Chuyen de phuong phap LC MS 1

Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Phơng pháp Sắc ký lỏng-khối phổ phân tích hợp chất hữu Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Mở đầu Trong phép phân tích công cụ sắc ký (Chromatography) phép phân tích hữu hiệu cho nghiên cứu nh kỹ tht Cïng víi sù tiÕn bé nhanh chãng cđa kü thuật điện tử tin học, phơng pháp sắc ký cho phép phân tích lợng mẫu nhỏ chất phân tích với độ xác cao thời gian phân tích nhanh Phơng pháp phổ khối lợng (MS, Mass Spectrometry) phơng pháp vật lý hoá lý nhận dạng mẫu chất với lợng nhỏ, phân tích thành phần cấu tạo hợp chất hữu vô có phạm vi ứng dụng rộng rÃi Sự kết hợp hai phơng pháp sắc ký phổ khối lợng đề tài thu hút nhiều quan tâm qua bốn thập kỷ qua Sự kết hợp phơng pháp sắc ký khí (GC, Gas Chomatography) phơng pháp phổ khối lợng (MS) thành phơng pháp sắc ký khí-phổ khối lợng (GC-MS) đợc thông báo lần vào năm 1958 trở nên thông dụng vào năm 1967 Các mẫu chất phân tích khối phổ phải nằm dạng Vì hỗn hợp mẫu chất khí mang từ cột sắc ký dẫn đa vào buồng ion hoá máy khối phổ để ion hóa mẫu chất Máy phổ khối trở thành detectơ vạn dùng cho sắc ký khí sắc ký khí phổ khối lợng có tơng thích cao (mẫu chất phân tích trạng thái khí, có độ nhạy cao tốc độ phân tích tơng tự nhau) Phơng pháp GC-MS thích hợp để phân tích hỗn hợp chất vô hữu dễ bay Phơng pháp sắc ký lỏng (LC, Liquid Chomatography) đợc sử dụng để tách tinh khiết chất lỏng khó bay tách đợc phơng pháp sắc ký khí Sự kết hợp phơng pháp sắc ký lỏng với khối phổ (LCMS) cho thuận lợi nh phơng pháp sắc ký khí khối phổ (GCMS) Phơng pháp sắc ký lỏng-khối phổ đời vào năm 1970, đợc sử dụng rộng rÃi phân tích hóa học Ngày nay, phơng pháp LC-MS đà Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu phát triển thành phơng pháp phân tích đại với kÕt nèi ion ho¸ ho¸ häc ë ¸p suÊt khÝ quyÓn (APCI, Atmospheric-Pressure Chemical Ionization), bé kÕt nèi ion hãa phun điện (ESI, Electrospray Ionization Interface) cho phép xác định phân tử có khối lợng phân tử lớn, nh chất protein, peptit oligonucleotit phân tử ion đa điện tích sử dơng phỉ biÕn c¸c lÜnh vùc hãa sinh, y dợc Trong chuyên đề Phơng pháp sắc ký lỏng khối phổ phân tích hợp chất hữu này, bớc đầu tìm hiểu phơng pháp sắc ký lỏng-khối phổ (LC-MS) với phần sau: - Phơng pháp sắc ký lỏng: chủ yếu phơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) - Các kết nối dùng cho phơng pháp sắc ký lỏng-khối phổ - Phơng pháp phổ khối lợng: máy phổ khối lợng đợc sử dụng nh detectơ hữu hiệu cho sắc ký lỏng - Một số ứng dụng phơng pháp sắc ký lỏng-khối phổ phân tích hợp chất hữu Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Giới thiệu phơng pháp sắc ký lỏng-khối phổ 1.1 Lợi ích việc kết nối sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với