Phương pháp phân biệt bệnh nhân tái phát hay nhiễm mới ký sinh

trùng sốt rét bằng kỹ thuật Nested PCR và Multiplex PCR

Nếu quan sát thấy KSTSR xuất hiện lại trên lam máu của BN trong thời gian theo dõi đáp ứng điều trị của BN với một thuốc SR, thì cần phân biệt đó là trường hợp BN nhiễm KSTSR mới hay tái phát KSTSR BN bị nhiễm trước đó.

1.4.3.1. Nguyên lý chung của Polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction (PCR) là một chuỗi phản ứng liên tục, dựa vào sự xúc tác của enzym để nhân bản nhanh một đoạn ADN được giới hạn bởi các đoạn mồi oligonucleotide (primer) tương hợp với hai đầu 3΄ ở cả hai mạch của đoạn ADN đích (target sequense), gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn biến tính: Hai mạch của chuỗi xoắn kép ADN được tách nhau ra

nhờ nhiệt độ cao (90 – 950C) làm đứt các liên kết hydro của phân tử ADN. Giai đoạn này kéo dài 1 – 2 phút.

- Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ của phản ứng được giảm xuống khoảng 55 –

650C để cho mồi gắn kết vào các mạch đơn của ADN đích theo nguyên tắc bổ sung. Giai đoạn này khoảng 30 – 60 giây.

- Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ 70 – 720C thích hợp với điều kiện hoạt động

của enzym ADN polymerase. Phản ứng polymerase hóa được thực hiện bằng cách tổng hợp kéo dài mồi có sự tham gia của các nucleotide nhờ sự xúc tác của enzym Taq polymerase. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến vài chục phút.

Mỗi phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ liên tục, sản phẩm tạo ra ở chu kỳ trước lại được làm khuôn ở chu kỳ kế tiếp, nên số lượng bản sao tạo thành tăng theo cấp số nhân. Một phản ứng PCR thường thực hiện 20 – 40 chu kỳ, từ mỗi ADN khuôn có thể tạo nên 220 – 240 bản sao ADN [20], [27].

Có nhiều kỹ thuật PCR khác nhau: Standard PCR (PCR chuẩn), Nested PCR (PCR lồng), Multiplex PCR (PCR đa mồi), RT – PCR (PCR ngược), Inverse PCR (PCR đảo), Anchored PCR (PCR dạng neo), PCR in situ (PCR tại chỗ)

23

[27]. Trong đó, kỹ thuật Nested PCR và Multiplex PCR được sử dụng để phân biệt BN tái phát hay nhiễm mới KSTSR.

1.4.3.2. Nguyên lý của kỹ thuật Nested PCR và kỹ thuật Multiplex PCR

- Nested PCR là kỹ thuật thực hiện 2 lần PCR chuẩn kế tiếp nhau với 2 cặp

mồi có trình tự các nucleotide lồng vào nhau (cặp mồi thứ 2 có trình tự các nucleotide nằm trong cặp mồi thứ nhất). Trong đó, lần PCR thứ 2 sử dụng cặp mồi thứ 2 và kết quả khuếch đại các đoạn ADN của lần thứ nhất làm khuôn. Điều này làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR, nó chỉ nhân lên đoạn đặc hiệu của ADN lần thứ nhất và cho phép khuếch đại các đoạn ADN đặc trưng cho các đơn vị dưới loài [27], [2].

- Kỹ thuật Multiplex PCR là PCR sử dụng đồng thời cùng một lúc nhiều cặp

mồi đặc hiệu khác nhau để nhân các đoạn ADN đặc trưng khác nhau trên một phân tử ADN hoặc trên các phân tử ADN khác nhau [27].

