PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO TẾ BÀO THỰC VẬT ( TI – PLASMID )

Ngày nay, các loại cây trồng kháng virus, côn trùng hay kháng thuốc trừ cỏ đã được tạo ra bằng việc áp dụng chuyển các gen mong muốn vào thực vật, đã mang lại những cải thiện quan trọng trong năng suất. Các gen cải thiện sự tăng trưởng của thực vật trong môi trường axit hoặc kiềm và đất nhiễm mặn đã được cô lập. Cây trồng chuyển gen là sự thay thế có hiệu quả, vì chúng có thể biểu lộ nhiều loại prtein, cũng như thực hiện các thay đổi cần thiết để các loại prôtêin đó hoạt động. Hệ thống cây trồng cũng ít khi chứa các loại vi khuẩn có thể là nguồn bệnh đối với động vật.

Đề tài: PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO TẾ BÀO THỰC VẬT ( TI – PLASMID ) NHÓM THỰC HIỆN : 05 DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM I HỌ VÀ TÊN MSV LỚP Lê Thị Hương 571935 K57KED Bùi Ngọc Thảo 601244 K60QLTP Vũ Thị Dung 591360 K59CNSTHA Trần Thị Hằng 591779 K59QLTP Nguyễn Thị Thanh Duyên 591771 K59CNTPC Phetmany Buonkimvanh 600961 K60CNSTHA Peng Sakhovang 600960 K60CNSTHA Phan Thị Phượng 604919 K60QLTP MỞ ĐẦU Việc sử dụng khối lượng lớn nhiên liệu hố thạch giúp có đời sống tiện nghi hạnh phúc dẫn đến trả giá đắt tượng ấm lên toàn cầu, ô nhiễm hủy hoại môi trường Do nhiều điều kiện bất lợi môi trường nhiễm vi khuẩn, virus, loại côn trùng, nhiễm mặn, khô hạn, nhiệt độ cao, … Ngay Mỹ, sản lượng nơng nghiệp giảm ¼ so với tối đa theo lý thuyết Ngày nay, loại trồng kháng virus, côn trùng hay kháng thuốc trừ cỏ tạo việc áp dụng chuyển gen mong muốn vào thực vật, mang lại cải thiện quan trọng suất Các gen cải thiện tăng trưởng thực vật môi trường axit kiềm đất nhiễm mặn cô lập Cây trồng chuyển gen thay có hiệu quả, chúng biểu lộ nhiều loại prtein, thực thay đổi cần thiết để loại prơtêin hoạt động Hệ thống trồng chứa loại vi khuẩn nguồn bệnh động vật Thị trường hóa biến đổi gen nông nghiệp Cho đến năm 1999, diện tích gieo trồng giới đạt 40 triệu Trong 20% ngơ, 50% đậu tương 1/3 diện tích bơng Mỹ Ngồi có 70% diện tích cải dầu Canada trồng với giống biến đổi gen Khoảng 90% thực vật biến đổi gen chống chịu thuốc diệt cỏ sâu bệnh hại Cần ý rằng, Mỹ sản phẩm đậu tương có 20.000 loại thực phẩm khác Điều cho thấy rằng, công nghệ gen ảnh hưởng đến sản xuất thực phẩm Nhiều phương pháp khác phát minh để đưa gen vào tế bào mô động vật thực vật Kỹ thuật đơn giản chuyển DNA trần vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), súng bắn gen Các phương pháp phức tạp hiệu bao gồm sử dụng phức hợp lipid-DNA (liposome), vector virus, tế bào gốc phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn, chuyển gen súng bắn gen Tuỳ thuộc vào đối tượng chuyển gen mà người ta lựa chọn phương pháp chuyển gen phù hợp Nhiều nhà khoa học tin chuyển gien trồng cách hiệu rẻ tiền để sản xuất vaccine thuốc hàng loạt Lịch sử phát triển công nghệ gen thực vật