TIỂU LUẬN XÁC ĐỊNH PROTEIN TRONG SỮA VÀ GLUTEN TRONG BỘT MÌ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HOÁ HỌC VÀ THỰC PHẨM —ӂӂ— TIỂU LUẬN MÔN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH PROTEIN TRONG SỮA VÀ GLUTEN TRONG BỘT MÌ GVHD: ThS Lê Hồng Du Sinh viên thực hiện: 1/ Trần Thị Thuý An MSSV: 14116001 2/ Trần Thị Ngọc Linh MSSV: 14116085 3/ Phan Như Ngọc MSSV: 14116100 4/ Hoàng Thị Hạnh Nhân MSSV: 14116104 5/ Lâm Thị Thanh Trúc MSSV: 14116182 TPHCM, 2016 MỤC LỤC LỜI NÓI ĐẦU 1 TỔNG QUAN VỀ PROTEIN .2 1.1 Phân loại nghiên cứu chung .2 1.2 Vấn đề phân tích protein thực phẩm .2 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH PROTEIN TRONG SỮA 2.1 Các loại protein có sữa 2.1.1 Casein 2.1.2 Whey protein 2.1.3 Protein thiểu số .3 2.2 Các phương pháp xác định protein sữa 2.3 Định lượng protein sữa bằng phương pháp Lowry 2.3.1 Nguyên tắc 2.3.2 Cách tiến hành 2.3.2.1 Dụng cụ thiết bị .3 2.3.2.2 Chuẩn bị mẫu hóa chất 2.3.2.3 Quy trình thực 2.3.2.4 Tính kết 2.3.3 Ưu điểm nhược điểm .5 2.4 Định lượng protein sữa bằng phương pháp Bradford (1976) 2.4.1 Nguyên tắc 2.4.2 Cách tiến hành 2.4.2.1 Dụng cụ thiết bị .6 2.4.2.2 Chuẩn bị mẫu hóa chất 2.4.2.3 Quy trình thực .6 2.4.2.4 Tính kết 2.4.3 Ưu điểm nhược điểm PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GLUTEN TRONG BỘT MÌ 3.1 Khái quát gluten .7 3.1.1 Định nghĩa 3.1.2 Thành phần 3.1.2.1 Gliadin 3.1.2.2 Glutenin .8 3.2 Các phương pháp xác định gluten bột mì .8 3.3 Xác định hàm lượng gluten bằng phương pháp thủ công 3.3.1 Nguyên tắc 3.3.2 Chuẩn bị 3.3.3 Tiến hành 3.3.4 Ưu điểm nhược điểm 10 3.4 Xác định hàm lượng gluten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) 11 3.4.1 Giới thiệu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 11 3.4.1.1 Khái niệm 11 3.4.1.2 Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu cao .11 3.4.1.3 Nguyên tắc hoạt động hệ thống SE – HPLC 12 3.4.2 Chuẩn bị 12 3.4.3 Tiến hành 13 3.4.4 Kết 14 3.4.5 Ưu điểm nhược điểm 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO .16 MỤC LỤC HÌNH Hình 1: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 12 Hình 2: Kết SE-HPLC protein bột mì .15 MỤC LỤC BẢNG Bảng 1: Lập đồ thị nồng độ protein Bảng 2: Kết khảo sát hàm lượng gluten bột mì số 8, 11 13 10 LỜI MỞ ĐẦU Protein thành phần quan trọng thực phẩm cung cấp tiền chất cần thiết cho trình sinh tổng hợp thể Ngồi ra, protein trực tiếp tham gia vào việc tạo nên hương vị thực phẩm hay tham gia vào phản ứng nhiệt enzyme để tạo nên chất màu, chất mùi trình chế biến bảo quản Protein đóng vai trị quan trọng việc tạo nên tính chất vật lý thực phẩm qua khả tạo ổn định hệ gel, bọt, nhũ tương cấu trúc sợi [1] Mỗi loại thực phẩm khác chứa hàm lượng protein khác đặc trưng cho loại thực phẩm việc phân tích hàm lượng protein thực phẩm