phổ khối lợng (MS) Trong nhiều phép phân tích, hợp chất quan tâm đợc tìm thấy hỗn hợp phức tạp, vai trò kỹ thuật sắc ký thiết lập tách thành phần hỗn hợp, cho phép nhận dạng chúng xác định số lợng Từ việc phân tích định tính, giới hạn chủ yếu phép sắc ký phân lập khả đa nhận dạng rõ ràng thành phần hỗn hợp, chí chúng đợc tách hoàn toàn khỏi Việc nhận dạng dựa sở so sánh đặc trng lu, chẳng hạn nh− thêi gian l−u cđa mét chÊt ch−a biÕt víi chất so sánh đợc xác định điều kiện thí nghiệm Tuy nhiên, có tình trạng nhiều chất mà chí đặc trng lu chất cha biết chất so sánh, giới hạn sai số thực nghiệm, không giống hệt ngời phân tích nhận định tuyệt đối hai hợp chất giống Mặc dù phạm vi điều kiện sắc ký có hiệu lực ngời phân tích nhng gây ảnh hởng hoàn toàn đến tách tất thành phần hỗn hợp phân tích điều ngăn cản tính xác xác định số lợng cách đắn chất phân tích mong muốn Khả máy sắc ký phổ thực tế phụ thuộc vào phổ khối lợng nhiều chất mà chất đà có đầy đủ phổ (th viện phổ) Điều cho phép việc nhận dạng chúng cách dễ dàng với độ tin cậy cao, nhiều không hoàn toàn nh Nếu chất phân tích nằm phần hỗn hợp phổ khối lợng nhận đợc chứa ion từ tất chất có mặt Trong trờng hợp đặc biệt, chất phân tích hỗn hợp thành phần lợng nhỏ việc nhận dạng trở nên khó khăn dờng nh Sự kết hợp khả tách phơng pháp sắc ký cho phép chất tinh khiết đợc đa vào máy phổ khối Khả nhận dạng máy Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu phổ khối rõ ràng, có thuận lợi riêng biệt cho chất tơng tự giống hệt đặc trng lu, nhng có phổ khối lợng hoàn toàn khác phân biệt đợc chất Ngoài ra, phổ khối lợng cho phép định lợng với độ xác phụ thuộc vào mức độ phức tạp hỗn hợp mẫu chất thành phần hỗn hợp Công việc riêng phép sắc ký thực đợc Phơng pháp sắc ký: - Là phơng pháp tách dành cho hỗn hợp mẫu - Nhận dạng mẫu dựa thời gian lu - Phân tích định tính đinh lợng đợc - Phân lập tinh chế chất Phơng pháp phổ khối lợng: - Là phơng pháp nhận dạng mẫu lợng nhỏ - Cho phổ khối lợng hỗn hợp phức tạp Sự kết hợp HPLC phổ khối lợng cho phép nhận dạng rõ ràng xác định số lợng hợp chất mà phơng pháp sắc ký không phân tích đầy đủ đợc 1.2 Các hợp chất phân tích đợc phơng pháp LC-MS Các hợp chất đợc phân tích phơng pháp sắc ký lỏng-khối phổ đợc phân loại nh sau: Dựa tính chất chất: - Hấp thụ không hấp thụ xạ UV-vis - Các chất bền nhiệt không bền nhiệt - Các chất không bay - Các hợp chất phân cực đến ion - Các phân tử nhỏ đến lớn Dựa vào loại hợp chất: - Các thuốc tổng hợp chất chuyển hóa Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu - Các hợp chất thiên nhiên (ancaloit, glycozit, taxan, chất độc, saccarit, vitamin, lipid, v.v) - Các peptit protein - Các thuốc trừ sâu không bay chất diệt cỏ, v.v - Các chất hoạt động bề mặt, chất nhuộm lợng lớn chất