2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu tiến cứu và thực hiện theo phương pháp thử nghiệm lâm sàng không có đối chứng trên các BN ở Quảng Nam được tuyển chọn vào nghiên cứu.
2.2.2. Phương pháp chọn mẫu và cỡ mẫu
Phương pháp chọn mẫu
Chúng tôi lấy toàn bộ bệnh nhân thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ.
Cỡ mẫu
- Ước tính tỷ lệ thất bại điều trị của 1 số phác đồ điều trị SR (p) khoảng 15% - Mức độ tin cậy: 95%
28
- Độ chính xác (d): 10%
Dựa vào bảng xác định cỡ mẫu quy định cho đánh giá hiệu lực của thuốc điều trị sốt rét (WHO – 1987) (bảng 2.1) với p = 0,15 và d = 0,10 thì sẽ cần cỡ mẫu là 49.
Bảng 2.1. Xác định cỡ mẫu với độ tin cậy 95% (WHO – 1987)
Tỷ lệ quần thể (p) cho trước, mức độ tin cậy 95%
d 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50
0,05 73 138 196 246 288 323 350 369 380 384
0,10 18a 35a 49a 61 72 81 87 92 95 96
Giả sử có tối đa 10% bệnh nhân bỏ và rút khỏi thời gian theo dõi 42 ngày, cỡ mẫu cuối cùng là: n = (1 + 0,10) x 49 = 53
Vậy số mẫu tối thiểu cần lấy cho nghiên cứu là 53.
2.2.3. Nội dung và phương pháp tiến hành nghiên cứu
2.2.3.1. Đặc điểm chung của bệnh nhân trong mẫu nghiên cứu
- Đặc điểm về tuổi và giới tính - Đặc điểm về mức độ sốt
Mức độ sốt xác định bằng phương pháp đo nhiệt độ nách bằng nhiệt kế thông thường lúc trước khi điều trị.
Phân loại mức độ sốt:
Không bị sốt: nhiệt độ nách < 37,50C.
Sốt nhẹ: nhiệt độ từ nách 37,50C đến 380C.
Sốt vừa: nhiệt độ nách > 380C đến 390C.
Sốt cao: nhiệt độ nách > 390C. - Đặc điểm về mật độ ký sinh trùng trong máu
Lấy máu ở đầu ngón tay BN trước khi điều trị, làm tiêu bản giọt dày để xác định mật độ KST trong máu.
29
200 bạch cầu ở lam máu. Dựa trên một giả định có 8000 bạch cầu/l máu, mật độ KST có trong 1 l máu được tính theo công thức (I):
Mật độ KSTSR/l máu = Số lượng KSTSR đếm được x 8000 / Số lượng bạch cầu đếm được (I)
- Xét nghiệm cận lâm sàng: nồng độ hemoglobin
Đo nồng độ hemoglobin của BN bằng máy Haemocue.
BN có nồng độ hemoglobin giảm dưới mức bình thường khi nồng độ hemoglobin thấp hơn 13 g/dl ở nam và 12 g/dl ở nữ [4].
2.2.3.2. Đánh giá hiệu lực điều trị của thuốc Arterakine
Nội dung nghiên cứu
- Chúng tôi cho bệnh nhân trong nghiên cứu uống thuốc Arterakine(1) trong 3 ngày theo liều lượng quy định trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Liều dùng của Arterakine theo nhóm tuổi
Nhóm tuổi
Số viên Arterakine/ngày
Giờ đầu Sau 8 giờ Sau 24 giờ Sau 48 giờ
Dưới 3 tuổi 0,5 0,5 0,5 0,5
3 – dưới 8 tuổi 1,0 1,0 1,0 1,0
8 – dưới 15 tuổi 1,5 1,5 1,5 1,5
Từ 15 tuổi trở lên 2,0 2,0 2,0 2,0
(1)Viên Arterakine (dihydroartemisinin 40mg – piperaquin 320mg) của xí
nghiệp Dược phẩm TW 1 sản xuất (số lô: 11007, số đăng ký: VD – 12.944 – 10, hạn sử dụng: 21/09/2015).