1.4.3.3. Phân biệt bệnh nhân tái phát hay nhiễm mới bằng kỹ thuật Nested PCR và Multiplex PCR

KSTSR có các gen tương ứng nằm rải rác trên những nhiễm sắc thể khác nhau và chỉ gặp một lần trong hệ gen đơn bội ở giai đoạn hồng cầu. Một số gen kháng nguyên có những khác biệt nhỏ (những đoạn lặp lại) trong chuỗi ADN tạo nên tính đa hình cao như: MSP1 (Merozoite Surface Protein 1), MSP2 (Merozoite Surface Protein 2) và GLURP (Glutamate Rich Protein). Tổ hợp phân tích kiểu gen của 3 gen đa hình này của P.falciparum ở ngày xuất hiện lại sau điều trị so với kiểu gen của P.falciparum trước khi điều trị bằng kỹ thuật

Nested PCR và Multiplex PCR. Nếu kiểu gen của P.falciparum ở ngày xuất hiện lại sau khi điều trị trùng khớp với kiểu gen của P.falciparum trước khi điều trị thì đó là trường hợp tái phát. Nếu khác kiểu gen thì là nhiễm mới KSTSR [13], [40]. 1.5. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HIỆU LỰC ĐIỀU TRỊ SỐT RÉT CỦA PHÁC ĐỒ DIHYDROARTEMISININ – PIPERAQUIN Ở VIỆT NAM

Những năm gần đây đã có một số nghiên cứu về hiệu lực điều trị SR của phác đồ dihydroartemisinin – piperaquin ở nước ta, bao gồm:

24

“Đánh giá hiệu lực điều trị SR thường do P.falciarum của Arterakine tại binh

đoàn Tây Nguyên hai năm 2006 – 2007” của tác giả Lê Ngọc Anh và cộng sự kết

luận: thời gian cắt sốt trung bình là 20,5 ± 10,4 giờ, thời gian sạch KSTSR trung bình là 32,1 ± 16,1 giờ, tỷ lệ BN khỏi bệnh là 100% [1].

Nghiên cứu về “Hiệu lực điều trị của một số thuốc SR mới đối với in vivo giai

đoạn 2005 – 2010” của tác giả Tạ Thị Tĩnh, Bùi Quang Phúc và cộng sự kết luận:

phác đồ dihydroartemisinin – piperaquin (Arterakine) còn hiệu lực điều trị SR do

P.falciparum với tỷ lệ BN khỏi bệnh là 100%, tỷ lệ BN có KSTSR dương tính ở (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

thời điểm D3 là 0% ở Đăk Nông, Quảng Bình, Ninh Thuận, Gia Lai, Quảng Trị. Ở Bình Phước tỷ lệ BN có KSTSR dương tính tại thời điểm D3 là 15,3% và tỷ lệ BN khỏi bệnh là 97,8% [33].

Nghiên cứu về “Hiệu lực của một số thuốc SR có thành phần là dẫn chất của

artemisinin (ACTs) trong điều trị SR do P.falciarum chưa biến chứng tại một số vùng SR lưu hành giai đoạn 2005 – 2012” của Tạ Thị Tĩnh, Bùi Quang Phúc và

cộng sự kết luận: hiệu lực điều trị của phác đồ dihydroartemisinin – piperaquin còn cao đối với P.falciparum ở Việt Nam (tỷ lệ BN khỏi bệnh từ 94,8% –

100%). Tại một số điểm có tỷ lệ BN có KSTSR dương tính ở thời điểm D3 cao và tăng nhanh qua từng năm như Bình Phước, Đăk Nông và Gia Lai [35].

Nghiên cứu về “Hiệu lực điều trị của dihydroartemisinin – piperaquin

phosphat đối với SR do P.falciarum chưa biến chứng năm 2012 – 2013” của tác giả

Bùi Quang Phúc và cộng sự kết luận: phác đồ dihydroartemisinin – piperaquin còn hiệu lực cao trong điều trị SR do P.falciparum với tỷ lệ BN khỏi bệnh là

98,4% tại Quảng Trị, và 100% tại Bình Phước, Đăk Nông và Gia Lai, tuy nhiên tỷ lệ BN sạch KST ở thời điểm D3 là 100% ở Quảng Trị, nhưng ở Gia Lai 77,2%, ở Đăk Nông 70,8% và ở Bình Phước chỉ còn 69,4% [22].

