4. BÀN LUẬN
4.3. Kết quả nghiên cứu
Kết quả định tính sơ bộ bằng phương pháp hóa học thì trong cao đặc bài thuốc có các thành phần cơ bản tương tự như thành phần của các vị thuốc có trong bài thuốc, bao gồm: alcaloid, saponin, coumarin, flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid và chất béo.
Quế chi (cao) có chứa: coumarin, flavonoid, tanin, đường khử.
Bạch thược có: flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid và chất béo.
Hương phụ (cao) có: alcaloid, saponin, flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid.
Xuyên khung (cao) có: alcaloid, đường khử và chất béo.
Quá trình nghiên cứu và triển khai sắc kí lớp mỏng, nhóm nghiên cứu nhận thấy để có kết quả tốt thì cần phải thực hiện các bước khảo sát về lựa chọn nhóm chất định tính, cách xử lý mẫu, hệ dung môi khai triển, phương pháp phát hiện và
66
Kết quả nghiên cứu định tính một số thành phần bằng SKLM thấy rằng hai mẫu cao chiết nước và cao chiết ethanol có thành phần hóa học tương tự nhau. Cường độ các vết trên sắc ký bản mỏng ở hai mẫu cao về cơ bản giống nhau.
Kết quả định lượng hoạt chất paeoniflorin trong cao cho thấy quy trình chiết xuất (bao gồm dung môi chiết xuất) mà nhóm nghiên cứu lựa chọn chiết hoạt chất với tỷ lệ tương đối cao, lượng hoạt chất chiết được phụ thuộc vào nhiệt độ chiết xuất, nhiệt độ cô cao, kích thước dược liệu ban đầu …
67
KẾT LUẬN VÀ KIỂN NGHỊ
1. Kết luận
Đề tài đã hoàn thành được mục tiêu đề ra:
1.1. Xây dựng phương pháp định tính một số vị dược liệu
Định tính bằng phương pháp hóa học
Thành phần các nhóm chất hóa học trong cao đặc và các vị thuốc: - Quế chi có: coumarin, flavonoid, tanin, đường khử.
- Bạch thược có: flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid và chất béo.
- Hương phụ có: alcaloid, saponin, flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid.
- Xuyên khung có: alcaloid, đường khử và chất béo.
- Cao chiết nước và cao chiết ethanol có các thành phần cơ bản tương tự như
thành phần của các vị thuốc có trong bài thuốc, bao gồm: alcaloid, saponin, coumarin, flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid và chất béo. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Định tính flavonoid trong Quế chi
- Sắc kí đồ ở bước sóng 254 nm cho kết quả hiện vết và tách vết tốt nhất: cao chiết nước có 5 vết, cao chiết ethanol 60 % có 5 vết, Quế chi có 4 vết, các vết
đều có màu đen. Trong đó:
- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 2 vết tương đương với Quế chi (màu đen, Rf* = 6, 37).
Định tính glycoside và dẫn xuất trong Bạch thược
- Sắc kí đồở bước sóng 254 nm cho kết quả hiện vết và tách vết tốt: cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 5 vết, Bạch thược có 1 vết, các vết có màu
đen. Trong đó:
- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 1 vết tương đương với Bạch thược (màu đen, Rf* = 33).
68
- Khi phun thuốc thử vanillin trong acid sulfuric 10 % quan sát được rõ các vết. Trong đó:
- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có nhiều vết, Bạch thược có 4 vết, các vết có màu tím - hồng.
- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 2 vết tương đương với Bạch thược (màu hồng, Rf* = 33, 38).
- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có các vết tương tự nhau.
Định tính alkaloid trong Hương phụ và Xuyên khung
- Sắc kí đồ ở bước sóng 254 nm thấy: cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 5 vết, Hương phụ có 4 vết, Xuyên khung có 2 vết, các vết có màu đen. Trong đó:
- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 2 vết tương đương với Hương phụ (màu đen, Rf*= 50, 65), 1 vết tương đương với Xuyên khung (màu đen, Rf*= 46).
Định tính đồng thời Quế chi, Hương phụ và Bạch thược
- Sắc kí đồ sau khi hiện màu bằng hơi NH3đặc thấy: cao chiết nước có 5 vết, cao chiết ethanol 60 % và Quế chi có 3 vết, Hương phụ có 5 vết, Bạch thược có 2 vết. Trong đó:
- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 1 vết tương đương với Quế chi và Hương phụ (màu vàng, Rf* = 29), có 2 vết tương đương với Bạch thược (màu đen, Rf* = 6, 12).