- Đánh giá hiệu lực điều trị của Arterakine (dihydroartemisinin – piperaquin) theo phương pháp đánh giá đáp ứng của KSTSR với thuốc (in vivo test) [13] bằng cách theo dõi diễn biến thân nhiệt và theo dõi diễn biến mật độ
P.falciparum trong máu của BN trong thời gian 42 ngày với thời gian biểu
30
Bảng 2.3. Thời gian biểu theo dõi bệnh nhân 42 ngày
Thời điểm Thông số cần làm D0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D14 D21 D28 D35 D42 Điều trị x x x Bệnh sử x x x x x x x Khám lâm sàng x x x x x x x x x x x
Đo thân nhiệt x x x x x x x x x x x
Lấy lam máu1 x x x x x x x x x x x
Lấy giấy thấm cho PCR2 x x x x x x x x x x Đo nồng độ hemoglobin x x x x x x x Chú thích:
1Lấy máu đầu ngón tay bệnh nhân làm tiêu bản giọt dày để xác định sự
hiện diện và mật độ KSTSR.
2Lấy máu đầu ngón tay vào giấy thấm Whatman 3MM.
Chỉ tiêu đánh giá
Hiệu lực điều trị của Arterakine (dihydroartemisinin – piperaquin) trên BN SR do P.falciparum chưa biến chứng được đánh giá qua các chỉ tiêu sau:
- Thời gian cắt sốt:
Là thời gian từ khi BN uống liều thuốc đầu tiên đến khi nhiệt độ đo ở nách < 37,50C và duy trì ít nhất 48 giờ tiếp theo.
Thời gian cắt sốt được xác định bằng phương pháp đo nhiệt độ cặp nách bằng nhiệt kế thông thường trước và sau khi điều trị: cứ mỗi 12 giờ đo 1 lần cho đến khi BN hết sốt. Sau đó đo đo nhiệt độ ở nách 1 lần/ngày vào các
31
thời điểm còn lại trong thời gian biểu theo dõi BN. - Thời gian sạch ký sinh trùng:
Là thời gian từ khi uống thuốc đến khi không còn tìm thấy KSTSR trong máu
Xác định thời gian sạch KST của BN bằng cách: lấy máu của BN làm tiêu bản giọt dày trước khi điều trị và sau khi điều trị: cứ mỗi 12 giờ lấy máu 1 lần cho đến khi 2 lam máu ở 2 lần lấy liên tiếp có kết quả âm tính. Sau đó lấy lam máu 1 lần/ngày vào các thời điểm còn lại trong bảng thời gian biểu theo dõi BN.
Lam máu xác định là âm tính khi: soi 200 vi trường trên tiêu bản máu giọt dày trong thời gian 10 phút không thấy KSTSR.
- Tỷ lệ bệnh nhân có KSTSR dương tính ở thời điểm D3.
- Tỷ lệ bệnh nhân có nồng độ hemoglobin giảm dưới mức bình thường trong quá trình điều trị.
Xác định tỷ lệ BN có nồng độ hemoglobin giảm dưới mức bình thường của BN trong quá trình điều trị bằng cách đo nồng độ hemoglobin hàng tuần trong thời gian theo dõi 42 ngày, mỗi tuần đo 1 lần cho đến tuần thứ sáu (thời điểm D42).
- Đánh giá kết quả điều trị trên lâm sàng:
Khỏi bệnh: khi BN sạch KST, hết các triệu chứng lâm sàng sau 3 ngày điều
trị và không xuất hiện lại KST trong thời gian theo dõi 42 ngày.
Thất bại điều trị sớm: khi BN có 1 trong các biểu hiện sau:
Phát triển các dấu hiệu nguy hiểm hoặc SR nặng ở thời điểm D1, D2 hoặc D3; kèm theo có KSTSR trong máu.
Mật độ KSTSR ở thời điểm D2 > ở thời điểm D0 (BN có sốt hoặc không có sốt).
Còn KST ở thời điểm D3 và có sốt (nhiệt độ đo ở nách ≥ 37,50C).
32
Thất bại điều trị lâm sàng muộn: khi BN
Phát triển các dấu hiệu nguy hiểm hoặc SR nặng vào bất cứ ngày nào sau thời điểm D3 với sự hiện diện của KST, và trước đó không có bất kỳ biểu hiện nào của thất bại điều trị sớm.
Bệnh nhân xuất hiện KST vào bất kỳ ngày nào sau thời điểm D3 có sốt trở lại, và trước đó không có bất kỳ biểu hiện nào của thất bại điều trị sớm.
Thất bại KST muộn: khi có sự hiện diện của KST trong máu BN vào bất kỳ
ngày nào kể từ thời điểm D7 trở đi và nhiệt độ đo ở nách < 37,50C, trước đó không có bất kỳ tiêu chí nào của thất bại điều trị sớm hoặc thất bại điều trị lâm sàng muộn.
- Phân biệt tái phát hay nhiễm mới KSTSR ở bệnh nhân thất bại điều trị. Những bệnh nhân xuất hiện lại KSTSR trong quá trình theo dõi 42 ngày cần xác định đây là BN nhiễm mới KSTSR hay BN tái phát KSTSR mà BN bị nhiễm trước đó bằng kỹ thuật Nested PCR và Multiplex PCR.
Phân biệt bệnh nhân tái phát hay nhiễm mới KSTSR bằng kỹ thuật Nested
PCR và Multiplex PCR
Nguyên tắc
Xác định kiểu gen của P.falciparum phân lập từ BN SR dựa vào tổ hợp phân tích các gen có tính đa hình kháng nguyên cao bằng kỹ thuật Nested PCR và Multiplex PCR. Các gen có tính đa hình kháng nguyên cao gồm :
- Kháng nguyên bề mặt merozoite 1 (Merozoite Surface Protein 1 – MSP1). - Kháng nguyên bề mặt merozoite 2 (Merozoite Surface Protein 2 – MSP2). - Kháng nguyên giàu glutamate (Glutamate Rich Protein – GLURP).
Phân biệt BN nhiễm mới hay tái phát thông qua việc so sánh kiểu gen của 3 gen đa hình (MSP1, MSP2 và GLURP) của P.falciparum phân lập từ BN ở ngày xuất hiện lại KSTSR sau điều trị với kiểu gen của P.falciparum ở thời điểm D0:
- Nhiễm mới: Kiểu gen của P.falciparum ở ngày xuất hiện lại KSTSR khác với kiểu gen của P.falciparum ở thời điểm D0.
33
- Tái phát: Kiểu gen của P.falciparum ở ngày xuất hiện lại KSTSR trùng
khớp với kiểu gen của P.falciparum ở thời điểm D0. Mẫu phân tích
- Mẫu máu BN: mẫu máu khô của BN xuất hiện lại KSTSR thu trên giấy thấm Whatman 3MM (ở thời điểm D0 và thời điểm xuất hiện lại KSTSR) được tách chiết thu lấy dịch chiết ADN để chạy PCR.
- Chứng dương: chủng P.falciparum đơn dòng mang kiểu gen đặc trưng ở các locus gen MSP1, MSP2 và GLURP.
- Chứng âm: mẫu giấy thấm Whatman 3MM sạch được cắt cùng với mẫu BN trong quá trình tách ADN.
Các bước tiến hành
- Bước 1: Xử lý mẫu, tách chiết ADN
Tách chiết ADN từ mẫu máu trên giấy thấm Whatman 3MM của những BN xuất hiện lại KSTSR bằng bộ Qiagen Micro Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất [55] (xem Phụ lục 6).
- Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR
Phản ứng PCR gồm PCR lần 1 và PCR lần 2: PCR lần 1 để nhân bản đoạn ADN lồng ngoài của các locus gen MSP1, MSP2 và GLURP. PCR lần 2 để nhân bản các đoạn ADN đặc trưng cho từng kiểu gen của P.falciparum.
Phản ứng PCR lần 1
Thành phần trong 1 ống nghiệm để thực hiện phản ứng PCR lần 1 được trình bày trong bảng 2.4.
34
Bảng 2.4. Thành phần trong 1 ống nghiệm để thực hiện phản ứng PCR lần 1
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất khử ion 12,3 2 Đệm PCR 10X 2,5 3 MgCl2 (25mM) 2,0 4 dNTPs (2 mM) 2,5 5 Hỗn hợp mồi 1 (1,25µM) 2,5
6 Taq ADN polymerase 0,2
7 Khuôn ADN 2 3
Chú thích:
1Hỗn hợp mồi (M1 – OF, M1 – OR, M2 – OF và M2 – OR) với ống dung
dịch cho locus MSP1 và MSP2; hỗn hợp mồi (G – OF và G – OR) với ống dung dịch cho locus GLUPR.
2
Dịch chiết ADN tách từ mẫu giấy thấm Whatman 3MM của BN (thời điểm
D0 hoặc thời điểm xuất hiện lại KSTSR) hoặc chứng dương hoặc chứng âm.
Số ống nghiệm sử dụng cho một BN xuất hiện lại KSTSR là 4 ống nghiệm, trong đó 2 ống nghiệm cho dịch chiết ADN từ mẫu giấy thấm thu ở thời điểm D0 (1 ống nghiệm với hỗn hợp mồi cho locus MSP1 và MSP2, 1 ống nghiệm với hỗn hợp mồi cho locus GLURP) và 2 ống nghiệm cho dịch chiết ADN từ mẫu giấy thấm thu ở thời điểm xuất hiện lại KSTSR (1 ống nghiệm với hỗn hợp mồi cho locus MSP1 và MSP2, 1 ống nghiệm với hỗn hợp mồi cho locus GLURP).
Đặt các ống mẫu vào máy PCR, đậy nắp và cho máy chạy theo chương trình nhiệt độ ở bảng 2.5.
35
Bảng 2.5. Chương trình nhiệt độ cho phản ứng PCR lần 1
Bước Chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ
1 Biến tính ADN 95 5 phút 1 2 Biến tính ADN 94 1 phút 25 3 Bắt cặp mồi 58 2 phút 4 Tổng hợp ADN 72 2 phút 5 Tổng hợp lần cuối 72 10 phút 1
Sau đó giữ ở nhiệt độ 150C cho đến khi lấy ra khỏi máy
Sản phẩm của phản ứng PCR lần 1 được dùng để làm khuôn ADN cho phản ứng PCR lần 2.
Phản ứng PCR lần 2
Thành phần trong 1 ống nghiệm để thực hiện phản ứng PCR lần 2 trình bày trong bảng 2.6.
Bảng 2.6. Thành phần trong 1 ống nghiệm để thực hiện phản ứng PCR lần 2
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất khử ion 10,8 2 Đệm PCR 10X 2,5 3 MgCl2 (25mM) 2,0 4 dNTPs (2 mM) 2,5 5 *Mồi xuôi (1,25µM) 2,5 6 *Mồi ngược (1,25µM) 2,5
7 Taq ADN polymerase 0,2
8 Sản phẩm PCR lần 1 2
Chú thích: *Sử dụng mồi xuôi, mồi ngược cho từng kiểu gen theo Phụ lục 7
Số ống nghiệm sử dụng cho một dung dịch sản phẩm của PCR lần 1 (với hỗn hợp mồi cho locus MSP1 và MSP2) là 5 ống nghiệm tương ứng với từng kiểu gen: K1, MAD20, RO33, FC, IC. Và 1 ống nghiệm cho dung dịch sản phẩm của PCR lần 1 (với hỗn hợp mồi cho locus GLURP). Như
36
vậy với 1 BN xuất hiện lại KSTSR cần 12 ống nghiệm.
Đặt các ống mẫu vào máy PCR, đậy nắp và cho máy chạy theo chương trình nhiệt độ ở bảng 2.7.
Bảng 2.7. Chương trình nhiệt độ cho phản ứng PCR lần 2
Bước
PCR lần 2 với mồi cho kiểu gen MSP1 và MSP2
PCR lần 2 với mồi cho kiểu gen GLURP
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
1 950C 5 phút 1 950C 5 phút 1 2 940C 1 phút 30 940C 1 phút 30 3 610C 2 phút 580C 2 phút 4 720C 2 phút 720C 2 phút 5 720C 10 phút 1 720C 10 phút 1
Sau đó giữ ở nhiệt độ 150C cho đến khi lấy ra khỏi máy
- Bước 3: Đọc kết quả
Lấy sản phẩm PCR lần 2 điện di trên gel agarose với điện áp 110V. Sau đó đọc và chụp ảnh sản phẩm PCR bằng hệ hống chụp ảnh gel kỹ thuật số:
Mẫu nghiên cứu mang kiểu gen của mồi đã cho vào ống nghiệm trong phản ứng PCR lần 2 nếu sản phẩm PCR của mẫu nghiên cứu này có băng ADN sáng và ở vị trí có kích thước trong khoảng kích thước ước lượng của kiểu gen đó (xem Phụ lục 8) (đối chiếu với băng ADN sáng xuất hiện ở chứng dương).
Bệnh nhân là tái phát nếu sản phẩm PCR của BN ở thời điểm xuất hiện lại KSTSR và ở thời điểm D0 (với cùng loại mồi cho vào ống nghiệm trong phản ứng PCR lần 2) có băng ADN sáng ở vị trí có kích thước giống nhau. Ngược lại là nhiễm mới.
37
2.2.3.3. Đánh giá tính nhạy cảm của P.faciparum phân lập từ bệnh nhân trong nghiên cứu với piperaquin và dihydroartemisinin bằng kỹ thuật in vitro micro test
Nguyên tắc
Đánh giá tính nhạy cảm của P.falciparum với thuốc SR dựa vào kết quả nuôi cấy liên tục P.falciparum phân lập từ BN trong nghiên cứu bằng môi trường RPMI 1640 có gắn thuốc cần nghiên cứu.
Các bước tiến hành
- Bước 1: Nuôi cấy P.falciparum trong phiến nhựa gắn thuốc.
Lấy 200 µl máu ở BN (trước khi điều trị) để nuôi cấy (theo quy trình kỹ thuật in vitro micro test [13]) trên phiến nhựa 96 giếng chứa môi trường nuôi cấy RPMI 1640 và có gắn riêng từng thuốc (piperaquin, dihydroartemisinin) với dãy nồng độ trình bày trong bảng 2.8
Bảng 2.8. Nồng độ piperaquin và dihydroartemisinin ở giếng A đến giếng H
Giếng A B C D E F G H
Nồng độ piperaquin
(nmol/L) 0 12,5 25 50 100 200 400 800 Nồng độ dihydroartemisinin
(nmol/L) 0 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Giếng A là giếng chứng không gắn thuốc.
Từ giếng B đến giếng H được gắn thuốc với nồng độ tăng dần, giếng H có nồng độ thuốc cao nhất.
- Bước 2: Xác định tỷ lệ phần trăm thể phân liệt ở các giếng thuốc khác nhau so với giếng chứng sau thời gian nuôi cấy.
Lấy cặn (hồng cầu và KST) sau khi nuôi cấy KSTSR trong vòng từ 24 đến 36 giờ để làm tiêu bản giọt dày. Trên mỗi lam máu, đếm 200 KST (bao gồm tất cả các thể) và xác định số lượng thể phân liệt có từ 3 nhân trở lên trong tổng số 200 KST đó.
38
Tỷ lệ phần trăm thể phân liệt ở giếng thuốc so với giếng chứng được tính theo công thức (II):
% thể phân liệt ở giếng thuốc so với giếng chứng = a/b x 100 (%) (II) a: Số thể phân liệt /200 KST ở giếng thuốc
b: Số thể phân liệt /200 KST ở giếng chứng
Một mẫu P.falciparum được đánh giá là nuôi cấy thành công khi số thể
phân liệt đếm được ở giếng chứng phải ≥ 10% trong tổng số 200 KST (20 thể phân liệt trong 200 KST).
Chỉ tiêu đánh giá
Tính nhạy cảm của P.falciparum với thuốc SR đánh giá qua các chỉ tiêu sau: - EC50 (Nồng độ thuốc ức chế sự phát triển 50% KSTSR): Tại nồng độ thuốc