chắn có nhiều kiện quan trọng Ở mốc có ý nghĩa đặc biệt nhằm làm rõ phát triển nhanh lĩnh vực Đó là, vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens sử dụng làm phương tiện vận chuyển DNA Bình thường vi khuẩn tạo nên khối u thực vật Một phần nhỏ Ti-plasmid có vi khuẩn này, gọi T-DNA, vận chuyển từ Agrobacterium vào hai mầm Năm 1980, lần DNA ngoại lai (transposon Tn7) chuyển vào thực vật nhờ A tumefaciens, nhiên T-DNA chưa thay đổi Năm 1983, nhiều nhóm nghiên cứu biến đổi T-DNA đưa DNA ngoại lai vào, tạo tính kháng số chất kháng sinh Ngồi ra, gen tạo khối u cắt DNA ngoại lai với phần lại chuyển vào thực vật biến nạp Thành công nhờ nghiên cứu xác đường lây nhiễm A tumefaciens trước khả hệ thống chọn lọc thực vật Điều cho thấy từ năm 80 kỷ 20 kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn thực cụ thể thông qua Ti-Plasmid Để làm rõ vấn đề nhóm chúng em định tìm hiểu kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thông qua Ti-plasmid II NỘI DUNG I.1 Sơ lược plasmid: I.1.1 Khái niệm Plasmid nhân tố di truyền ngồi nhiễm sắc thể, phân tử DNA kép, có kích thước từ đến 200kb Plasmid sinh sản tế bào vi khuẩn, có khả tự nhân đôi di chuyển từ tế bào sang tế bào khác Vector chuyển gen phân tử DNA dạng vịng mang đoạn gen cần biến nạp, có khả xâm nhập vào tế bào vi khuẩn kí chủ sử dụng máy tổng hợp tế bào kí chủ để tạo nhiều giống vector ban đầu I.1.2 Cấu trúc vector chuyển gen: +Có đoạn AND khởi động (promoter) Đây đoạn ADN có liên quan cần thiết cho khởi đầu phiên mã Nó thường có vị trí bám cho enzym ARN polymeraza, điểm khởi đầu phiên mã, số vị trí bám khác protein điều khiển / điều hồ q trình phiên mã +Có đoạn ADN kết thúc (terminator) Đây đoạn ADN cần thiết cho kết thúc trình phiên mã giải phóng phân tử mARN khỏi sợi khn ADN Đoạn kết thường có trật tự tín hiệu polyadenin, AATTAA AACCAA, giúp cho phân tử mARN bền vững + Một đoạn AND chịu trách nhiệm cho q trình tái bản, thường có nguồn gốc vi khuẩn VD: E.coli + Một đoạn ADN chứa trật tự nucleotid đặc trưng cho nhận biết enzyme giới hạn, thường ký hiệu MCS (multi-cloning sites) Nhờ đoạn ADN người ta dùng enzym giới hạn đặc hiệu để cắt tái tổ hợp phân tử ADN véctơ với đoạn ADN mang gen cần biến nạp + Vùng chứa gen chọn lọc (selectable marker genes) gen thị (reporter genes) I.2 Ti-plasmid Là vector chuyển gen có kích thước lớn “Ti” viết tắt “Tumour inducing” tức gây khối u • Cấu trúc Ti-plasmid Ti plasmid phân tử ADN vòng tương đối lớn, gồm 150.000-200.000 cặp nucleotit Ti-plasmid gồm vùng:  T-DNA (transferred DNA) - đoạn gen gồm 20.000-30.000 cặp nucleotit có khả thâm nhập vào genom tế bào chủ T-ADN có chứa gen gây sinh trưởng vô điều khiển tế bào thực vật Đó gen mã hố auxin cytokinin gây sinh sản vô tổ chức tế bào bị nhiễm  Đoạn vir (virulence) nơi có gen sản xuất protein cần cho biến dạng tế bào thực vật, chịu trách nhiệm chuyển nạp đoạn T-ADN từ plasmid