- Cao nước có thêm 1 vết tương đương với Hương phụ (màu vàng, Rf* = 46), 1 vết tương đương với Quế chi (màu vàng, Rf* = 42).
1.2. Xây dựng phương pháp định lượng paeoniflorin
- Xây dựng được phương pháp định lượng paeoniflorin trong cao Hoạt lạc vương bằng kỹ thuật HPLC với điều kiện sắc ký: cột C18, pha động Acetonitril - dung dịch acid phosphoric 1 % (14 - 86), detector UV 230 nm, phương pháp có độđặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độđúng cao, có thể định lượng paeoniflorin trong mẫu cao ở nồng độ khoảng 0,5 µg/ ml.
69
- Đã xác định được hàm lượng paeoniflorin trong một số mẫu cao Hoạt lạc vương do nhóm nghiên cứu bào chế.
1.3. Dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao đặc Hoạt lạc vương
Từ kết quả thực nghiệm, nhóm nghiên cứu đề xuất “dự thảo” một số tiêu chí cho tiêu chuẩn cao đặc Hoạt lạc vương (một bán thành phẩm trong quy trình nghiên cứu hiện đại hóa phương thuốc Hoạt lạc Vương) như sau (phụ lục):
2. Kiến nghị
Từ một số kết quả nghiên cứu định tính, định lượng một số thành phần trong cao Hoạt Lạc Vương, chúng tôi đề nghị tiếp tục nghiên cứu về các vấn đề sau:
- Tiếp tục nghiên cứu để đưa ra phương pháp định tính tối ưu đối với vị dược liệu Quế, định tính phân biệt hai vị dược liệu Hương phụ, Xuyên khung trong cao Hoạt lạc vương. Khảo sát định lượng paeoniflorin với lượng mẫu lớn hơn để có cơ sởấn định giá trị tối ưu cho hàm lượng paeoniflorin trong cao. - Hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng cho cao Hoạt lạc vương.
- Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của cao đặc và các chế phẩm từ bài thuốc: giảm đau, chống viêm…
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc --- DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ Số TC: TRƯỜNG ĐH DƯỢC HN Bộ môn DHCT Cao đặc HOẠT LẠC VƯƠNG Có hiệu lực từ:
Quyết định ban hành số: ngày...tháng ...năm
1. YÊU CẦU KỸ THUẬT
1.1. Công thức bào chế
1.1.1. Dược liệu
Quế chi Hai trăm gam 200 g
Hương phụ Một trăm năm mươi gam 150 g
Bạch thược Năm mươi gam 50 g
Xuyên khung Năm mươi gam 50 g
Sinh khương Năm mươi gam 50 g
Dược liệu khác (bán
hạ) Hai trăm gam 200 g
1.1.2. Dung môi chiết xuất
Nước tinh khiết Chiết 4 lần, cô dịch chiết đến thể chất cao phù hợp
1.2. Nguyên liệu, phụ liệu
Quế chi Ramulus Cinnamomi Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
Hương phụ Rhizoma Cyperi Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
Bạch thược Radix Paeoniae lactiflorae Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
Xuyên khung Rhizoma Ligustici
Sinh khương Rhizoma Zingiberis Đạt tiêu chuẩn cơ sở
Dược liệu khác (Bán
hạ) Rhizoma Pinelliae Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
Nước tinh khiết Aqua purificata Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
1.3. Yêu cầu chất lượng
1.3.1. Tính chất: Thể chất đặc quánh, đồng nhất, màu vàng nâu, thơm mùi dược liệu.
1.3.2. Độẩm: Không quá 20 %
1.3.3. Độ tan: 1 g cao đặc phải tan hoàn toàn trong 20 ml nước.
1.3.4. Định tính: Chế phẩm thể hiện phép thửđịnh tính của Quế, Hương phụ, Bạch thược.
1.3.5. Giới hạn nhiễm khuẩn: Đạt mức 4 - DĐVN IV.
1.3.6. Kim loại nặng: Không quá 20 ppm
2. PHƯƠNG PHÁP THỬ
2.1. Tính chất: Bằng cảm quan chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu.
2.2. Độ ẩm: Thử theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 11.3 - Phương pháp cất với dung môi.
2.3. Độ tan: Bằng cảm quan, 1 g cao đặc phải tan trong 20 ml nước.
2.4. Định tính
2.4.1. Định tính Quế: Phương pháp sắc ký lớp mỏng
a. Dụng cụ, thuốc thử:
- Bản mỏng silica gel GF254.
- n- Hexan, ethyl acetat, cloroform, ether ethylic (PA). - Dung dịch 2,4-dinitrophenyl hydrazin (TT).
b. Tiến hành:
- Bản mỏng: Silica gel GF254đã hoạt hóa ở 100 ± 5 oC trong 60 phút. - Dung môi khai triển: n-Hexan : cloroform : ethyl acetat (4 : 1 : 1)
- Dung dịch đối chiếu: Lấy khoảng 4 g dược liệu Quế chi cắt nhỏ, cho vào bình nón 100 ml, thêm 30 ml nước cất, đun sôi cách thủy 15 phút, để nguội, lọc thu dịch lọc. Chuyển dịch lọc vào bình gạn 100 ml, chiết với ether ethylic 3 lần, mỗi lần 15 ml, tập trung dịch chiết ether ethylic, bốc hơi dịch chiết trên cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 2ml ether ethylic được dung dịch chấm sắc kí.
- Dung dịch thử: Lấy 3 g cao cho vào bình nón 100 ml, thêm 30 ml nước cất,
đun sôi cách thủy 15 phút, để nguội, lọc thu dịch lọc. Chuyển dịch lọc vào bình gạn 100 ml, chiết với ether ethylic 3 lần, mỗi lần 15 ml, tập trung dịch chiết ether ethylic, bốc hơi dịch chiết trên cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 2ml ether ethylic được dung dịch chấm sắc kí.
- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl dung dịch đối chiếu và 5 µl dung dịch thử. Tiến hành sắc ký theo Dược điển Việt Nam IV - Phụ lục 5.4. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng. Soi dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm sau đó phun dung dịch thuốc thử 2,4- dinitrophenyl hydrazin (TT).
- Kết quả: Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc và có giá trị Rf tương đương với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
2.4.2. Định tính Hương phụ: Phương pháp sắc ký lớp mỏng
c. Dụng cụ, thuốc thử:
- Bản mỏng silica gel GF254.
- Cloroform, toluen, aceton, acid formic, amoniac, ethanol (PA).
d. Tiến hành:
- Bản mỏng: Silica gel GF254đã hoạt hóa ở 100 ± 5 oC trong 60 phút.
- Dung môi khai triển: Cloroform : Toluen : Aceton : acid formic (7 : 4 : 5 : 1,5)
- Dung dịch đối chiếu: Lấy khoảng 6 g dược liệu Hương phụ tán nhỏ chovào bình nón 100 ml, thêm 50 ml nước, đun sôi trong 60 phút (bổ sung nước nếu cần thiết), để nguội, lọc thu lấy dịch lọc. Chuyển dịch lọc vào bình gạn 150
ml, kiềm hóa bằng dung dịch ammoniac đặc đến phản ứng kiềm (pH = 9 - 10), chiết với chloroform (3 lần, mỗi lần dùng 30 ml), gạn lấy lớp chloroform, bốc hơi trên cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 2 ml ethanol
được dung dịch chấm sắc kí.
- Dung dịch thử: Lấy 6 g cao cho vào bình nón 100 ml, thêm 20 ml nước cất,
đun cách thủy, để nguội, lọc thu lấy dịch lọc. Chuyển dịch lọc vào bình gạn 150 ml, kiềm hóa bằng dung dịch amoniac đặc đến phản ứng kiềm (pH = 9 - 10), chiết với chloroform (3 lần, mỗi lần dùng 30 ml), gạn lấy lớp chloroform, bốc hơi trên cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 2 ml ethanol
được dung dịch chấm sắc kí.
- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl dung dịch đối chiếu và 5 µl dung dịch thử. Tiến hành sắc ký theo Dược điển Việt Nam IV - Phụ lục 5.4. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng. Soi dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm và 366 nm sau đó đặt bản mỏng trong bình bão hòa hơi amoniac (TT).
- Kết quả: Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc và có giá trị Rf tương đương với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
2.4.3. Định tính Bạch thược: Phương pháp sắc ký lớp mỏng
e. Dụng cụ, thuốc thử:
- Bản mỏng silica gel GF254.
- Toluen, ethyl acetat, acid formic, ethanol, n-butanol (PA). - Dung dịch vanilin trong acid sulfuric 10 % (TT).
f. Tiến hành:
- Bản mỏng: Silica gel GF254đã hoạt hóa ở 100 ± 5 oC trong 60 phút. - Dung môi khai triển: Toluen : ethyl acetat : acid formic (5 : 4 : 1)
- Dung dịch đối chiếu: Lấy khoảng 2 g dược liệu Bạch thược cắt nhỏ cho vào bình nón 100 ml, thêm 60 ml ethanol, lắc siêu âm trong 20 phút, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cắn, hòa tan cắn trong 20 ml nước, chiết bằng n- butanol đã bão hòa nước, 3 lần, mỗi lần dùng 20 ml. Gộp các dịch chiết
butanol, bốc hơi dịch chiết trên cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml ethanol được dung dịch chấm sắc kí.
- Dung dịch thử: Lấy 6 g cao cho vào bình nón 100 ml, thêm 60 ml ethanol, lắc siêu âm trong 20 phút, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cắn, hòa tan cắn trong 20 ml nước, chiết bằng n-butanol đã bão hòa nước, 3 lần, mỗi lần dùng 20 ml. Gộp các dịch chiết butanol, bốc hơi dịch chiết trên cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml ethanol được dung dịch chấm sắc kí.
- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl dung dịch đối chiếu và 5 µl dung dịch thử. Tiến hành sắc ký theo Dược điển Việt Nam IV - Phụ lục 5.4. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng, phun dung dịch vanilin trong acid sulfuric 10 % (TT).
- Kết quả: Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc và có giá trị Rf tương đương với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
2.5. Giới hạn nhiễm khuẩn: Thử theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 13.6 - Thử giới hạn nhiễm khuẩn.
2.6. Kim loại nặng: Thử theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 9.4.8 - Xác định giới hạn các tạp chất, phương pháp 3.
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc --- DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ Số TC: TRƯỜNG ĐH DƯỢC HN Bộ môn DHCT Cao đặc HOẠT LẠC VƯƠNG Có hiệu lực từ:
Quyết định ban hành số: ngày...tháng ...năm
1. YÊU CẦU KỸ THUẬT
1.1. Công thức bào chế
1.1.1. Dược liệu
Quế chi Hai trăm gam 200 g
Hương phụ Một trăm năm mươi gam 150 g
Bạch thược Năm mươi gam 50 g
Xuyên khung Năm mươi gam 50 g
Sinh khương Năm mươi gam 50 g
Dược liệu khác (Bán
hạ) Hai trăm gam 200 g
1.1.2. Dung môi chiết xuất
Ethanol 60 % Chiết 4 lần, cô dịch chiết đến thể chất cao phù hợp
1.2. Nguyên liệu, phụ liệu
Quế chi Ramulus Cinnamomi Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
Hương phụ Rhizoma Cyperi Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
Bạch thược Radix Paeoniae lactiflorae Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
Xuyên khung Rhizoma Ligustici
Sinh khương Rhizoma Zingiberis Đạt tiêu chuẩn cơ sở
Dược liệu khác (Bán
hạ) Rhizoma Pinelliae Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
Ethanol 60 % Dilutum ethanolum Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
1.3. Yêu cầu chất lượng
1.3.1. Tính chất: Thể chất đặc quánh, đồng nhất, màu nâu đen, thơm mùi dược liệu.
1.3.2. Độẩm: Không quá 20 %
1.3.3. Độ tan: 1 g cao đặc phải tan hoàn toàn trong 20 ml ethanol 60 %.
1.3.4. Định tính: Chế phẩm thể hiện phép thửđịnh tính của Quế, Hương phụ, Bạch thược.
1.3.5. Giới hạn nhiễm khuẩn: Đạt mức 4 - DĐVN IV.
1.3.6. Kim loại nặng: Không quá 20 ppm.
2. PHƯƠNG PHÁP THỬ
2.1. Tính chất: Bằng cảm quan chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu.
2.2. Độ ẩm: Thử theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 11.3 - Phương pháp cất với dung môi.
2.3. Độ tan: Bằng cảm quan, 1 g cao đặc phải tan trong 20 ml ethanol 60 % .
2.4. Định tính
2.4.1. Định tính Quế: Phương pháp sắc ký lớp mỏng
a. Dụng cụ, thuốc thử:
- Bản mỏng silica gel GF254.
- n- Hexan, ethyl acetat, cloroform, ether ethylic (PA). - Dung dịch 2,4-dinitrophenyl hydrazin (TT).