Mặc dù phác đồ dihydroartemisinin – piperaquin (Arterakine) còn hiệu quả cao ở một vài tỉnh trong các nghiên cứu ở nước ta, nhưng cũng đã xuất hiện BN bị thất bại điều trị như ở Bình Phước (năm 2009), Gia Lai (năm 2010) và Quảng Trị (năm 2012) và tỷ lệ bệnh nhân có KSTSR dương tính ở thời điểm D3 đang

25

tăng theo thời gian. Đây là dấu hiệu cho thấy hiệu lực điều trị của dihydroartemisinin – piperaquin đang bị suy giảm ở nước ta theo thời gian. Vì vậy, cần tăng cường việc giám sát điều trị một cách thường xuyên, liên tục và mở rộng địa điểm giám sát với phác đồ dihydroartemisinin – piperaquin. Quảng Nam là tỉnh có số bệnh nhân mắc SR năm 2013 đứng thứ 6 cả nước. Trong đó, xã Trà Leng, huyện Nam Trà My thuộc vùng SR lưu hành nặng của Quảng Nam với diễn biến KSTSR phức tạp [8] nhưng chưa có nghiên cứu nào đánh giá và giám sát hiệu lực điều trị của phác đồ dihydroartemisinin – piperaquin. Do đó, chúng tôi chọn xã Trà Leng, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam để đánh giá hiệu lực điều trị của Arterakine trên BN SR do P.falciparum chưa biến chứng.

26

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân ở xã Trà Leng, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam chẩn đoán là SR do P.falciparum chưa biến chứng thỏa mãn các tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ được đưa vào nghiên cứu.

 Tiêu chuẩn lựa chọn:

- Người lớn và trẻ em trên 6 tháng tuổi.

- Đơn nhiễm P.falciparum với mật độ KST trong máu từ 500 – 200.000 thể vô tính/µl máu.

- Sốt (nhiệt độ nách  37,50C, nhiệt độ miệng/hậu môn  380C) và/hoặc có tiền sử sốt trong 24 giờ trước đó.

- Có thể uống được thuốc SR.

- Đồng ý tham gia nghiên cứu (bằng văn bản). Đối với BN dưới 18 tuổi, cần có sự đồng ý của cha mẹ hoặc người giám hộ.

 Tiêu chuẩn loại trừ:

- Nhiễm phối hợp KSTSR. - Mang thai hoặc cho con bú.

- Mắc đồng thời các bệnh cấp tính, bệnh khác cần phải điều trị đặc hiệu (kháng sinh).

- Mắc các bệnh mạn tính nặng (ví dụ như bệnh tim, bệnh gan, bệnh thận, HIV/AIDS).

- Suy dinh dưỡng nặng. - Có các dấu hiệu nguy hiểm:

 Không thể uống.

 Nôn mửa nặng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

 Tiền sử co giật gần đây (>1 lần trong 24 giờ).

27  Không thể ngồi hoặc đứng. - Có các dấu hiệu của bệnh SR nặng:

 Sốt rét có biến chứng thể não.

 Thiếu máu nặng (hemoglobin < 7 g/dl, hematocrit <15%).

 Suy thận cấp (creatinin huyết thanh > 3 mg/dl ở người lớn và > 1,5 mg/dl ở trẻ em).

 Phù phổi.

 Hạ đường huyết (đường huyết < 40mg/dl).

 Sốc (huyết áp tâm thu < 70 mmHg ở người lớn, < 50 mmHg ở trẻ).

 Xuất huyết (đường tiêu hóa, mũi, chân răng hoặc các nơi tiêm tĩnh mạch).

 Co giật toàn thân.

 Vàng da nặng.

- Bệnh nhân đã uống quinin, artemisinin hoặc các dẫn xuất artemisinin trong vòng 7 ngày vừa qua, 4 – aminoquinolin trong vòng 14 ngày qua, pyrimethamin và/hoặc sulfonamid trong vòng 28 ngày qua, hoặc mefloquin trong vòng 56 ngày qua không làm mục tiêu 2.

2.1.2. Thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 11 năm 2012 đến tháng 12 năm 2013.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu tiến cứu và thực hiện theo phương pháp thử nghiệm lâm sàng không có đối chứng trên các BN ở Quảng Nam được tuyển chọn vào nghiên cứu.

2.2.2. Phương pháp chọn mẫu và cỡ mẫu

Phương pháp chọn mẫu

Chúng tôi lấy toàn bộ bệnh nhân thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ.

Cỡ mẫu

- Ước tính tỷ lệ thất bại điều trị của 1 số phác đồ điều trị SR (p) khoảng 15% - Mức độ tin cậy: 95%

28

- Độ chính xác (d): 10%

Dựa vào bảng xác định cỡ mẫu quy định cho đánh giá hiệu lực của thuốc điều trị sốt rét (WHO – 1987) (bảng 2.1) với p = 0,15 và d = 0,10 thì sẽ cần cỡ mẫu là 49.

Bảng 2.1. Xác định cỡ mẫu với độ tin cậy 95% (WHO – 1987)

Tỷ lệ quần thể (p) cho trước, mức độ tin cậy 95%

d 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50

0,05 73 138 196 246 288 323 350 369 380 384

0,10 18a 35a 49a 61 72 81 87 92 95 96

Giả sử có tối đa 10% bệnh nhân bỏ và rút khỏi thời gian theo dõi 42 ngày, cỡ mẫu cuối cùng là: n = (1 + 0,10) x 49 = 53 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Vậy số mẫu tối thiểu cần lấy cho nghiên cứu là 53.

2.2.3. Nội dung và phương pháp tiến hành nghiên cứu

2.2.3.1. Đặc điểm chung của bệnh nhân trong mẫu nghiên cứu

- Đặc điểm về tuổi và giới tính - Đặc điểm về mức độ sốt

 Mức độ sốt xác định bằng phương pháp đo nhiệt độ nách bằng nhiệt kế thông thường lúc trước khi điều trị.

 Phân loại mức độ sốt:

 Không bị sốt: nhiệt độ nách < 37,50C.

 Sốt nhẹ: nhiệt độ từ nách 37,50C đến 380C.

 Sốt vừa: nhiệt độ nách > 380C đến 390C.

 Sốt cao: nhiệt độ nách > 390C. - Đặc điểm về mật độ ký sinh trùng trong máu

 Lấy máu ở đầu ngón tay BN trước khi điều trị, làm tiêu bản giọt dày để xác định mật độ KST trong máu.

29

200 bạch cầu ở lam máu. Dựa trên một giả định có 8000 bạch cầu/l máu, mật độ KST có trong 1 l máu được tính theo công thức (I):

Mật độ KSTSR/l máu = Số lượng KSTSR đếm được x 8000 / Số lượng bạch cầu đếm được (I)

- Xét nghiệm cận lâm sàng: nồng độ hemoglobin

 Đo nồng độ hemoglobin của BN bằng máy Haemocue.

 BN có nồng độ hemoglobin giảm dưới mức bình thường khi nồng độ hemoglobin thấp hơn 13 g/dl ở nam và 12 g/dl ở nữ [4].

2.2.3.2. Đánh giá hiệu lực điều trị của thuốc Arterakine

 Nội dung nghiên cứu

- Chúng tôi cho bệnh nhân trong nghiên cứu uống thuốc Arterakine(1) trong 3 ngày theo liều lượng quy định trình bày ở bảng 2.2.

Bảng 2.2. Liều dùng của Arterakine theo nhóm tuổi

Nhóm tuổi

Số viên Arterakine/ngày

Giờ đầu Sau 8 giờ Sau 24 giờ Sau 48 giờ

Dưới 3 tuổi 0,5 0,5 0,5 0,5

3 – dưới 8 tuổi 1,0 1,0 1,0 1,0

8 – dưới 15 tuổi 1,5 1,5 1,5 1,5

Từ 15 tuổi trở lên 2,0 2,0 2,0 2,0

(1)Viên Arterakine (dihydroartemisinin 40mg – piperaquin 320mg) của xí

nghiệp Dược phẩm TW 1 sản xuất (số lô: 11007, số đăng ký: VD – 12.944 – 10, hạn sử dụng: 21/09/2015). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

- Đánh giá hiệu lực điều trị của Arterakine (dihydroartemisinin – piperaquin) theo phương pháp đánh giá đáp ứng của KSTSR với thuốc (in vivo test) [13] bằng cách theo dõi diễn biến thân nhiệt và theo dõi diễn biến mật độ

P.falciparum trong máu của BN trong thời gian 42 ngày với thời gian biểu

30

Bảng 2.3. Thời gian biểu theo dõi bệnh nhân 42 ngày

Thời điểm Thông số cần làm D0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D14 D21 D28 D35 D42 Điều trị x x x Bệnh sử x x x x x x x Khám lâm sàng x x x x x x x x x x x

Đo thân nhiệt x x x x x x x x x x x

Lấy lam máu1 x x x x x x x x x x x

Lấy giấy thấm cho PCR2 x x x x x x x x x x Đo nồng độ hemoglobin x x x x x x x Chú thích:

1Lấy máu đầu ngón tay bệnh nhân làm tiêu bản giọt dày để xác định sự

hiện diện và mật độ KSTSR.

2Lấy máu đầu ngón tay vào giấy thấm Whatman 3MM.

 Chỉ tiêu đánh giá

Hiệu lực điều trị của Arterakine (dihydroartemisinin – piperaquin) trên BN SR do P.falciparum chưa biến chứng được đánh giá qua các chỉ tiêu sau:

- Thời gian cắt sốt:

 Là thời gian từ khi BN uống liều thuốc đầu tiên đến khi nhiệt độ đo ở nách < 37,50C và duy trì ít nhất 48 giờ tiếp theo.

 Thời gian cắt sốt được xác định bằng phương pháp đo nhiệt độ cặp nách bằng nhiệt kế thông thường trước và sau khi điều trị: cứ mỗi 12 giờ đo 1 lần cho đến khi BN hết sốt. Sau đó đo đo nhiệt độ ở nách 1 lần/ngày vào các

31

thời điểm còn lại trong thời gian biểu theo dõi BN. - Thời gian sạch ký sinh trùng:

 Là thời gian từ khi uống thuốc đến khi không còn tìm thấy KSTSR trong máu

 Xác định thời gian sạch KST của BN bằng cách: lấy máu của BN làm tiêu bản giọt dày trước khi điều trị và sau khi điều trị: cứ mỗi 12 giờ lấy máu 1 lần cho đến khi 2 lam máu ở 2 lần lấy liên tiếp có kết quả âm tính. Sau đó lấy lam máu 1 lần/ngày vào các thời điểm còn lại trong bảng thời gian biểu theo dõi BN.

 Lam máu xác định là âm tính khi: soi 200 vi trường trên tiêu bản máu giọt dày trong thời gian 10 phút không thấy KSTSR.

- Tỷ lệ bệnh nhân có KSTSR dương tính ở thời điểm D3.

- Tỷ lệ bệnh nhân có nồng độ hemoglobin giảm dưới mức bình thường trong quá trình điều trị.

Xác định tỷ lệ BN có nồng độ hemoglobin giảm dưới mức bình thường của BN trong quá trình điều trị bằng cách đo nồng độ hemoglobin hàng tuần trong thời gian theo dõi 42 ngày, mỗi tuần đo 1 lần cho đến tuần thứ sáu (thời điểm D42).

- Đánh giá kết quả điều trị trên lâm sàng:

 Khỏi bệnh: khi BN sạch KST, hết các triệu chứng lâm sàng sau 3 ngày điều

trị và không xuất hiện lại KST trong thời gian theo dõi 42 ngày.

 Thất bại điều trị sớm: khi BN có 1 trong các biểu hiện sau:

 Phát triển các dấu hiệu nguy hiểm hoặc SR nặng ở thời điểm D1, D2 hoặc D3; kèm theo có KSTSR trong máu.

 Mật độ KSTSR ở thời điểm D2 > ở thời điểm D0 (BN có sốt hoặc không có sốt). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

 Còn KST ở thời điểm D3 và có sốt (nhiệt độ đo ở nách ≥ 37,50C).

32

 Thất bại điều trị lâm sàng muộn: khi BN

 Phát triển các dấu hiệu nguy hiểm hoặc SR nặng vào bất cứ ngày nào sau