Xây dựng quy trình định lượng paeoniflorin trong c- 123docz.net

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

2.3.3. Xây dựng quy trình định lượng paeoniflorin trong cao Hoạt lạc vương bằng

Xây dựng quy trình phân tích

- Lựa chọn pha tĩnh (cột sắc ký) - Lựa chọn pha động.

- Chuẩn bị dung dịch thử. - Chuẩn bị dung dịch đối chiếu. - Phương pháp phát hiện.

Thẩm định quy trình phân tích với các tiêu chí đánh giá

- Tính đặc hiệu. - Độđúng. - Độ chính xác (Độ lặp lại) - Giới hạn phát hiện. - Giới hạn định lượng. - Độ tuyến tính. - Khoảng tuyến tính.

- Đánh giá độ thu hồi của phương pháp xử lý mẫu phân tích.

Tiến hành định lượng paeoniflorin trong một số mẫu cao Hoạt lạc vương. 2.3.4. “Dự thảo” tiêu chuẩn cao Hoạt lạc vương

2.4. Phương pháp xử lý số liệu

Dựa vào phần mềm Microsoft Excel xử lý thống kê các kết quả thu được.

2.5. Đánh giá kết quả

Các kết quả thu được phải được đánh giá song song với các tiêu chuẩn được quy định trong Dược điển, tiêu chuẩn nguyên liệu.

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của mẫu cao Hoạt lạc vương

Mẫu cao được đánh giá một số tiêu chí theo quy định của DĐVN IV, phụ lục 1.1 [8], kết quảđánh giá được thể hiện trong bảng 3.01.

Mẫu cao nghiên cứu được mã hóa theo bảng 3.02 và bảng 3.03.

Bảng 3.01: Kết quảđánh giá chất lượng mẫu cao Hoạt lạc vương

Tiêu chí Phương pháp thử Kết quả

Thể chất, màu sắc, mùi vị

Cảm quan: Cao có màu nâu đen hoặc màu vàng nâu, đồng nhất, thể chất dẻo, mùi thơm, vịđắng Đạt Độẩm DĐVN IV, phụ lục 11.3 - Phương pháp cất với dung môi Đạt Độ tan

Cảm quan: 1 g cao đặc tan trong 20 ml dung môi được dùng để chiết xuất khi bào chế cao

Đạt

Kim loại nặng DĐVN IV, phụ lục 9.4.8 - Phương pháp 3 Đạt (<10 ppm) Giới hạn nhiễm

Bảng 3.02: Mã hóa các mẫu cao chiết ethanol 60 %

Mã hóa Khối lượng dược liệu (g) (2 thang) Khối lượng cao (g) Tỷ lệ cao thu được (%) Độ ẩm (%) Thể chất, màu sắc, mùi vị M1 141,28 11,43 8,09 15,59 M2 142,32 13,80 9,70 16,16 M3 142,01 13,03 9,18 15,24 M4 141,53 11,98 8,46 12,79 M5 143,23 12,06 8,24 12,92 M6 142,10 12,73 8,95 13,20 TB 8,77 13,65 - Thể chất dẻo dai, đồng nhất. - Màu đen. - Mùi thơm. - Vịđắng.

Bảng 3.03: Mã hóa các mẫu chiết nước

Mã hóa Khối lượng dược liệu (g) (4 thang) Khối lượng cao (g) Tỷ lệ cao thu được (%) Độ ẩm (%) Thể chất, màu sắc, mùi vị N1 280,42 64,12 22,87 9,34 N2 280,62 66,32 23,63 12,15 N3 280,40 66,79 23,82 10,11 N4 281,45 67,62 24,02 15,14 N5 280,79 66,65 23,74 12,54 N6 281,34 67,46 23,97 13,31 TB 23,68 12,10 - Thể chất dẻo dai, đồng nhất. - Màu vàng nâu. - Mùi thơm. - Vịđắng.

3.2. Định tính các nhóm chất chính trong cao và dược liệu bằng phương pháp hóa học pháp hóa học

Nhóm nghiên cứu tiến hành định tính một số nhóm chất chính: alcaloid, flavonoid, saponin, coumarin… trong cao bằng phản ứng hóa học với các thuốc thử

chung và thuốc thửđặc hiệu của từng nhóm. Kết quả định tính các nhóm chất bằng phản ứng hoá học được tóm tắt ở bảng 3.04.

Bảng 3.04: Kết quảđịnh tính thành phần hóa học trong cao và các vị thuốc

Kết quả STT Nhóm chất Phản ứng định tính QC HP BT XK CN CE TT Mayer - + - + + + TT Bouchardat - ++ - ++ ++ +++ 1 Alcaloid TT Dragendoff - ++ - ++ +++ ++ Hiện tượng tạo bọt - ++ - - ++ ++ 2 Saponin Pứ Salkowski - ++ - - ++ ++ Đóng, mở vòng lacton - - - - - - Diazo ++ - - - +++ +++ 3 Coumarin Tăng huỳnh quang +++ - - - +++ ++ Cyanidin +++ + ++ - +++ ++ Sắt (III) clorid +++ ++ ++ ++ +++ +++ Kiềm +++ ++ + - +++ +++ 4 Flavonoid Diazo ++ + + - +++ +++ Sắt (III) clorid +++ ++ +++ ++ +++ +++ Chì acetat +++ + + - +++ +++ 5 Tanin Gelatin 1% ++ + ++ - ++ +

6 Acid amin TT Ninhydrin - ++ +++ - +++ +++

7 Đường khử TT Felling A và

B +++ +++ +++ ++ +++ +++

8 Acid hữu cơ Natri carbonat + + + + ++ ++

9 Polysacch-

Vết mờ/giấy lọc - - - -

10 Chất béo Sterol - - +++ ++ +++ ++

Ghi chú:

(-) : Phản ứng âm tính. (+) : Phản ứng dương tính.

(++) : Phản ứng dương tính rõ. (+++) : Phản ứng dương tính dương rất rõ

Nhận xét

Cao đặc chiết nước và ethanol 60 % đều có: alcaloid, saponin, coumarin, flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid và chất béo.

Quế chi (cao) có chứa: coumarin, flavonoid, tanin, đường khử.

Bạch thược có: flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid và chất béo.

Hương phụ (cao) có: alcaloid, saponin, flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid.

Xuyên khung (cao) có: alcaloid, đường khử và chất béo.

3.3. Định tính các vị dược liệu Quế chi, Hương phụ, Xuyên khung, Bạch

thược trong cao Hoạt lạc vương bằng phương pháp SKLM

3.3.1. Định tính Quế chi

Điều kiện sắc kí

Pha tĩnh: Bản mỏngSilica gel GF254, hoạt hóa ở 110 0C trong 60 phút. Pha động: n-Hexan : cloroform : ethyl acetat (4 : 1 : 1)

Thể tích mẫu: 4µl/mẫu.

Phát hiện: Soi đèn UV ở bước sóng 254 nm. Soi đèn UV 366 nm.

Phun dung dịch 2,4-dinitrophenyl hydrazin.

Dung dịch thử

MNC cho vào bình nón 100 ml, thêm 30 ml nước cất, đun sôi cách thủy 15 phút, để nguội, lọc thu dịch lọc. Chuyển dịch lọc vào bình gạn 100 ml, chiết với ether ethylic 3 lần, mỗi lần 15 ml, tập trung dịch chiết ether ethylic, bốc hơi dịch chiết trên cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 2ml ether ethylic được dung dịch chấm sắc kí.

Dung dịch đối chiếu

Lấy khoảng 4 g dược liệu Quế chi cắt nhỏ, cho vào bình nón 100 ml, thêm 30 ml nước cất, đun sôi cách thủy 15 phút, để nguội, lọc thu dịch lọc. Chuyển dịch lọc vào bình gạn 100 ml, chiết với ether ethylic 3 lần, mỗi lần 15 ml, tập trung dịch chiết ether ethylic, bốc hơi dịch chiết trên cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 2ml ether ethylic được dung dịch chấm sắc kí.

Triển khai sắc ký

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 4 µl dung dịch đối chiếu và 4 µl dung dịch thử. Tiến hành sắc ký theo Dược điển Việt Nam IV - Phụ lục 5.4. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng. Soi đèn UV ở bước sóng 254 nm và 366 nm, phun dung dịch 2,4-dinitrophenyl hydrazin.

Kết quả

- Hệ dung môi cho kết quả hiện vết và tách tốt.

- Quan sát dưới đèn UV ở 254 nm, 366 nm: sắc ký đồ của dung dịch thử cho vết có cùng màu sắc và giá trị Rf tương đương với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Kết quảđược trình bày trong hình 3.01 và bảng 3.05 - Phun dung dịch 2,4-dinitrophenyl hydrazin (thuốc thửđặc trưng của aldehyd

cinnamic trong tinh dầu quế) không phát hiện vết trên sắc ký đồ của dung dịch thử.

34 A B Hình 3.01: Sắc kí đồđịnh tính Quế chi A - 254 nm B - 366nm Bảng 3.05: Kết quả SKLM định tính Quế chi ở bước sóng 254 nm Mẫu thử nghiệm Vết Rf * =

Rf x 100 Màu sắc Cao chiết nước Cao chiết ethanol 60% Quế chi 1 6 Đen ++ ++ ++ 2 23 Đen - + ++ 3 37 Đen +++ +++ +++ 4 48 Đen + + 5 52 Đen - - +++ 6 59 Đen - + - 7 62 Đen + - - 8 74 Đen + - -

Khi quan sát ở bước sóng 254 nm cho kết quả hiện vết và tách vết tốt nhất. - Cao chiết nước có 5 vết, cao chiết ethanol 60 % có 5 vết và Quế chi có 4 vết,

- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 2 vết tương đương với Quế chi (màu đen, Rf* = 6, 37).

- Cao chiết ethanol 60 % có thêm 1 vết tương đương với Quế chi (màu đen, Rf* = 23).

- Cao chiết nước có thêm 1 vết tương đương với cao chiết ethanol 60 % (màu

đen, Rf* = 48).

3.3.2. Định tính Bạch thược

Điều kiện sắc kí

Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel GF254, hoạt hóa ở 1100C trong 60 phút. Pha động: Khảo sát trên 3 hệ dung môi:

- Hệ 1: Cloroform : ethyl acetat : methanol : acid formic (40 : 5 : 10 : 0,2)

- Hệ 2: Ethyl acetat : acid acetic : acid formic : nước (10 : 1 : 1 : 1) - Hệ 3: Toluen : ethyl acetat : acid formic (5 : 4 : 1)

Thể tích mẫu: 5 µl/mẫu.

Phát hiện: Soi đèn UV ở 254 nm, Soi đèn UV ở 366 nm,

Phun dung dịch vanillin trong acid sulfuric 10 % .

Dung dịch thử

MNC: - Cao chiết nước: 6g - Cao chiết ethanol 60 %: 2g MNC cho vào bình nón 100 ml, thêm 60 ml ethanol, lắc siêu âm trong 20 phút, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cắn, hòa tan cắn trong 20 ml nước, chiết bằng n-butanol đã bão hòa nước, 3 lần, mỗi lần dùng 20 ml. Gộp các dịch chiết butanol, bốc hơi dịch chiết trên cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml ethanol được dung dịch chấm sắc kí.

Dung dịch đối chiếu

Lấy khoảng 2 g dược liệu Bạch thược cắt nhỏ cho vào bình nón 100 ml, thêm 60 ml ethanol, lắc siêu âm trong 20 phút, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cắn, hòa tan cắn trong 20 ml nước, chiết bằng n-butanol đã bão hòa nước, 3 lần, mỗi lần

dùng 20 ml. Gộp các dịch chiết butanol, bốc hơi dịch chiết trên cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 2 ml ethanol được dung dịch chấm sắc kí.

Triển khai sắc ký

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl dung dịch đối chiếu và 5 µl dung dịch thử. Tiến hành sắc ký theo Dược điển Việt Nam IV - Phụ lục 5.4. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng. Soi đèn UV ở bước sóng 254 nm và 366 nm, phun thuốc thử vanillin trong acid sulfuric 10 %.

Kết quả

Trong các hệ dung môi trên thì hệ dung môi 3 cho kết quả hiện vết và tách vết tốt nhất. Kết quả được trình bày trong hình 3.02 và bảng 3.06 và bảng 3.07.

A B C

Hình 3.02: Sắc kí đồđịnh tính Bạch thược

37 Bảng 3.06: Kết quả SKLM định tính Bạch thược ở bước sóng 254 nm Mẫu thử nghiệm Vết Rf * =

Rf x 100 Màu sắc Cao chiết nước Cao chiết ethanol 60% Bạch thược 1 33 Đen +++ +++ +++ 2 38 Đen +++ +++ - 3 45 Đen +++ +++ - 4 53 Đen +++ +++ - 5 64 Đen +++ +++ -

Nhận xét: Dựa vào sắc kí đồ trên nhận thấy ở bước sóng 254 nm các vết tách tốt và có vết tương ứng với nhau, trong đó:

- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 5 vết, Bạch thược có 1 vết, các vết có màu đen.

- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 1 vết tương đương với Bạch thược (màu đen, Rf* = 33).

- Cao chiết nước có 5 vết tương đương với cao chiết ethanol 60 % (màu đen, Rf* = 33, 38, 45, 53, 64)

Bảng 3.07: Kết quả SKLM định tính Bạch thược khi phun thuốc thử vanillin trong acid sulfuric 10 %

Mẫu thử nghiệm Vết Rf

* =

Rf x 100 Màu sắc Cao chiết nước Cao chiết ethanol 60 % Bạch thược 1 33 Hồng tím ++ ++ ++ 2 38 Hồng tím ++ ++ ++ 3 53 Hồng tím - - +++ 4 64 Hồng tím - - +++

Nhận xét: Khi phun thuốc thử vanillin trong acid sulfuric 10 % quan sát được rõ các vết, số lượng vết quan sát được như sau:

- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có nhiều vết, Bạch thược có 4 vết, các vết có màu tím - hồng.

- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 2 vết tương đương với Bạch thược (màu hồng, Rf* = 33, 38).

- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có các vết tương tự nhau.

3.3.3. Định tính Hương Phụ và Xuyên khung

Điều kiện sắc kí

Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel GF254, hoạt hóa ở 1100C trong 60 phút. Pha động: Khảo sát trên 3 hệ dung môi

- Hệ 1: n-Hexan : ethyl acetat (2 : 1) - Hệ 2: Cloroform : methanol (9 : 1)

- Hệ 3: Cloroform : Toluen : Aceton : acid formic (7 : 4 : 5 : 1,5) Thể tích mẫu: 5 µl/mẫu.

Phát hiện: Soi đèn UV ở 254 nm.

Soi đèn UV ở 366 nm.

Hiện hơi amoniac bão hòa.

Dung dịch mẫu thử

MNC: - Cao chiết nước: 6g - Cao chiết ethanol 60 %: 2g MNC cho vào bình nón 100 ml, thêm 20 ml nước cất, đun cách thủy, để

nguội, lọc thu lấy dịch lọc. Chuyển dịch lọc vào bình gạn 100 ml, kiềm hóa bằng dung dịch amoniac đặc đến phản ứng kiềm (pH = 9 - 10), chiết với chloroform (3 lần, mỗi lần dùng 30 ml), gạn lấy lớp chloroform, bốc hơi trên cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 2 ml ethanol được dung dịch chấm sắc kí.

Dung dịch đối chiếu Hương phụ

Lấy khoảng 6 g dược liệu Hương phụ tán nhỏ chovào bình nón 100 ml, thêm 50 ml nước, đun sôi trong 60 phút (bổ sung nước nếu cần thiết), để nguội, lọc thu lấy dịch lọc. Chuyển dịch lọc vào bình gạn 100 ml, kiềm hóa bằng dung dịch amoniac đặc đến phản ứng kiềm (pH = 9 - 10), chiết với chloroform (3 lần, mỗi lần

dùng 30 ml), gạn lấy lớp chloroform, bốc hơi trên cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 2 ml ethanol được dung dịch chấm sắc kí.

Dung dịch đối chiếu Xuyên khung

Lấy khoảng 2 g dược liệu Xuyên khung tán nhỏ cho vào bình nón 100 ml, thêm 50 ml nước, đun sôi trong 60 phút (bổ sung nước nếu cần thiết), để nguội, lọc thu lấy dịch lọc. Chuyển dịch lọc vào bình gạn 100 ml, kiềm hóa bằng dung dịch amoniac đặc đến phản ứng kiềm (pH = 9 - 10), chiết với chloroform (3 lần, mỗi lần dùng 30 ml), gạn lấy lớp chloroform, bốc hơi trên cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 2 ml ethanol được dung dịch chấm sắc kí.

Triển khai sắc ký

Kết quả

Trong các hệ dung môi trên thì hệ dung môi 3 cho kết quả hiện vết và tách vết tốt nhất. Kết quảđược trình bày trong hình 3.03 và bảng 3.08; bảng 3.09.

A B

Hình 3.03: Sắc kí đồ định tính Hương phụ và Xuyên khung

A - 254 nm B - 366 nm

Bảng 3.08: Kết quả SKLM định tính Hương phụ và Xuyên khung

ở bước sóng 254 nm

Mẫu thử nghiệm Vết Rf

* =

Rf x 100 Màu sắc Cao chiết nước Cao chiết ethanol 60 % Hương phụ Xuyên khung 1 44 Đen - - + - 2 46 Đen ++ +++ - +++ 3 50 Đen + +++ ++ - 4 54 Đen + - - - 5 65 Đen + + + - 6 72 Đen + +++ - - 7 78 Đen - - - + 8 81 Đen - + + -

Nhận xét: Dựa vào sắc kí đồ trên nhận thấy ở bước sóng 254 nm quan sát

được rõ các vết:

- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 5 vết, Hương phụ có 4 vết, Xuyên khung có 2 vết, các vết có màu đen.

- Cao chiết nước và cao chiết ethanol 60 % có 2 vết tương đương với Hương phụ (màu đen, Rf* = 50, 65), 1 vết tương đương với Xuyên khung (màu đen, Rf*= 46).

- Cao chiết nước có 4 vết tương đương với cao chiết ethanol 60 % (màu đen, Rf*= 46, 50, 65, 72).

- Ở bước sóng 254 nm có 2 cụm vết có thể phân biệt được đồng thời 2 dược

Xây dựng quy trình định lượng paeoniflorin trong cao Hoạt lạc vương bằng

Giới hạn phát hiện (LOD)