Định tính Bạch thược

3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.3.2. Định tính Bạch thược

Điều kiện sắc kí

Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel GF254, hoạt hóa ở 1100C trong 60 phút. Pha động: Khảo sát trên 3 hệ dung môi:

- Hệ 1: Cloroform : ethyl acetat : methanol : acid formic (40 : 5 : 10 : 0,2)

- Hệ 2: Ethyl acetat : acid acetic : acid formic : nước (10 : 1 : 1 : 1) - Hệ 3: Toluen : ethyl acetat : acid formic (5 : 4 : 1)

Thể tích mẫu: 5 µl/mẫu.

Phát hiện: Soi đèn UV ở 254 nm, Soi đèn UV ở 366 nm,

Phun dung dịch vanillin trong acid sulfuric 10 % .

Dung dịch thử

MNC: - Cao chiết nước: 6g - Cao chiết ethanol 60 %: 2g MNC cho vào bình nón 100 ml, thêm 60 ml ethanol, lắc siêu âm trong 20 phút, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cắn, hòa tan cắn trong 20 ml nước, chiết bằng n-butanol đã bão hòa nước, 3 lần, mỗi lần dùng 20 ml. Gộp các dịch chiết butanol, bốc hơi dịch chiết trên cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml ethanol được dung dịch chấm sắc kí.

Dung dịch đối chiếu

Lấy khoảng 2 g dược liệu Bạch thược cắt nhỏ cho vào bình nón 100 ml, thêm 60 ml ethanol, lắc siêu âm trong 20 phút, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cắn, hòa tan cắn trong 20 ml nước, chiết bằng n-butanol đã bão hòa nước, 3 lần, mỗi lần

dùng 20 ml. Gộp các dịch chiết butanol, bốc hơi dịch chiết trên cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml ethanol được dung dịch chấm sắc kí.

Triển khai sắc ký

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl dung dịch đối chiếu và 5 µl dung dịch thử. Tiến hành sắc ký theo Dược điển Việt Nam IV - Phụ lục 5.4. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng. Soi đèn UV ở bước sóng 254 nm và 366 nm, phun thuốc thử vanillin trong acid sulfuric 10 %.

Kết quả

Trong các hệ dung môi trên thì hệ dung môi 3 cho kết quả hiện vết và tách vết tốt nhất. Kết quả được trình bày trong hình 3.02 và bảng 3.06 và bảng 3.07.

A B C

Hình 3.02: Sắc kí đồđịnh tính Bạch thược

37 Bảng 3.06: Kết quả SKLM định tính Bạch thược ở bước sóng 254 nm Mẫu thử nghiệm Vết Rf * =

Rf x 100 Màu sắc Cao chiết nước Cao chiết ethanol 60% Bạch thược 1 33 Đen +++ +++ +++ 2 38 Đen +++ +++ - 3 45 Đen +++ +++ - 4 53 Đen +++ +++ - 5 64 Đen +++ +++ -

Nhận xét: Dựa vào sắc kí đồ trên nhận thấy ở bước sóng 254 nm các vết tách tốt và có vết tương ứng với nhau, trong đó:

- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 5 vết, Bạch thược có 1 vết, các vết có màu đen.

- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 1 vết tương đương với Bạch thược (màu đen, Rf* = 33).

- Cao chiết nước có 5 vết tương đương với cao chiết ethanol 60 % (màu đen, Rf* = 33, 38, 45, 53, 64)

Bảng 3.07: Kết quả SKLM định tính Bạch thược khi phun thuốc thử vanillin trong acid sulfuric 10 %

Mẫu thử nghiệm Vết Rf

* =

Rf x 100 Màu sắc Cao chiết nước Cao chiết ethanol 60 % Bạch thược 1 33 Hồng tím ++ ++ ++ 2 38 Hồng tím ++ ++ ++ 3 53 Hồng tím - - +++ 4 64 Hồng tím - - +++

Nhận xét: Khi phun thuốc thử vanillin trong acid sulfuric 10 % quan sát được rõ các vết, số lượng vết quan sát được như sau:

- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có nhiều vết, Bạch thược có 4 vết, các vết có màu tím - hồng.

- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 2 vết tương đương với Bạch thược (màu hồng, Rf* = 33, 38).

- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có các vết tương tự nhau.

3.3.3. Định tính Hương Phụ và Xuyên khung

Điều kiện sắc kí

Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel GF254, hoạt hóa ở 1100C trong 60 phút. Pha động: Khảo sát trên 3 hệ dung môi

- Hệ 1: n-Hexan : ethyl acetat (2 : 1) - Hệ 2: Cloroform : methanol (9 : 1)

- Hệ 3: Cloroform : Toluen : Aceton : acid formic (7 : 4 : 5 : 1,5) Thể tích mẫu: 5 µl/mẫu.