vào genom tế bào chủ để Ti-plasmid thâm nhập  Vùng tái bản: ORI- vùng mã hóa chức tái khởi điểm tái giúp gên nhân lên tế bào  Vùng tiếp hợp: CON- vùng mã hóa chức tiếp hợp Ti plasmid tìm thấy tất dòng A.tumefaciens gây độc Chúng trì ổn định Agrobacterium nhiệt độ 30 độ C • Cơ chế hoạt động vi khuẩn) Vi khuẩn A tumefaciens không sản xuất số acid amin octopin, nopaline Để tồn tại, chuyển gen vào thực vật Ti - plasmid mang gen tổng hợp IAA, amino acide octopine hay nopalin để giúp cho vi khuẩn phát triển Trong Ti-plasmid octopine, locus tms mã hóa enzyme liên quan đến hệ thống cytokinin đột biến dẫn đến tăng sinh rễ từ khối u hình chóp gây số lồi (các thể đột biến rễ) Các locus tms tms liên quan đến tổng hợp khơng điều hịa auxin đột biến hai locus gây nên tăng sinh chồi từ khối u hình chóp nhiều loại thực vật (các thể đột biến chồi) Vì vậy, T-DNA mang gen (tms 1, tms tmr) mà sản phẩm chúng không chịu điều hịa bình thường đường chuyển hóa thực vật liên quan đến tổng hợp phytohormone điều gây kiểu hình ung thư Do gen tms 1, tms tmr xem gen ung thư Trong trinh cộng sinh này, vi khuẩn chuyển gen tổng hợp chất kích thích sinh trưởng làm tế bào nhiễm vi khuẩn phân chia vô tổ chức, gây phát sinh khối u thực vật I.3 Quá trình chuyển nạp gen vi khuẩn I.3.1 Thiết kế Ti - plasmid mang gen biến nạp Để tiến hành chuyển gen vào tế bào thực vật, ta cần có đoạn DNA mã hóa cho tính chất trội thực vật ( gen biến nạp) lấy từ tế bào thực vật Thứ 2, ta cần vòng plasmid ( vector chuyển gen), nhiên phương pháp ta sử dụng Ti – plasmid vi khuẩn Agrobacterium làm vector chuyển gen T – DNA cắt từ đoạn gen nhờ ezyme đặc hiệu, enzyme cắt giới hạn A Ti – plasmid enzyme cắt giới hạn cắt vùng T - DNA Sợi đơn T-DNA giải phóng kết hợp với protein, chỗ đứt sợi đơn thứ hai tổng hợp bổ sung lấp đầy chỗ trống Ti-plasmid Sợi T-DNA tự vận chuyển vào tế bào thực vật dạng phức hệ DNA-protein I.3.2 Nhân vòng vector nhờ vi khuẩn E.coli E.coli tế bào chủ kĩ thuật chuyển gene Nó sinh vật chuẩn để tạo dịng gen (cloning gens) sinh vật E coli coi tế bào vật chủ đơn giản công nghệ gen Vi khuẩn E coli dễ dàng chấp nhận nhiều loại vector chuyển gen plasmid hay phage qua biến nạp hay tải nạp Sau chuyển gene tế bào cho vào thể chuyền plasmid ta cấy vào vi khuẩn e.coli để nhân lên với số lượng lớn Biến nạp plasmids chứa ADN chưa tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E.coli I.3.3 Chuyển vector mang gen biến nạp từ E.coli sang A tumefaciens Tế bào vi khuẩn có khả hấp thụ DNA tự nhiên, DNA tế bào chết Dựa thay đối tính thấm màng tế bào làm cho DNA xâm nhập vào tế bào Vector trans vector nhị thể dựa plasmid tái E.coli Agrobacterium, plasmid có chứa trình tự biên T-DNA Các vector thiết kế cho trình tự biên cạnh MCS ( Multicloning site – trình tự tạo dịng) cho phép xen DNA ngoại lai vào marker cho phép chọn lọc trực tiếp tế bào thực vật biến nạp Plasmid thao tác