phụ gia hữu 1.3 Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng-khối phổ Một máy sắc ký lỏng khối phổ bao gồm phận (hình 1.1): - Máy sắc ký lỏng (LC, Liquid Chromatography): thông thờng sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) - Bé kÕt nèi (Interface): cã nhiƯm vơ lo¹i dung môi rửa giải đa mẫu chất vào buồng ion hoá máy phổ khối Đây kỹ thuật chìa khoá phơng pháp LC-MS - Máy phổ khối lợng (MS, Mass Spectrometry) HPLC - Dung dịch nớc/ dung môi hữu với dung dịch đệm - Các hợp chất không bay MS Bộ kết nối - Loại dung môi - Ion hóa phân tử chất phân tích - Chân không cao - Phân tích ion, m/z Hình 1.1 Sơ đồ máy sắc ký lỏng khối phổ Dới xét cụ thể phận máy sắc ký lỏng-khối phổ (phần 2, 4) Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Phơng pháp Sắc ký lỏng (LC) 2.1 Giới thiệu chung phơng pháp sắc ký Có nhiều phơng pháp tách nhng phòng thí nghiệm phân tích phơng pháp sắc ký đợc dùng rộng rÃi Nguyên nhân tính phổ biến ngời phân tích việc đa mẫu (đà đợc hoà tan vào pha động) chảy qua cột chứa pha tĩnh, trình tách tơng ứng với hàng ngàn giai đoạn cân xảy Nh vậy, phơng pháp sắc ký phơng pháp hoá lý dùng để tách cấu tử hỗn hợp phức tạp khí, hơi, chất lỏng chất rắn điều kiện thờng) hoà tan dựa vào sử dụng trình sắc ký khác điều kiện động Phân loại phơng pháp sắc ký Các phơng pháp sắc ký đợc phân loại theo pha động pha tĩnh (xem sơ đồ hình 2.1) Phơng pháp sắc ký GC LC (Pha ®éng khÝ) (Pha ®éng láng) GSC GLC HPLC IEC Chó thÝch: GC: S¾c ký khÝ GLC: S¾c ký khÝ láng GSC: S¾c ký khÝ r¾n LSC LLC PBC SeC AC IC LC: S¾c ký láng HPLC: S¾c ký láng hiệu cao LSC: Sắc ký lỏng rắn; IEC: Sắc ký trao đổi ion ; IC: Sắc ký ion LLC: Sắc ký lỏng lỏng PBC: Sắc ký pha liên kết SEC: Sắc ký loại trừ AC: Sắc ký lực Hình 2.1 Phân loại phơng pháp sắc ký theo pha động pha Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Quá trình tách sắc ký Phơng pháp sắc ký có điểm khác biệt với phơng pháp vật lý hóa học tách chất khác hai pha thực tế không trộn lẫn vào đợc cho tiếp xúc: pha tĩnh pha động Mẫu vào pha động đợc mang dọc theo hệ thống sắc ký (cột, phẳng) có chứa pha tĩnh phân bố khắp Các cấu tử mẫu khí chịu đợc tơng tác (những phân bố) lặp lại pha động pha tĩnh, dẫn đến kết chúng đợc tách dần thành dải pha động vào lúc cuối trình cấu tử tách theo trật tự tăng tơng tác với pha tĩnh Các cấu tử tơng tác yếu trớc, cấu tử bị lu giữ mạnh sau dới dạng đỉnh (pic) tách riêng rẽ đợc ghi lại giấy gọi sắc ký đồ ngoại Một hỗn hợp đơn giản gồm hai chất A B (với lực tơng tác A nhỏ B) có trình tách theo thời gian đợc biểu diễn hình 2.2 Đa mẫu vào (hốn hợp (A+B)) Cột (pha rắn) Detectơ Cờng độ tín hiệu Pha động động Sắc đồ Thời gian Hỗn hợp (A+B) Hợp chất A (nhanh) Hỵp chÊt A Hỵp chÊt B (chËm) Hỵp chÊt B Hình 2.2 Sơ đồ trình tách sắc ký sắc ký đồ ngoại hỗn hợp đơn giản hai cấu tử A B 2.2 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 2.2.1 Cơ sở phơng pháp HPLC Từ sắc ký lỏng nói chung phơng pháp hiệu cao (HPLC) nói riêng đời vào thời gian cuối năm 60 kỷ XX, sắc ký lỏng Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu đà phát triển nhanh thành phơng pháp quan trọng toàn diện phơng pháp phân tích công cụ đại HPLC đời nhờ có tiến mặt sản xuất công cụ Việc sử dơng pha tÜnh cã kÝch th−íc nhá, ¸p st cao làm tăng tốc độ pha động qua cột, detectơ phát đặc hiệu, không cần biến đổi tính chất hóa học mẫu thử làm cho hiệu tách phơng pháp HPLC hẳn phơng pháp sắc ký lỏng cổ điển Trên sở độ phân cực pha tĩnh pha động chia sắc ký lỏng thành phơng pháp sau (hình 2.3) Độ ph©n cùc cđa pha tÜnh Ion Ph©n cùc Không phân cực Không Phân phân cực cực Ion Độ phân cực pha ®éng S¾c ký pha th−êng (Normal phase chromatography) S¾c ký pha đảo (Reversed phase chromatography) Sắc ký cặp ion (Ion pair chromatography) Sắc ký ion (Ion chromatography) Hình 2.3 Phân loại sắc ký lỏng theo độ phân cực pha tĩnh pha động Trong phơng pháp sắc ký lỏng: - Pha động: chất lỏng - Pha tĩnh: chất rắn lỏng - Mẫu chất đợc hòa tan pha động để phân tích Các đại lợng đặc trng HPLC + Sắc đồ (pic) đờng cong rưa gi¶i (tÝn hiƯu phơ thc thêi gian) sau mét trình tách sắc ký (dạng hình 2.4) Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu c¬” tR TÝn hiƯu Pic H H A W1/2 W Thêi gian a/ H1/2 b/ tR : thêi gian l−u A : diƯn tÝch pic H : chiỊu cao pic H : chiỊu cao pic H1/2 : nưa chiỊu cao pic W : độ rộng đáy pic W1/2 : độ rộng đáy pic nửa chiều cao Hình 2.4 Các thông số sắc đồ (pic) HPLC + Thời gian lu tR thời gian cần thiết tính từ bơm mẫu vào cột đến lúc chất tan đợc rửa giải điểm có nồng độ cực đại + Thời gian chết (thời gian không lu giữ) to thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thèng t¸ch + Thêi gian l−u thùc tRi = thêi gian l−u tR - thêi gian chÕt to + HÖ số tách hai chất A B sắc đồ tỷ số thời gian l−u cđa hai chÊt (α = (tRiA/ tRiB)) + ThĨ tích lu VR thể tích pha chảy qua cột sắc ký khoảng thời gian từ lúc bơm bơm mẫu vào cột đến lúc chất tan đợc rửa giải điểm có nồng độ cực đại (ứng víi thêi gian l−u tR) + HƯ sè dung l−ỵng k đại lợng đặc trng cho chất, tỷ số khối lợng chất tan i phân bố pha Hệ số dung lợng không phụ thuộc vào tốc độ nh chiều dài cột mà phụ thuộc vào chất chất phân tích k'= mS t t −t = Ri = R o mM to to Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Ngoài ra, có thiết bÞ phỉ khèi tø cùc bÉy ion (Quadrupole Ion-trap analyser), đơn giản nh bẫy ion (ion-trap), tứ cực ba chiều (hình 4.6) Loại thiết bị bao gồm điện cực vòng (ring electrode) với nhiều điện cực, điện cực đầu cột (end-cap electrode) dới Trái thiết bị tứ cực trên, ion sau vào bẫy ion theo đờng cong ổn định đợc bẫy lại điện áp RF đợc đặt điện cực vòng Các ion khác m/z sau trở nên không ổn định có hớng phía detectơ Do điện áp RF khác hệ thống mà thu đợc phổ khối đầy đủ Máy phát điện RF Nguồn cung cấp DC Máy Điện AC bổ trợ Dây tóc Hình 4.6 Sơ đồ mét thiÕt bÞ phỉ khèi kÕ tø cùc bÉy ion Hình 4.7 dới mô tả thiết bị phổ khối kế tứ cực đơn giản máy LC-MS có nèi víi bé kÕt nèi APCI hay ESI 30 Chuyªn đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Chân không cao Chân không thấp áp suất khí quyÓn + ++++ + ++++ ++++++ + + + + + ++ + + + + ESI APCI Bơm quay TMP1 TMP2 Tø cùc Bé kÕt nèi H×nh 4.7 Một thiết bị phổ khối kế tứ cực đơn giản máy LC-MS Ví dụ, hợp chất Forskolin (C22H34O7), ditecpen, đợc phân tích LCMS với điều kiện phân tích cột LC: ODS (75 x 4,6mm); hệ dung môi: CH3CN/ nớc (80:20); phát ESI Bảng 4.1 nêu pic khối lợng loại ion mảnh đo chế độ ion hóa dơng (positive) âm (negative) sắc ký đồ phân tích LC phổ khối lợng đo chế độ đợc hình 4.8 Bảng 4.1 Các pic khối lợng loại ion mảnh đo chế độ ion hóa dơng (positive) âm (negative) Chế độ MS Dơng (Positive) Âm (Negative) Pic phổ (m/z) Ion Lo¹i ion 474 433 411 [M+Na+ACN]+ [M+Na]+ [M+H]+ Ion céng Na solvat hãa Ion céng Na 393 375 357 333 315 297 [M+H-H2O]+ [M+H-2H2O]+ [M+H-3H2O]+ [M+H-H2O-HAc]+ [M+H-2H2OHAc]+ [M+H-3H2OHAc]+ 409 [M-H]- Ion proton hoá Ion proton hóa với phần tử trung hoà bị phân tử nhỏ Ion deproton hóa 31 Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Int CH3 O STIC(1.00) OH CH3 7500e3 CH2 CH3 O O OH 5000e3 O H3C 2500e3 2.5 5.0 H CH3 CH3 H OH Forskolin C22H34O7 MW: 410 7.5 a/ [MH-2H2O]+ Int 1000e3 375 Positive [M+H]+ 750e3 433 500e3 474 297 315 250e3 0e3 141 163 150 203 200 333 357 350 255 237 279 250 300 350 393 411 400 Int 449 457 490510 534553 580 450 500 550 m/z [M-H]- 409 Negative 100000 75000 50000 25000 106 134 150 173 349 335 368 395 201 225 246 273 200 250 300 350 400 445 426 450 479 508 537 500 574 550 m/z b/ Hình 4.8 Sắc ký đồ phân tích LC (a) phổ khối lợng đo chế độ ion hóa dơng (positive) âm (negative) (b) 32 Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu ứng dụng phơng pháp sắc ký lỏng-khối phổ Phơng pháp sắc ký lỏng-khối phổ đợc ứng dụng để phân tích lĩnh vực sau: - Các nghiên cứu hoá sinh khoa học sống - Hóa công nghiệp - Môi trờng (thuốc trừ sâu không bay hơi, chất diệt cỏ) - Thực phẩm (thành phần, chất phụ gia chất bÃ) - Dợc phẩm (tổng hợp phát minh loại thuốc) - Các hợp chất thiên nhiên (nhận dạng tinh chế) - Các lĩnh vực khác có liên quan đến hóa học Dới số ví dụ phân tích hợp chất hữu phơng pháp sắc ký lỏng-khối phổ 5.1 Phân tích fulleren phơng pháp LC-MS Các fulleren (C60) đà gây đợc nhiều ý kể từ chúng đợc phát Kroto va Smalley Chóng cã cÊu tróc gièng nh− mét bóng đá (soccer-ball), bao gồm vòng năm vòng sáu liên kết với (hình 5.1) Hình 5.1 Cấu trúc C60 Các fulleren thú vị với cấu trúc chúng mà có tính chất cách điện siêu dẫn kim loại kết hợp bên fulleren 33 Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Hiện nay, fulleren đợc ứng dụng làm vật liệu bán dẫn siêu dẫn loại vật liệu chẳng hạn nh loại plastic Phơng pháp MALDI (matrix assisted lazer desorption/ionization) đà đợc sử dụng cho việc phân tích fulleren Hình 5.2 phổ khối lợng C60 (MW-molecular weight 720) nhận đợc sử dụng máy phân tích Shimazu/Kratos KOMPACT MALDI IV Ion phân tử đợc phát lazer desorption/ionization Hình 5.2 Phổ khối lợng C60 Hình 5.3 mẫu phân tích LC-MS hỗn hợp C60 C70 sư dơng bé ph¸t hiƯn ACPI (Atmospheric-Pressure Chemical Ionization, ion hoá hoá học áp suất khí quyển) Khi đo chế độ phát ion âm, C60 C70 phát ion với khối lợng khối lợng phân tử chúng tơng ứng m/z 720 m/z 840 Mặc dù khó khăn cho việc nhận dạng tõ s¾c phỉ ion tỉng (TIC, total ion chromatogram), mét sè l−ỵng vÕt cđa C76 (m/z 912), C78 (m/z 936) C84 (m/z 1008) đợc nhận dạng Hình phổ khối lợng C60 C70 Các điều kiện phân tích đợc nêu bảng 5.1 34 Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Bảng 5.1 Các điều kiện phân tích LC-MS Cột Pha động Tốc độ dòng Thể tích bơm mẫu Điện áp cực dò Nhiệt độ cột Nhiệt độ cực dò Dòng khí sơng mù Điện áp CLD §iƯn ¸p DEFs : STR ODS-II (4,6 mml.Dx150mm) : 70% hexan-2-propanol : 1,0 mL/phót : 20 uL : -4,5 kV (chÕ ®é APCI-Negative) : 30oC : 400oC : 2,5 L/phót : +51V : -70V Hình 5.3 Sắc phổ khối lợng fulleren Hình 5.4 Phổ khối lợng C60 C70 35 Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu 5.2 Phân tích chất hoạt động bề mặt anionic phơng pháp LC-MS Các chất hoạt động bề mặt đợc sử dụng rộng rÃi lĩnh vực khác công nghiệp, bao gồm sản phẩm chất tẩy rửa tổng hợp dùng gia đình nhờ tính chất làm giảm sức căng bỊ mỈt cđa chóng HiƯn nay, cïng víi sù gia tăng vấn đề ô nhiễm môi trờng, nhà khoa học quan tâm tới ảnh hởng chất hoạt động bề mặt, bao gồm nớc thải sinh hoạt công nghiệp môi trờng sống Có nhiều loại chất hoạt động bề mặt, nh chất hoạt động bề mặt anionic, cationic, chất ion Trong ví dụ dới phân tích chất hoạt động bề mặt alkyl phenyl polyoxyetylen sunfonat Sắc phổ khối lợng phổ khối lợng alkyl phenyl polyoxyetylen sunfonat đợc tơng ứng hình 5.5 hình 5.6 điều kiện phân tích nh bảng 5.2 Các thành phần chất hoạt động bề mặt, bao gồm chất có số cacbon khác đợc nhận dạng xác xác định số lợng sắc ký đồ khối lợng với số khối lợng đặc trng Bảng 5.2 Các điều kiện phân tích LC-MS chất hoạt động bề mặt alkyl phenyl polyoxyetylen sunfonat Cét Pha ®éng A Pha ®éng B Chơng trình gradient Tốc độ dòng Thể tích bơm mẫu Điện áp cực dò Nhiệt độ cột Nhiệt độ cực dò Nhiệt độ CDL Nhiệt độ lò Dòng khí sơng mù Điện áp CLD Điện áp DEFs Q-array RF Vùng quÐt : Shimazu Shim-pack VP-ODS (2,0 mml.Dx150mm) : n−íc chøa 10mM amoni axetat ®iỊu chØnh pH4 víi axit axetic : axetonitril : 50%B-90%B (10 phót)-90%B (16 phót)-50%B (16,01-26 phót) : 0,2 mL/phót : uL : -3,5 kV (chÕ ®é ESI-Negative) : 40oC : 400oC : 200oC : 200oC : 4,5 L/phót : C-mode : -70V : chÕ ®é qt : m/z 450-1500 (2 sec/ scan) 36 Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Hình 5.5 Sắc phổ khối lợng alkyl phenyl polyoxyetylen sunfonat 37 Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Hình 5.6 Phổ khối lợng alkyl phenyl polyoxyetylen sunfonat 5.3 Phân tích aflatoxin phơng pháp LC-MS Các aflatoxin chất độ đợc sinh chất mốc Chúng trở nên tiếng qua lây nhiễm dẫn đến kết chết khối lợng lớn trồng nớc Anh vào năm 1960 Chất mốc (Aspergillus) sinh aflatoxin nhóm trồng nh lạc ngô gây hại cho sức khoẻ ngời Các aflatoxin nguyên nhân gây ung th ngời, việc phân tích aflatoxin quan trọng vệ sinh an toàn thực phẩm Họ chất aflatoxin đà đợc biết đến bao gồm B1, B2, G1 G2 (hình 5.7) 38 Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Hình 5.7 Cấu trúc aflatoxin Từ cấu trúc phân cực aflatoxin việc phân tích thông thờng sử dụng sắc ký lỏng tốc độ cao với cột pha thờng detectơ quang Tuy nhiên, ví dụ dới mô tả việc phân tích aflatoxin sử dụng phơng pháp LC-MS với cột pha đảo (điều kiện phân tích bảng 5.3) Phơng pháp ACPI (Atmospheric-Pressure Chemical Ionization, ion hoá hoá học áp suất khí quyển) đợc sử dụng cho phép phân tích aflatoxin tơng đối phân cực chúng chứa nhiều phân tử oxy Hình 5.8 sắc đồ khối lợng aflatoxin điển hình B1, B2, G1 G2, hình 5.9 cho thấy phổ khối thành phần Bảng 5.3 Điều kiện phân tích LC-MS aflatoxin G2, G1, B2 B1 Cột Pha động A Chơng trình gradient Tốc độ dòng Thể tích bơm mẫu Điện áp cực dò Dòng khí sơng mù Điện áp CDL Vùng quÐt : Shimazu Shim-pack VP-ODS (2,0 mml.Dx150mm) Pha ®éng B : n−íc : 20%B (0 phót) -> 80%B (16 phót) NhiƯt ®é cét : 0,2 mL/phót :10 uL NhiƯt ®é cực dò : +4.5 kV (chế độ APCI-positive) : 2,5 L/phút Điện áp DEFs : -20 V : m/z 100-500 (1.0 sec/scan) : metanol : 40oC : 400oC : +50 V 39 Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Hình 5.8 Các sắc đồ khối lợng aflatoxin điển hình APCI phơng pháp ion hoá mềm, aflatoxin nhận phân tử thêm proton (protonated molecular) vào nh pic Phổ khối lợng dÃy aflatoxin G mảnh ion decacboxyl hóa từ phân tử thêm proton Khi mảnh ion phản xạ dù vòng E lacton xeton, nhận dạng đợc thành phần họ aflatoxin Phơng pháp LC-MS phơng pháp phân tích nhanh, phát nhạy định lợng đợc Phơng pháp đợc sử dụng cho mục tiêu nhận dạng pic thành phần nh pic khác aflatoxin (đợc mô tả LC-MS Application Data Sheet No 023) 40 Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Hình 5.9 Phổ khối lợng aflatoxin