Phát hiện: Soi đèn UV ở 254 nm.

Soi đèn UV ở 366 nm.

Hiện hơi amoniac bão hòa.

Dung dịch mẫu thử

MNC: - Cao chiết nước: 6g - Cao chiết ethanol 60 %: 2g MNC cho vào bình nón 100 ml, thêm 20 ml nước cất, đun cách thủy, để

nguội, lọc thu lấy dịch lọc. Chuyển dịch lọc vào bình gạn 100 ml, kiềm hóa bằng dung dịch amoniac đặc đến phản ứng kiềm (pH = 9 - 10), chiết với chloroform (3 lần, mỗi lần dùng 30 ml), gạn lấy lớp chloroform, bốc hơi trên cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 2 ml ethanol được dung dịch chấm sắc kí.

Dung dịch đối chiếu Hương phụ

Lấy khoảng 6 g dược liệu Hương phụ tán nhỏ chovào bình nón 100 ml, thêm 50 ml nước, đun sôi trong 60 phút (bổ sung nước nếu cần thiết), để nguội, lọc thu lấy dịch lọc. Chuyển dịch lọc vào bình gạn 100 ml, kiềm hóa bằng dung dịch amoniac đặc đến phản ứng kiềm (pH = 9 - 10), chiết với chloroform (3 lần, mỗi lần

dùng 30 ml), gạn lấy lớp chloroform, bốc hơi trên cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 2 ml ethanol được dung dịch chấm sắc kí.

Dung dịch đối chiếu Xuyên khung

Lấy khoảng 2 g dược liệu Xuyên khung tán nhỏ cho vào bình nón 100 ml, thêm 50 ml nước, đun sôi trong 60 phút (bổ sung nước nếu cần thiết), để nguội, lọc thu lấy dịch lọc. Chuyển dịch lọc vào bình gạn 100 ml, kiềm hóa bằng dung dịch amoniac đặc đến phản ứng kiềm (pH = 9 - 10), chiết với chloroform (3 lần, mỗi lần dùng 30 ml), gạn lấy lớp chloroform, bốc hơi trên cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 2 ml ethanol được dung dịch chấm sắc kí.

Triển khai sắc ký

Kết quả

Trong các hệ dung môi trên thì hệ dung môi 3 cho kết quả hiện vết và tách vết tốt nhất. Kết quảđược trình bày trong hình 3.03 và bảng 3.08; bảng 3.09.

A B

Hình 3.03: Sắc kí đồ định tính Hương phụ và Xuyên khung

A - 254 nm B - 366 nm

Bảng 3.08: Kết quả SKLM định tính Hương phụ và Xuyên khung

ở bước sóng 254 nm

Mẫu thử nghiệm Vết Rf

* =

Rf x 100 Màu sắc Cao chiết nước Cao chiết ethanol 60 % Hương phụ Xuyên khung 1 44 Đen - - + - 2 46 Đen ++ +++ - +++ 3 50 Đen + +++ ++ - 4 54 Đen + - - - 5 65 Đen + + + - 6 72 Đen + +++ - - 7 78 Đen - - - + 8 81 Đen - + + -

Nhận xét: Dựa vào sắc kí đồ trên nhận thấy ở bước sóng 254 nm quan sát

được rõ các vết:

- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 5 vết, Hương phụ có 4 vết, Xuyên khung có 2 vết, các vết có màu đen.

- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 2 vết tương đương với Hương phụ (màu đen, Rf* = 50, 65), 1 vết tương đương với Xuyên khung (màu đen, Rf*= 46).

- Cao chiết nước có 4 vết tương đương với cao chiết ethanol 60 % (màu đen, Rf*= 46, 50, 65, 72).

- Ở bước sóng 254 nm có 2 cụm vết có thể phân biệt được đồng thời 2 dược liệu Hương phụ - Xuyên khung trong mẫu thử tuy nhiên vết không rõ ràng.

Bảng 3.09: Kết quả SKLM định tính Hương phụ và Xuyên khung

ở bước sóng 366 nm

Mẫu thử nghiệm Vết Rf

* =

Rf x 100 Màu sắc Cao chiết nước Cao chiết ethanol 60 % Hương phụ Xuyên khung 1 5 Xanh - + - - 2 6 Xanh - + - - 3 32 Xanh - ++ - - 4 34 Xanh - ++ - - 5 40 Xanh - ++ - - 6 76 Xanh ++ - - - 7 78 Xanh + ++ - ++ 8 81 Xanh - +++ + +++

Nhận xét: Dựa vào sắc kí đồ trên nhận thấy ở bước sóng 366 nm quan sát

được rõ các vết:

- Cao chiết nước có 2 vết phát quang, cao chiết ethanol 60 % có 7 vết phát quang.

42 - Hương phụ: Có 1 vết phát quang. - Xuyên khung: Có 2 vết phát quang.

- Chuẩn đối chiếu Xuyên khung có 1 vết phát quang mà chuẩn đối chiếu Hương phụ không có Rf*= 78.

- Mẫu cao chiết ethanol 60 % có 2 vết tương ứng với cả Hương phụ và Xuyên khung.

Ở bước sóng 366 nm. Không có vết đặc trưng để phân biệt được đồng thời 2 dược liệu Hương phụ - Xuyên khung trong mẫu thử.

3.3.4. Định tính Bạch thược, Hương phụ và Quế chi

Điều kiện sắc kí

Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel GF254, hoạt hóa ở 1100C trong 60 phút. Pha động: Khảo sát trên 4 hệ dung môi

- Hệ 1: Toluen : cloroform : aceton (8 : 5 : 7)

- Hệ 2: Ethyl acetat : cloroform : acid formic (3 : 2,5 : 1) - Hệ 3: Cloroform : methanol : acid formic (7 : 1 : 1) - Hệ 4: Toluen : ethyl acetat : acid formic (6 : 6 : 1,5)

Thể tích mẫu: MNC, Quế chi, Bạch thược: 5 µl/mẫu. Hương phụ: 10 µl/mẫu.

Phát hiện: Soi đèn UV ở 254 nm Soi đèn UV ở 366 nm

Hiện vết bằng hơi amoniac bão hòa.

Dung dịch mẫu thử

MNC: - Cao chiết nước: 6g - Cao chiết ethanol 60%: 2g MNC cho vào bình nón 100 ml, thêm 30 ml ethanol 90 %, đun cách thủy 30

phút. Lọc nóng, dịch lọc đem cô cách thủy thành cắn. Hòa tan cắn trong 15 ml nước, lọc qua giấy lọc. Tập trung dịch lọc, chiết loại tạp 2 lần bằng ether ethylic, mỗi lần dùng 15 ml. Dịch chiết nước chiết 3 lần bằng ethyl acetat, mỗi lần dùng 20 ml. Tập trung dịch chiết ethyl acetat, bốc hơi trên cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml ethanol được dung dịch chấm sắc ký.

43 Dung dịch mẫu đối chiếu

Dược liệu đối chiếu tương ứng:

- Quế chi: 8g - Hương phụ: 6g

- Bạch thược: 2g

Lượng cân dược liệu đối chiếu, cắt nhỏ cho vào bình nón nút mài 100 ml, thêm 50 ml ethanol 90 %, đun cách thủy 30 phút. Lọc nóng, dịch lọc đem cô cách thủy thành cắn. Hòa tan cắn trong 15 ml nước, lọc qua giấy lọc. Tập trung dịch lọc, chiết loại tạp 2 lần bằng ether ethylic, mỗi lần dùng 15 ml. Dịch chiết nước chiết 3 lần bằng ethyl acetat, mỗi lần dùng 20 ml. Tập trung dịch chiết ethyl acetat, bốc hơi trên cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml ethanol được dung dịch chấm sắc ký.

Triển khai sắc ký

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl dung dịch đối chiếu Quế chi, Bạch thược, 10 µl đối chiếu Hương phụ và 5 µl dung dịch thử. Tiến hành sắc ký theo Dược điển Việt Nam IV - Phụ lục 5.4. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ở

nhiệt độ phòng. Soi đèn UV ở bước sóng 254 nm, 366 nm, hiện vết bằng hơi amoniac bão hòa.

Kết quả

Trong các hệ dung môi trên thì hệ dung môi 3 cho kết quả hiện vết và tách vết tốt nhất. Kết quảđược trình bày trong hình 3.04 và bảng 3.10.

A B C

Hình 3.04: Sắc kí đồđịnh tính Bạch thược, Hương phụ và Quế chi

A - 254 nm B - 366 nm C - Hiện màu

Bảng 3.10: Kết quả SKLM định tính Bạch thược, Hương phụ và Quế chi khi hiện màu bằng hơi amoniac Mẫu thử nghiệm Vết Rf * = Rfx100 Màu sắc Cao chiết nước Cao chiết ethanol 60 % Quế chi Hương phụ Bạch thược 1 5 Đen - - + - - 2 6 Đen + + - - + 3 9 Vàng - - - +++ - 4 12 Đen ++ + - - +++ 5 19 Đen - - - ++ - 6 29 Vàng +++ + +++ + - 7 37 Vàng - - - + - 8 42 Vàng + - + - - 9 46 Vàng + - - + -

Nhận xét: Dựa vào sắc kí đồ trên nhận thấy sau khi hiện màu bằng hơi amoniac đặc quan sát các vết tách tốt và có vết tương ứng với nhau, trong đó:

- Cao chiết nước có 5 vết, cao chiết ethanol 60 % và Quế chi có 3 vết, Hương phụ có 5 vết, Bạch thược có 2 vết.

- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 1 vết tương đương với Quế chi và Hương phụ (màu vàng, Rf* = 29), có 2 vết tương đương với Bạch thược (màu đen, Rf* = 6, 12).

- Cao chiết nước có thêm 1 vết tương đương với Hương phụ (màu vàng, Rf* = 46), 1 vết tương đương với Quế chi (màu vàng, Rf* = 42).

- Cao chiết nước có 3 vết tương đương với cao chiết ethanol 60 % (Rf* = 6, 12, 29).

Nhận xét chung:

Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học trong 2 mẫu cao cũng như kết quả

nghiên cứu định tính một số thành phần trong 2 mẫu cao bằng kỹ thuật SKLM (bán

định lượng) thấy rằng hai mẫu cao chiết nước và cao chiết ethanol có thành phần hóa học tương tự nhau. Cường độ các vết trên sắc ký bản mỏng ở hai mẫu cao về cơ

bản giống nhau.

- Trong bào chế viên nang cứng Hoạt lạc vương, cao chiết ethanol 60 % là sự

lựa chọn ưu việt hơn cho nghiên cứu. Trong bào chế dạng thuốc cốm, thuốc bột, cao chiết ethanol 60 % và cao chiết nước đều phù hợp cho nghiên cứu - Paeoniflorin là một hoạt chất có tác dụng sinh học trong bài thuốc, tan trong

nước, tan trong ethanol. Việc định lượng paeoniflorin trong cao thuốc là một hướng được nhóm nghiên cứu quan tâm, đồng thời paeoniflorin được coi là một hoạt chất chỉ thị đánh giá hiệu suất chung của quy trình chiết hoạt chất trong các vị thuốc của bài thuốc.

3.4. Định lượng paeoniflorin trong cao Hoạt lạc bằng phương pháp HPLC

Vị thuốc Bạch thược (hình 3.05) đã qua chế biến, được cung cấp bởi Phòng chẩn trị Phùng Gia Đường (số 4 ngõ 99 phố Trung Kính, Cầu Giấy, Hà Nội) được kiểm tra các đặc điểm vi phẫu [13] (hình 3.06), độẩm. Hình 3.05: Ảnh vị thuốc Bạch thược Hình 3.06: Ảnh đặc điểm vi học bột Bạch thược Nhận xét: Đặc điểm hình thái và đặc điểm bột của Bạch thược phù hợp với mô tả trong DĐVN IV.

Độẩm: 9,15% - Đạt yêu cầu trong DĐVN IV

Tiến hành định lượng paeoniflorin theo chuyên luận Bạch thược - Dược điển Trung quốc 2010 [24].

Dung dịch thử:

Cân chính xác khoảng 1 g dược liệu Bạch thược đã tán mịn vào bình định mức 50 ml, thêm 30 ml methanol, lắc siêu âm ở 60 oC trong 1h. Để nguội, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc, lọc qua màng lọc 0,45 µm được dung dịch tiêm sắc ký.

Dung dịch chuẩn:

Chuẩn paeoniflorin:

Nguồn gốc: Sigma Hàm lượng: 98,0 %

- Cân 0,02227 g chất chuẩn paeoniflorin vào bình định mức 50 ml, hòa tan và pha loãng bằng methanol vừa đủ 50,0 ml (nồng độ chuẩn gốc 445,4 µg/ ml).

- Hút 2,0 ml dung dịch trên vào bình định mức 20 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm được dung dịch tiêm sắc ký.

Điều kiện sắc ký:

- Cột C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm)

- Pha động: Acetonitril - dung dịch acid phosphoric 1 % (17 - 83) - Detector UV: 230 nm.

- Tốc độ: 1 ml/ phút. - Thể tích tiêm: 20 µl.

Tiêm lượt các dung dịch chuẩn, dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ. Hàm lượng paeoniflorin trong dược liệu Bạch thược (theo dược liệu khô kiệt) được tính theo công thức sau:

(%) 100 (100 ) C C T T C C T am m HL S K X S K m HL × × = × × × × − Trong đó:

- X : Hàm lượng paeoniflorin trong dược liệu Bạch thược (%). - SC: Diện tích pic paeoniflorin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn.

Giới hạn phát hiện (LOD)