có vai trị quan trọng việc xác định hàm lượng dinh dưỡng, định giá thực phẩm dựa hàm lượng protein, khảo sát tính chất sản phẩm thực phẩm, xác định số tính sinh học,… [2] Ở báo cáo này, chúng tơi xin trình bày phương pháp xác định hàm lượng protein có sữa hàm lượng gluten có bột mì 1 TỔNG QUAN VỀ PROTEIN [2] [3] 1.1 Phân loại nghiên cứu chung: Protein thành phần phong phú thiếu tất thể sống Protein tảng cấu trúc chức thể sinh vật Protein thực phẩm phức tạp, lại chỉ tiêu quan trọng để xác định giá trị dinh dưỡng thực phẩm Chỉ tảng protein cao tính chất sinh học cấu tư khác thể đầy đủ Các protein có khối lượng phân tư lớn khác nhau, từ khoảng 5000 đến 100000000 Dalton Chúng bao gồm nguyên tố gồm C, H, O, N Một số cịn có chứa lượng nhỏ S Chủ yếu bao gồm -amino acid liên kết với bằng liên kết peptide Protein phân loại dựa vào hình dạng, thành phần, cấu trúc chức sinh học, khả hịa tan chúng Trong thực phẩm, protein có nhiều cấu trúc khác dạng sợi, xoắn hay dạng cầu (hình hạt, hình bầu dục) Dựa vào thành phần hóa học mà protein hình cầu phân thành hai nhóm lớn Protein đơn giản Protein phức tạp 1.2 Vấn đề phân tích protein: Việc phân tích protein thực phẩm phức tạp thực tế có số thành phần thực phẩm có tính chất hóa lý gần tương tự với protein Các chất khơng phải protein có chứa nitrogen amino acid tự do, peptide nhỏ, nucleic acids, phospholipids số vitamin, v.v… gây khó khăn cho việc phân tích Rất nhiều phương pháp khác đã nghiên cứu phát triển nhằm đo lường hàm lượng protein thực phẩm Những nguyên tắc phương pháp bao gồm việc xác định Nitro, liên kết peptide, hấp phụ tia cực tím protein, v.v… Việc lựa chọn sư dụng phương pháp phải dựa vào độ nhạy, độ xác, tốc độ chi phí phân tích, ngồi cịn phải xét đến ứng dụng cụ thể để lựa chọn phương pháp cho phù hợp PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH PROTEIN TRONG SỮA 2.1 Các loại protein có sữa [4] Sữa có chứa hàng trăm loại protein hầu hết số chỉ chiếm lượng nhỏ Protein phân loại theo nhiều cách dựa vào tính chất hóa học hay vật lý, chức sinh học chúng Thông thường, người ta phân loại protein sữa thành casein, whey protein protein thiểu số 2.1.1 Casein Casein tên nhóm protein chủ yếu sữa Casein có mặt tất sữa động vật, bao gồm sữa người Trong sữa bò, casein chiếm 75-85% tổng số protein Các dạng casein: αs-casein (47-57%), β- casein (25-35%) κ-casein (8-15%) Casein tồn dạng micelle casein 2.1.2 Whey protein Whey protein (protein hòa tan) thuật ngữ thường dùng từ đồng nghĩa với protein huyết sữa, nên dùng để chỉ protein whey từ trình sản xuất mát Ngồi protein huyết sữa, whey protein cịn chữa đoạn phân tư casein bị tách rời q trình đơng tụ men dich vị sữa Một số protein huyết sữa tồn với nồng độ thấp sữa gốc Điều biến tính nhiệt q trình trùng sữa trước làm phomat 2.1.3 Protein