giờ ± 2 giờ.

Đối với mỗi ống nghiệm đựng môi trường nồng độ kép được ủ ở trên thấy mờ đục hoặc sinh khí, và đối với mỗi ống nghiệm đựng môi trường nồng độ đơn được ủ thấy sinh khí thì cấy truyền một vòng cấy sang ống nghiệm đựng canh thang EC .

Ủ các ống đã được cấy trong nồi cách thủy hoặc để trong tủ ấm ở 44 oC trong 24 giờ ± 2 giờ. Nếu ở giai đoạn này không thấy sinh khí trong canh thang EC thì kéo dài thời gian ủ sao cho tổng thời gian ủ là 48 giờ ± 2 giờ.

Đối với giáp xác và nhuyễn thể, thì thời gian ủ được giới hạn đến 24 giờ ± 2 giờ.

Cấy và ủ môi trường nước pepton

Sau khi đã ủ chọn lọc, nếu quan sát thấy sinh khí, thì cấy vào ống nghiệm đựng nước pepton đã được làm ấm trước đến 44oC một vòng dịch cấy. Ủ 48 giờ ± 2 giờ ở 44 oC.

Kiểm tra về sự sinh indol

Thêm 0,5 ml thuốc thử indol ) vào các ống chứa nước pepton đã được ủ ở trên. Trộn kỹ và kiểm tra sau 1 phút. Nếu trong pha cồn có màu đỏ chứng tỏ có mặt

indol. Diễn giải

Các ống đựng môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn hoặc môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép sau khi cấy truyền và ủ cho thấy có sự sinh khí trong ống đựng canh thang EC và sinh indol trong ống nước pepton thì được coi là dương tính.

Đối với mỗi độ pha loãng, đếm số lượng ống dương tính của môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn và môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép.