3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.4.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD)
Tiêm dung dịch mẫu 2 (nồng độ 53,45 µg / ml) ở phần thẩm định độ đúng của phương pháp với các thể tích tiêm giảm dần 20 µl; 10 µl; 5 µl; 2µl. Trên sắc ký
đồ thu được xác định đáp ứng pic tương ứng với các nồng độ.
Pha loãng dung dịch mẫu 2 bằng methanol được dung dịch có nồng độ 2,67 µg / ml, tiêm 20 µl vào hệ thống sắc ký. Ghi lại sắc ký đồ, xác định đáp ứng pic tương ứng với 6 lần tiêm.
59 3,3 LOD a δ × = (kl/tt) Trong đó: - δ : Độ lệch chuẩn của đáp ứng.
- a: Hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và đáp ứng píc. Kết quả xác định giá trị LOD của phương pháp được trình bày ở bảng 3.16.
Bảng 3.16: Kết quả xác định giá trị LOD của phương pháp
Lần tiêm Thông số 1 2 3 4 5 6 Diện tích (uAU x phút) 4962 5070 6116 6321 7634 5693 Kết quảđánh giá Độ lệch chuẩn của đáp ứng: δ = 981,66 Hệ số góc: a = 22636 Giới hạn phát hiện LOD: 0,14 µg / ml 3.4.5.7. Xác định giới hạn định lượng (LOQ)
Giá trị LOQ của phương pháp được xác định thông qua giá trị LOD bằng biểu thức:
3,3
LOQ= ×LOD (kl/tt) Giới hạn định lượng LOQ: 0,47 µg / ml
3.4.6. Xác định hàm lượng paeoniflorin trong một số mẫu cao Hoạt lạc vương
Tiến hành phân tích 12 mẫu cao Hoạt lạc vương do nhóm nghiên cứu bào chế (bao gồm cao chiết ethanol 60 % và cao chiết nước), hàm lượng paeoniflorin trong cao được tính theo công thức:
( / ) T T C C 1000 C C T m HL S K X mg g S K m × × = × × × Trong đó:
- X : Hàm lượng paeoniflorin trong mẫu cao (%).
60 - KC: Hệ số pha loãng của dung dịch chuẩn.
- ST: Diện tích pic tương ứng paeoniflorin trên sắc ký đồ của dung dịch thử. - KT: Hệ số pha loãng của dung dịch mẫu thử.
- mC: Lượng cân chuẩn paeoniflorin (g). - HLc: Hàm lượng chuẩn paeoniflorin (%). - mT: Lượng cân mẫu thử (g).
Quy đổi giữa lượng Bạch thược sử dụng trong 1 thang thuốc, tỷ lệ cao thu
được, hàm lượng paeoniflorin trong dược liệu Bạch thược. Lượng paeoniflorin trong một số mẫu cao Hoạt Lạc vương (tính theo cao khô tuyệt đối) và hiệu suất chiết paeoniflorin được thể hiện trong bảng 3.17.
Bảng 3.17: Kết quả xác định hàm lượng paeoniflorin trong một số mẫu cao Hoạt Lạc vương do nhóm nghiên cứu bào chế
Mẫu cao chiết ethanol 60 % Mẫu cao chiết nước
Mã hóa Độẩm (%) Hàm lượng Paeoniflorin trong cao (mg/g) Hiệu suất chiết (%) Mã hóa Độẩm (%) Hàm lượng Paeoniflorin trong cao (mg/g) Hiệu suất chiết (%) M1 15,59 0,84 80,0 N1 9,34 0,29 74,94 M2 16,16 0,79 75,2 N2 12,15 0,31 80,10 M3 15,24 0,98 93,3 N3 10,11 0,27 69,77 M4 12,79 0,87 82,9 N4 15,14 0,22 56,85 M5 12,92 0,76 72,4 N5 12,54 0,30 77,52 M6 13,20 0,80 76,2 N6 13,31 0,34 87,86 Nhận xét:
Mẫu cao chiết ethanol 60 %, hàm lượng paeoniflorin cao nhất trong mẫu M3, thấp nhất trong mẫu M5. Mẫu cao chiết nước, hàm lượng paeoniflorin cao nhất trong mẫu N6, thấp nhất trong mẫu N4.
61
Hai quy trình chiết xuất mà nhóm nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ chiết hoạt chất tương đối cao, lượng hoạt chất chiết được phụ thuộc vào quy trình chiết xuất (nhiệt
độ chiết xuất, nhiệt độ cô cao, kích thước dược liệu ban đầu …).
3.5. Dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao đặc Hoạt lạc vương
Sau khi tiến hành nghiên cứu, dựa vào kết quả thu được, chúng tôi dự kiến một số tiêu chí cho tiêu chuẩn chất lượng cao đặc Hoạt lạc vương như sau:
3.5.1. Dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao chiết ethanol 60 %
Yêu cầu chất lượng
Tính chất : Thể chất đặc quánh, đồng nhất, màu nâu đen, thơm mùi dược liệu.
Độẩm : Không quá 20 %
Độ tan: 1 g cao đặc tan trong 20 ml ethanol 60 %.
Định tính: Chế phẩm thể hiện phép thửđịnh tính của Quế, Hương phụ, Bạch thược.
Giới hạn nhiễm khuẩn : Đạt mức 4 - DĐVN IV.
Kim loại nặng : Không quá 20 ppm
3.5.2. Dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao chiết nước
Yêu cầu chất lượng
Tính chất : Thể chất đặc quánh, đồng nhất, màu vàng nâu, thơm mùi dược liệu.
Độẩm : Không quá 20 %
Độ tan: 1 g cao đặc tan trong 20 ml nước.
Định tính: Chế phẩm thể hiện phép thử định tính của Quế, Hương phụ, Bạch thược.
Giới hạn nhiễm khuẩn : Đạt mức 4 - DĐVN IV.
62
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Đối tượng nghiên cứu
Bài thuốc gồm 5 vị, trong đó có 4 vị: Quế chi, Hương phụ, Xuyên khung và Sinh khương có thành phần chính là tinh dầu. Tuy nhiên trong quá trình thực nghiệm thấy hàm lượng tinh dầu quá thấp, bài thuốc được dùng chủ yếu dưới dạng nước sắc, do đó, ngoài tinh dầu các thành phần khác tan trong nước cũng có tác dụng sinh học.
Nước có khả năng hòa tan rộng, lại tiến hành ở nhiệt độ cao nên cao thu
được nhiều tạp chất, một số hoạt chất có thể bị phân hủy, nhiều thành phần tan trong nước nóng nhưng bị tủa lại khi để nguội, lúc này nếu tiếp tục tiến hành loại tủa thì có thể làm mất hoạt chất. Mặt khác, ethanol là một dung môi an toàn, hòa tan
được nhiều hoạt chất, ít hòa tan tạp chất nên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu bào chế cao đặc Hoạt lạc vương với 2 dung môi là nước và ethanol 60 % để tạo ra một dạng bào chếổn định, làm nguyên liệu cho các nghiên cứu về hóa học.
Cao đặc có ưu điểm là dễ bảo quản và dễ sử dụng hơn thuốc thang, thuận tiện
để sản xuất các sản phẩm tiếp theo như chế thành cao khô, siro, viên nén, viên nang…nhưng nếu sử dụng ngay dạng thô thì cao vẫn có nhiều tạp chấtlàm cản trở quá trình bào chế viên, cốm…hoặc phải sử dụng với một lượng cao lớn mới đảm
bảo đủ hàm lượng hoạt chất cần thiết, như vậy khối lượng thuốc bệnh nhân cần
dùng quá lớn, không đảm bảo tính thực tế. Ngoài ra, tỷ lệ cao thu được khi chiết ethanol 60 % là 8,77 %, tỷ lệ này ở cao chiết nước 23,68 %, do đó, để bào chế dạng cao thuốc, cốm thuốc có thể sử dụng cao chiết nước, bào chế viên có thể sử dụng cao chiết ethanol 60 %.
Để đảm bảo bán thành phẩm trước khi tham gia vào quá trình bào chế đạt yêu cầu về hàm lượng và chất lượng cũng như góp phần vào đảm bảo cho chất lượng sản phẩm đầu ra, việc xây dựng phương pháp định tính một số vị dược liệu chủ đạo, xác định hàm lượng hoạt chất và xây dựng yêu cầu tiêu chuẩn cao đặc Hoạt lạc vương ở dạng bán thành phẩm là hết sức cần thiết. DĐVN IV hoặc một số
tiêu chuẩn cơ sở của cao thuốc chỉ đưa ra yêu cầu và phương pháp định lượng với một số hoạt chất có độc tính trong dược liệu. Với paeoniflorin trong chuyên luận
63
của dược điển Trung Quốc mới chỉđề cập đến phương pháp và yêu cầu hàm lượng paeoniflorin trong dược liệu Bạch thược. Đề tài của chúng tôi được tiến hành nhằm xây dựng phương pháp định tính một số vị dược liệu, định lượng paeoniflorin (một hoạt chất có tác dụng sinh học) và dự thảo một số tiêu chí trong tiêu chuẩn chất lượng cao đặc Hoạt lạc vương.
4.2. Phương pháp nghiên cứu Về thành phần hóa học Về thành phần hóa học
Để thẩm định dấu vân tay của các vị thuốc trong cao đặc bài thuốc, có hai phương pháp chiết hoạt chất:
- Chiết chọn lọc theo từng nhóm chất: phương pháp này loại được nhiều tạp chất và các nhóm chất khác, vì vậy sẽ cho kết quả chính xác hơn, tuy nhiên
lại tốn dung môi và nhiều công đoạn phức tạp.
- Chiết không chọn lọc: dùng dung môi methanol chiết toàn bộ các thành phần
có trong dược liệu và cao đặc (methanol là dung môi vạn năng, có khả năng
hòa tan rộng), phương pháp này nhanh, tốn ít dung môi; tuy nhiên do chiết không chọn lọc nên có thể có nhiều tạp chất và khó đưa ra nhận định cụ thể
về từng hoạt chất riêng biệt.
Vì vậy, chúng tôi chọn phương pháp chiết chọn lọc từng nhóm chất.
Kết quả định tính sơ bộ cho thấy trong cao đặc bài thuốc có các thành phần cơ bản tương tự như thành phần của các vị thuốc có trong bài thuốc, bao gồm: alcaloid, saponin, coumarin, flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid và chất béo.
Dựa vào kết quảđịnh tính hóa học thấy thành phần chính của cao đặc và các vị thuốc là alcaloid và flavonoid, do vậy để định tính xác định sự có mặt của các vị
thuốc trong cao chúng tôi tiến hành định tính 4 vị dược liệu Quế chi, Bạch thược, Hương phụ, Xuyên khung bằng SKLM cụ thể: định tính nhóm flavonoid trong Quế
chi, định tính alkaloid trong Hương phụ và Xuyên khung, định tính glycoside (bao gồm paeoniflorin và dẫn xuất) trong Bạch thược theo những cách khác nhau từ 2 loại cao và các dược liệu đối chiếu.
64
Qua quá trình nghiên cứu và triển khai sắc kí lớp mỏng, chúng tôi nhận thấy rằng, để có kết quả tốt thì cần phải thực hiện các bước khảo sát về khối lượng mẫu nghiên cứu cần dùng, hệ dung môi khai triển, lượng mẫu chấm trên bản mỏng, và tính lặp lại của kết quả.
Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học trong 2 mẫu cao cũng như kết quả
nghiên cứu định tính một số thành phần trong 2 mẫu cao bằng kỹ thuật SKLM (bán
định lượng) thấy rằng hai mẫu cao chiết nước và cao chiết ethanol có thành phần hóa học tương tự nhau. Cường độ các vết trên sắc ký bản mỏng ở hai mẫu cao về cơ
bản giống nhau.
Cần có những nghiên cứu tiếp về định tính vị dược liệu Quế chi, định tính phân biệt sự có mặt đồng thời của 2 vị dược liệu Hương phụ và Xuyên khung trong mẫu cao để có cơ sở xây dựng phương pháp thửđịnh tính tối ưu nhất đối với hai vị
dược liệu Quế và Hương phụ.
Xây dựng phương pháp định lượng paeoniflorin trong cao Hoạt lạc vương
Điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC - UV
Trong quá trình nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paeoniflorin, thông qua các kết quả thực nghiệm, kết hợp cùng một số tài liệu tham khảo, chúng tôi đã lựa chọn được các thông sốđể tiến hành sắc ký như sau:
- Cột C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm)
- Pha động: Acetonitril - dung dịch acid phosphoric 1 % (14 - 86) - Detector UV: 230 nm.
- Tốc độ: 1 ml/ phút. - Thể tích tiêm: 20 µl.
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
Đây là các thông số phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm và với đa số hệ
thống HPLC. Điểm khác biệt trong nghiên cứu là khảo sát, đánh giá cách xử lý mẫu phân tích bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng. Phương pháp này phổ biến và phù
65
hợp với điêu kiện đa số phòng thí nghiệm đảm bảo định lượng được hoạt chất paeoniflorin trong cao đặc dược liệu gồm nhiều thành phần hóa học khác nhau.
Thẩm định quy trình xây dựng
Dựa trên tính chất paeoniflorin hấp thu UV và có bước sóng cực đại λ = 230nm, nghiên cứu sử dụng hệ thống HPLC có detector UV, đây là thiết bị hiện đại thông dụng dùng trong định tính và định lượng các hoạt chất. Đã xác định được lượng hoạt chất paeoniflorin có trong các mẫu cao và xây dựng được phương pháp
định lượng paeoniflorin trong cao đặc. Phương pháp định lượng paeoniflorin trong mẫu cao có độđặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độđúng cao, có thểđịnh lượng paeoniflorin trong mẫu cao ở nồng độ khoảng 0,5 µg/ ml.
. Các kết quả thực nghiệm trên đã chứng minh phương pháp định lượng paeoniflorin trong cao Hoạt lạc vương bằng HPLC - UV của chúng tôi có độ ổn
định tốt.
4.3. Kết quả nghiên cứu
Kết quả định tính sơ bộ bằng phương pháp hóa học thì trong cao đặc bài thuốc có các thành phần cơ bản tương tự như thành phần của các vị thuốc có trong bài thuốc, bao gồm: alcaloid, saponin, coumarin, flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid và chất béo.
Quế chi (cao) có chứa: coumarin, flavonoid, tanin, đường khử.
Bạch thược có: flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid và chất béo.
Hương phụ (cao) có: alcaloid, saponin, flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid.
Xuyên khung (cao) có: alcaloid, đường khử và chất béo.
Quá trình nghiên cứu và triển khai sắc kí lớp mỏng, nhóm nghiên cứu nhận thấy để có kết quả tốt thì cần phải thực hiện các bước khảo sát về lựa chọn nhóm chất định tính, cách xử lý mẫu, hệ dung môi khai triển, phương pháp phát hiện và
66
Kết quả nghiên cứu định tính một số thành phần bằng SKLM thấy rằng hai mẫu cao chiết nước và cao chiết ethanol có thành phần hóa học tương tự nhau. Cường độ các vết trên sắc ký bản mỏng ở hai mẫu cao về cơ bản giống nhau.
Kết quả định lượng hoạt chất paeoniflorin trong cao cho thấy quy trình chiết xuất (bao gồm dung môi chiết xuất) mà nhóm nghiên cứu lựa chọn chiết hoạt chất với tỷ lệ tương đối cao, lượng hoạt chất chiết được phụ thuộc vào nhiệt độ chiết xuất, nhiệt độ cô cao, kích thước dược liệu ban đầu …
67
KẾT LUẬN VÀ KIỂN NGHỊ
1. Kết luận
Đề tài đã hoàn thành được mục tiêu đề ra:
1.1. Xây dựng phương pháp định tính một số vị dược liệu
Định tính bằng phương pháp hóa học
Thành phần các nhóm chất hóa học trong cao đặc và các vị thuốc: - Quế chi có: coumarin, flavonoid, tanin, đường khử.
- Bạch thược có: flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid và chất béo.
- Hương phụ có: alcaloid, saponin, flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid.
- Xuyên khung có: alcaloid, đường khử và chất béo.
- Cao chiết nước và cao chiết ethanol có các thành phần cơ bản tương tự như
thành phần của các vị thuốc có trong bài thuốc, bao gồm: alcaloid, saponin, coumarin, flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid và chất béo. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Định tính flavonoid trong Quế chi
- Sắc kí đồ ở bước sóng 254 nm cho kết quả hiện vết và tách vết tốt nhất: cao chiết nước có 5 vết, cao chiết ethanol 60 % có 5 vết, Quế chi có 4 vết, các vết
đều có màu đen. Trong đó:
- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 2 vết tương đương với Quế chi (màu đen, Rf* = 6, 37).
Định tính glycoside và dẫn xuất trong Bạch thược
- Sắc kí đồở bước sóng 254 nm cho kết quả hiện vết và tách vết tốt: cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 5 vết, Bạch thược có 1 vết, các vết có màu
đen. Trong đó:
- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 1 vết tương đương với Bạch thược (màu đen, Rf* = 33).
68
- Khi phun thuốc thử vanillin trong acid sulfuric 10 % quan sát được rõ các vết. Trong đó:
- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có nhiều vết, Bạch thược có 4 vết, các vết có màu tím - hồng.
- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 2 vết tương đương với Bạch thược (màu hồng, Rf* = 33, 38).
- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có các vết tương tự nhau.
Định tính alkaloid trong Hương phụ và Xuyên khung
- Sắc kí đồ ở bước sóng 254 nm thấy: cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 5 vết, Hương phụ có 4 vết, Xuyên khung có 2 vết, các vết có màu đen. Trong đó:
- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 2 vết tương đương với Hương phụ (màu đen, Rf*= 50, 65), 1 vết tương đương với Xuyên khung (màu đen, Rf*= 46).
Định tính đồng thời Quế chi, Hương phụ và Bạch thược
- Sắc kí đồ sau khi hiện màu bằng hơi NH3đặc thấy: cao chiết nước có 5 vết, cao chiết ethanol 60 % và Quế chi có 3 vết, Hương phụ có 5 vết, Bạch thược có 2 vết. Trong đó:
- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 1 vết tương đương với Quế chi