thiểu số Protein thiểu số bao gồm màng hạt cầu béo (membrane protein) enzyme Một số protein thiểu số phổ biến: protein màng, lactoperoxidase, phosphate, lipase… 2.2 Các phương pháp xác định protein sữa Có nhiều phương pháp để phân tích protein sữa, ví dụ định lượng protein theo phương pháp Kjeldahl, Bradford, Lowry, quang phổ, v.v… Trong phần này, chúng tơi sẽ giới thiệu hai quy trình xác định protein sữa theo phương pháp Bradford phương pháp Lowry 2.3 Xác định protein sữa bằng phương pháp Lowry 2.3.1 Nguyên tắc [5] [6] Phương pháp Lowry kết hợp phản ứng biuret phản ứng với thuốc thư Folin– Ciocalteau phenol (acid phosphomolybdic-phosphotungstic) lên gốc tyrosine tryptophan có protein (Hình 1) Phức màu xanh tạo thành có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 750 nm (độ nhạy cao cho nồng độ protein thấp) 500 nm (độ nhạy thấp cho nồng độ protein cao) Có thể tính hàm lượng protein sữa dựa vào đường chuẩn protein dựa vào phản ứng màu protein với thuốc thư Folin Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein 2.3.2 Cách tiến hành [5] [6] 2.3.2.1 Dụng cụ thiết bị Dung dịch protein chuẩn có 10 - 100 g protein/1ml Dung dịch chuẩn: Albumin 0.1, thường huyết bị (BSA - bovine serum albumin) Bình định mức 25 ml Pipet ml 0.5 ml Ống nghiệm Thiết bị: máy so màu quang điện 2.3.2.2 Chuẩn bị mẫu hóa chất Dung dịch nghiên cứu (sữa) pha loãng đến phạm vi thích hợp (10 - 100 g/1ml) Dung dịch A: Na2CO3 hòa tan NaOH 0.1N Dung dịch B: CuSO4.5H2O pha dung dịch natri citrat Dung dịch C: hỗn hợp dung dịch A dung dịch B với tỉ lệ 49:1 Dung dịch Folin có nồng độ 1N Cách pha dung dịch Folin: pha bình cầu tích 2L Cân 100 g natri tungstat (natri wonfamat (Na2WO4.2H2O) 25 g natri molypdat (Na 2MoO4.2H2O) cho vào bình cầu đáy trịn nút nhám Thêm vào 700 ml nước cất 500 ml acid ortho phosphoric 85 (H3PO4), khuấy tan thêm vào 100 ml HCl tinh kiết đậm đặc tiếp tục khuấy Đun sôi hỗn hợp bình cầu đáy trịn dung tích lít có ống sinh hàn làm lạnh hồi lưu 10 giờ Sau đun hồi lưu thêm vào 150 g lithium sulfat (Li2SO4.H2O) tinh khiết Khuấy tan hoàn tồn cho vào - 10 ml nước Brom khuấy đun sôi ở tủ hotte 15 phút (khơng có ống làm lạnh hồi lưu) để đuổi lượng brom thừa Chú ý dung dịch phải có màu vàng, dung dịch có màu xanh phải xư lý với Brom lần thứ hai sau làm nguội dung dịch ở nhiệt độ thường Để vào bình định mức lít định mức đến vạch (có thể lọc dung dịch không trong) Đựng chai thủy tinh nút nhám có màu nâu, cất giữ ở nơi lạnh, sau - tháng, dung dịch chuyển sang màu xanh thêm vài giọt Brom đun sơi 15 phút cho dung dịch có màu vàng trở lại Trước dùng phải pha loãng thuốc thư bằng nước cất đến nồng độ 0.5N 2.3.2.3 Quy trình thực hiện a) Chuẩn bị mẫu thí nghiệm nghiên cứu Cho vào ống nghiệm ml dung dịch mẫu (sữa), thêm vào ống nghiệm ml dung dịch C, lắc đều, để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng Sau thêm 0.5 ml thuốc thư Folin, lắc để yên 30 - 90 phút, lúc dung dịch sẽ chuyển từ màu vàng sang màu xanh Tiếp theo sẽ đem đo độ hấp thu ở bước sóng 750 nm ghi nhận mật độ quang học dung dịch nghiên cứu Thực tương tự với ống đối chứng bằng cách thay ml dung dịch mẫu bằng ml nước cất b) Lập đồ thị chuẩn Lấy sáu ống nghiệm đánh số từ đến cho vào chất theo bẳng sau: Ớng số Protein 0.1 (ml) Nước cất (ml) Nờng độ protein (mg/ml) Dung dịch C (ml) Thuốc thử Folin (ml) 0,00 10,00 0,5 0,50 9,50 50 0,5 1,00 9,00 100 0,5 1,50 8,50 150 0,5 2,00 8,00 200 0,5 2,50 7,50 250 0,5 OD Bảng 1: Lập đờ thị nờng độ protein Trình tự thao tác tương tự phần dung dịch thí nghiệm Sau đem đo độ hấp thu ống ở bước sóng 750 nm Từ xây dụng đồ thị chuẩn 2.3.2.4 Tính kết Dựa vào bảng 1, lập đồ thị ta lấy trị số mật độ quang ống từ - trừ mật độ quang ống Kết thu độ hấp thu thực dung dịch protein chuẩn, từ ta lập đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang theo nồng độ protein chuẩn, với trục hoành nồng độ protein trục tung mật độ quang Tương tự độ hấp thu thực protein có ống thí nghiệm trị số mật độ quang ống thí nghiệm trừ ống đối chứng Sau đối chiếu vào đường cong mẫu suy lượng protein có mẫu sữa đem thí nghiệm 2.3.3 Ưu điểm nhược điểm [2] Ưu điểm: Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao bị ảnh hưởng bởi độ đục mẫu, cụ thể nhiều so với số phương pháp khác tương đối đơn giản, hồn thành vòng - 1.5 giờ Nhược điểm: Màu sắc không thật tỷ lệ chặt chẽ với nồng độ protein 2.4 Định lượng protein sữa bằng phương pháp Bradford (1976) 2.4.1 Nguyên tắc [6] Khi Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết với protein, thuốc nhuộm thay đổi màu sắc từ màu đỏ đến xanh nhạt, hấp thụ tối đa thuốc nhuộm từ 465-595 nm Sự thay đổi độ hấp thụ ở 595 nm tỷ lệ thuận với nồng độ protein mẫu Giống với phương pháp nhuộm bắt buộc khác, Bradford dựa tính chất lưỡng tính protein Khi dung dịch mang protein acid hóa đến pH nhỏ điểm đẳng điện protein phân tích, thuốc nhuộm sẽ tạo liên kết tĩnh điện Hiệu liên kết sẽ tăng cường bởi tương tác kỵ nước thuốc nhuộm phân tư với polypeptide liền kề trục dư lượng tích điện dương protein Trong phương pháp Bradford, thuốc nhuộm kết hợp với protein có thay đổi quang phổ hấp thụ tương đối so với thuốc nhuộm không liên kết 2.4.2 Cách tiến hành 2.4.2.1 Dụng cụ thiết bị [7] Cuvett bằng nhựa Micropipet Máy đo quang phổ Shimadzu UV - 200s 2.4.2.2 Chuẩn bị mẫu hóa chất [7] Các mẫu protein Dung dịch màu: - 40mg coomassie blue G (sevra No 35050) - 20ml ethanol (EtOH) (absolute) - 40ml H3PO4 85% - 40ml H2O Dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin) 100mg/ml 2.4.2.3 Quy trình thực hiện [7] a) Xây dựng đường cong chuẩn biểu diễn nồng độ protein chuẩn (BSA) 1,8ml dung dịch protein chuẩn có chứa từ 5-40mg BSA nước cất đưa vào cóng đo nhựa Thêm 0,6ml dung dịch màu, lắc để phút cho phản ứng xảy ở nhiệt độ phòng Đo độ hấp phụ ở bước sóng 595nm sau phút Dung dịch mẫu trắng (Blank) chuẩn bị từ 1.8ml nước cất 0,6ml chất thư màu Dựng đồ thị biểu diễn hàm lượng BSA tương ứng với giá trị OD 595nm Đường cong tiêu chuẩn sư dụng để xác định hàm lượng protein mẫu chưa biết, xây dựng tương tự theo phương pháp Lowry b) Định lượng protein mẫu Các mẫu có chứa từ 1-10mg protein 1,8ml H2O đưa vào cóng nhựa Thêm vào 0,6ml dung dịch màu lắc Đo độ hấp phụ quang học (OD) ở bước sóng 595nm 2.4.2.4 Tính kết Dựa vào đồ thị chuẩn xác định hàm lượng protein mẫu theo công thức sau: X (mg) = Trong đó: - X: số mg protein có mẫu - [C]: nồng độ protein theo đồ thị 1000 (mg/ml) - V: thể tích dung dịch mẫu - a: độ pha loãng 2.4.3 Ưu điểm nhược điểm [6] Ưu điểm: Nhanh chóng; phản ứng hồn thành phút Nhạy cảm gấp nhiều lần phương pháp Lowry Khơng có can thiệp ammonium sulfate, polyphenol, carbohydrate sucrose, cation K+, Na+ Mg2+ Đo protein hay peptide có khối lượng phân tư xấp xỉ lớn 4000 Da Nhược điểm: Bị cản trở bởi thuốc tẩy mang ion không ion Triton X-100 sodium dodecyl sulfate Tuy nhiên, với sai số nhỏ khoảng 0,1%, chất tẩy rưa dùng với kiểm sốt cách thích hợp Phức hợp protein-thuốc nhuộm liên kết với cuvette thạch anh Vì nhà phân tích phải sư dụng cuvette thủy tinh nhựa Màu sắc đa dạng tuỳ theo loại protein Các protein tiêu chuẩn phải lựa chọn cẩn thận PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GLUTEN TRONG BỘT MÌ 3.1 Khái quát gluten 3.1.1 Định nghĩa [8] Gluten định nghĩa loại protein có tính “cố kết, nhớt đàn hồi” Về mặt sinh học, gluten định nghĩa loại protein dự trữ hạt lúa mì Một cách khái quát, gluten tên gọi chung loại protein có số loại ngũ cốc, thành phần protein lúa mì, giúp tạo nên tính đàn hồi đặc trưng bột Hàm lượng protein bột mì cao, chất lượng độ bền gluten cao Gluten yếu tố để phân biệt công dụng loại bột khác 3.1.2 Thành phần [9] Gluten bao gồm hai thành phần Gliadin (Prolamin) Glutenin Các chất liên kết với tinh bột tồn nội nhũ hạt số loại hòa thảo, đặc biệt lúa mì, yến mạch lúa mạch 3.1.2.1 Gliadin Là chuỗi đơn polypeptide chứa liên kết disulfide nội phân tư Khối lượng phân tư: 30000 - 50000 Da Gồm bốn loại: -, -, -, -gliadin Phát triển mạng lưới gluten bằng cách hình thành liên kết hydro, liên kết kỵ nước mạch nhánh chứa acid amin không phân cực chuyển đổi thioldisulfide, tương tác với lipid (lipid bột lipid bổ sung vào) Gliadin đặc trưng cho độ nhớt độ co giãn bột nhào 3.1.2.2 Glutenin Là hỗn hợp polypeptide liên kết với qua cầu nối disulfide tạo nên đại phân tư có khối lượng phân tư lên đến hàng triệu Khối lượng phân tư: 60000 - Da Gồm hai loại: HMW (67000 - 88000 Da) LMW (