E.coli chuyển vào qua tiếp hợp với dịng Agrobacterium mang plasmid có chứa vùng vir thiếu T-DNA trình tự lặp 25 bp Các plasmid thường thể đột biến đoạn đơn giản Ti-plasmid octopine kiểu dại kiểu nopaline Việc chuyển DNA ngoại lai vector tạo dòng vào tế bào thực vật thực hoạt động chức vùng vir pBin19 vector nhị thể phổ biến dựa đơn vị tái (replicon) vật chủ mở rộng pRK252 Vì tái E.coli Agrobacterium, cho phép xen DNA ngoại lai vào vector sàng lọc E coli trước chuyển vào Agrobacterium Vector chứa marker kháng kanamicin (K mr ) Sự xâm nhập pBin19 vào A.tumefaciens LBA4404 sử dụng plasmid hỗ trợ pRK2013 sau loại bỏ plasmid hỗ trợ Agrobacterium I.3.4 Quá vi trình khuẩn A.grobacterium chuyển plasmid vào tế bào thực vật Khi tế bào thân bị tổn thương, tế bào tổn bị thương tiết hợp chất thu hút tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens Các tế bào vi khuẩn không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chuyển nạp vào chúng loại plasmid đặc hiệu gây nên tình trạng khối u Con người lợi dụng tính chất Agrobacterium để chuyển gen vào tế bào thực vật • Q trình chuyển T- ADN từ plasmid vào gen nhân thực vật Đầu tiên sử dụng enzyme cắt để hình thành vết đứt vị trí vùng bờ phải đoạn T- AND Đoạn gen sau tách khỏi plasmid nhờ hình thành đoạn đứt thứ hai ( Đoạn đứt thường không cố định plasmid khác nhau) Trong axid nucleic trống tạo plasmid lấp đầy theo nguyên tắc bổ sung axid nucleic đoạn T- ADN tách bám protein bám sợi đơn (SSBP) Nhờ phức hợp với SSBP mà đoạn gen T- ADN chuyển vào nhiễm sắc thể chủ I.3.5 Chọn lọc mô, tế bào chuyển gen thành cơng Có nhiều phương pháp để chọn lọc mô tế bào, phương pháp gen thị thường sử dụng chuyển gen vào tế bào thực vật Xác nhận biểu luciferase, chất luciferin, phản ứng phụ thuộc vào ATP Ánh sáng tạo nên từ phản ứng định lượng máy Xác nhận biểu β-D-glucuronidase, chất nhân tạo 5bromo-4-chlor-3-indoyl-β-glucuronid (X-GlcA), chất thủy phân nhờ glucuronidase Bằng oxy hóa xuất chất indigo màu xanh Người ta sử dụng chất khác thay X-Glc, mà sản phẩm thuỷ phân chất màu phát quang I.4 Ứng dụng phương pháp chuyển gen thực tế Hiện Mỹ quốc gia đứng đầu việc đưa biến đổi gen vào sản xuất chiếm tới 59%, số quốc giá khác Argentina chiếm 20%, Canada 6,7%, Brazi 6%, Trung Quốc 4,6% Ở châu Á, trồng biến đổi gen chủ yếu bông, trồng nhiều Trung Quốc, Ấn Độ, Philippines Indonesia Có loại trồng biến đổi gen thương mại hóa mạnh Đó là: đậu tương kháng thuốc diệt cỏ, ngô kháng thuốc diệt cỏ kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ kháng sâu cải dầu kháng thuốc diệt cỏ Ngoài loại trồng biến đổi gen thương mại hóa rộng rãi nói trên, cịn có hàng loạt trồng biến đổi gen khác kháng nấm, kháng virus, chín chậm phổ biến Ứng dụng chuyển gen qua nách mần đậu tương Đậu tương chuyển gen phương pháp gián tiếp thông qua A tumefaciens lây nhiễm vào nách mầm tổn thương nuôi cấy in vitro Sơ đồ bước tiến hành phương pháp phân tích chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen thực vật nói chung chuyển gen đậu tương nói riêng hiểu đẩy đủ là: (i) gen ngoại lai (gen chuyển) phải dung hợp vào hệ gen tế bào chủ; (ii) gen chuyển phải biểu tế bào chủ; (iii) gen chuyển phải di truyền cho hệ sau; (iv) hệ sản phẩm gen chuyển phải biểu hiện, (v) sản phẩm gen chuyển biểu chức sinh học Chính q trình chọn lọc, phân tích chuyển gen hệ thực hệ thống chọn lọc tế bào mơ chuyển gen, xác định có mặt gen chuyển tế bào chủ, kiểm tra biểu gen chuyển thông qua xác định sản phẩm biểu mRNA protein phân tích biểu chức sinh học gen chuyển Thành tựu chuyển gen vào đậu tương Cải thiện protein amino acid Cải thiện thành phần dầu Cải thiện số thành phần khác Tăng cường khả kháng côn trùng vi sinh vật Tăng cường khả chống chịu điều kiện bất lợi ngoại cảnh Tăng cường khả kháng thuốc diệt cỏ III KẾT LUẬN Hiện nay, phương pháp chuyển gen vào trồng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (At) xem phương pháp có hiệu phương pháp mà qua kết chuyển gen (ở phân tích Southern blot) thường biểu kiểu tích hợp gen (DNA integration) tương đối đơn giản - phù hợp với mục tiêu nhà cơng nghệ gen Vì vậy,việc tạo chủng vi khuẩn At mang gen chuyển yêu cầu cần thiết Ưu điểm phương pháp: kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, khơng địi hỏi thiết bị đặt tiền Nhược điểm phương pháp: Phương pháp sử dụng thành công nhiều hai mầm, chưa hiệu chuyển gen mầm thấp nhiều cầy mầm lương thực quan trọng lúa, ngơ, lúa mì… Như vậy, nhờ cơng nghệ chuyển gen, người ta tạo giống đem lại nhiều lợi ích lâu dài, đặc biệt hạn chế tối đa việc sử dụng phân bón hóa học ngành trồng trọt giảm thiểu nhiễm mơi trường Ngồi ra, sản xuất loại thuốc quý, chữa bệnh cho người tạo polyme sinh học dùng bao gói, vận chuyển thuận tiện tiêu hủy, tạo lợi nhuận đáng kể cho nông dân người tiêu dùng, làm môi trường, bảo vệ môi trường hệ sinh thái bền vững IV Tài liệu tham khảo www.agbiotech.com.vn/vn/?mnu=preview&key=2312 Trung tâm kiến thức toàn cầu trồng CNSH Tài liệu phổ biến kiến thức dạng bỏ túi - Pocket K No http://vietnamnet.vn/khoahoc/xuhuong/2005/02/374986 ViệtNamNet-Xử lý tin: Trọng An kỹ thuật chuyển gen vào thực vật ứng dụng – Thủy Hồng ... bước ti? ??n hành phương pháp phân tích chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen thực vật nói chung chuyển gen đậu tương nói riêng hiểu đẩy đủ là: (i) gen ngoại lai (gen chuyển) phải dung hợp vào hệ gen tế bào. .. mang gen biến nạp Để ti? ??n hành chuyển gen vào tế bào thực vật, ta cần có đoạn DNA mã hóa cho tính chất trội thực vật ( gen biến nạp) lấy từ tế bào thực vật Thứ 2, ta cần vòng plasmid ( vector chuyển. .. xuất thực phẩm Nhiều phương pháp khác phát minh để đưa gen vào tế bào mô động vật thực vật Kỹ thuật đơn giản chuyển DNA trần vi ti? ?m (microinjection), xung điện (electroporation), súng bắn gen