G2, G1, B2 B1 5.4 Phân tích flavanon glycozit phơng pháp LC-MS Flavonoit phân bố rộng rÃi giới thực vật, có lớp chất quan trọng nh flavanon, flavon, isoflavon flavonol Phần lớn flavonoit tồn thiên nhiên dới dạng glycozit với nhóm phenolic hydroxyl Hình 5.10 cấu trúc flavanon glucozit poncirin, naringin vµ hesperidin Sư dơng bé kÕt nèi APCI với ion âm (negative ion), LC-MS dò tìm ion (MH)- đợc tạo deproton hóa từ phân tử 41 Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Hình 5.10 Cấu trúc flavanon glycozit Hình 5.11 sắc đồ tổng ion (total ion chromatogram, TIC) dịch lọc nớc ép từ Citrus unshu Trong tạp chất đợc phát pic naringin hesperidin đợc nhận dạng với thời gian tơng ứng 6,5 đến 8,0 phút Các mảnh ion naringin hesperidin nhận đợc tơng ứng từ m/z 271 m/z 301, ion phần aglycon (flavanon) Cũng nh vậy, porcirin đợc nhận dạng việc sử dụng phép sắc ký khối lợng nh hình 5.12 Hình 5.13 phổ khối lợng hợp chất Điều kiện phân tích LC-MS dịch lọc nớc ép đợc nêu bảng 5.4 Bảng 5.4 Điều kiện phân tích LC-MS dịch lọc nớc ép từ Citrus unshu Cột Pha động Tốc độ dòng Thể tích bơm mẫu Nhiệt độ cột Nhiệt độ cực dò Điện áp cực dò Dòng khí sơng mù Điện ¸p CDL §iƯn ¸p DEFs : Inertsil ODS-3 (2,1 mml.D x 250mm) : 75% axetonitril-n−íc chøa 1% axir axetic : 0,2 mL/phót :10uL : 45oC : 400oC : -4,5 kV (chÕ ®é ACPI-negative) : 2,5 L/phót : + 54V : -38 V 42 Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Hình 5.11 TIC dịch lọc nớc ép Hình 5.12 Sắc phổ khối lợng chất từ dịch lọc nớc ép Hình 5.13 Phổ khối lợng poncirin, naringin hesperidin từ dịch lọc nớc ép 43 Chuyên đề Phơng pháp LC-MS phân tích hợp chất hữu Ti liệu tham khảo Tiếng Việt: Phạm Luận, Giáo trình sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), Hà Nội, 1997 Nguyễn Đức Huệ, Các phơng pháp phân tích hữu cơ, Nhà xuất Đại học Quốc gia, 2005 Nguyễn Đình Triệu, Các phơng pháp vật lý hoá lý (tập 2)-Phơng pháp phổ khối lợng, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội, 2005 Tiếng Anh: Các tài liệu hÃng SHIMAZU-COPORATION, Tokyo, Japan Robert E Ardrey, Liquid chromatography-mass spectrometry: an introduction, John Wiley & Sons Ltd, England, 2003 44 ... trớc detectơ chất tan detectơ chọn lọc (selective detector) detectơ cho dung môi detectơ không giới hạn (general detector) Một detectơ HPLC đợc sử dụng rộng rÃi detectơ UV, detectơ đóng vai trò detectơ... 7.5 a/ [MH-2H2O]+ Int 10 00e3 375 Positive [M+H]+ 750e3 433 500e3 474 297 315 250e3 0e3 14 1 16 3 15 0 203 200 333 357 350 255 237 279 250 300 350 393 411 400 Int 449 457 490 510 534553 580 450 500... hiệu M+ 4 .1. 2 Thiết bị khối phổ: Thiết bị phổ khối đợc chế tạo J Thomspon (19 12) vµ F W Aston (19 19) nh−ng thiÕt bị hoàn thiện đợc chế tạo năm 19 32 Sơ đồ chung máy khối phổ đợc hình 4 .1 Nạp mẫu