- Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh in vitro:
Lựa chọn chồi mía có từ 2-3 lá chuyển sang môi trường ra rễ. Môi trường ra rễ
dựa trên môi trường MS có bổ sung các nồng độ NAA khác nhau để kích thích tạo rễ bất
định, hình thành cây con hoàn chỉnh.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ bất định của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 tạo cây hoàn chỉnh.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 1 bình, mỗi bình cấy 25 chồi. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Công thức Nồng độ NAA (mg/l) 1 (Đ/C) MT nền + A + 0,0 2 MT nền + A + 0,1 3 MT nền + A + 0,5 4 MT nền + A + 1,5 5 MT nền + A + 2,0
Chỉ tiêu theo dõi sau 2 tuần: Số rễ/cây, chất lượng rễ. Chú ý:
MT nền = MS + 3% đường saccharose + 0, 6% agar, pH = 5,6-5,8.
3.5.4. Phương pháp nghiên cứu nội dung 4
- Sau khi chồi đạt tiêu chuẩn với chiều cao khoảng 3-4cm, có từ 4-5 lá, 3-4 rễ trở lên đưa cây ra ngoài vườn ươm.
- Việc chuyển cây từđiều kiện in vitro ra điều kiện tự nhiên bên ngoài vườn
ươm là giai đoạn rất quan trọng. Trong giai đoạn này, sự thay đổi đột ngột của điều kiện sống, từ môi trường dị dưỡng ra môi trường tự dưỡng hoàn toàn đòi hỏi cây phải có quá trình thích nghi. Sự thành công của giai đoạn này góp phần quan trọng cho sự thành công của phương pháp nhân giống.
- Để phù hợp về độ ẩm trong quá trình cây thích nghi với môi trường sống ngoài tự nhiên là rất cần thiết. Để cho cây lan có quá trình thích nghi tốt cần được luyện cây trước khi đưa cây ra giá thể phù hợp.
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến sinh trưởng và phát triển của cây mía ngoài vườn ươm.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 1 khay, mỗi khay 240 cây. Cây được trồng vào các loại giá thể khác nhau như sau:
Công thức
Giá thể
1 (Đ/C) Đất mùn
2 Đất mùn + cát
3 Đất mùn + cát + trấu hun
4 Đất mùn + trấu hun + ¼ phân vi sinh
5 Đất mùn + cát + trấu hun +1/4 phân vi sinh
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Tỷ lệ cây sống.
3.6. Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá
- Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (mẫu nhiễm):
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm (mẫu)
x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
- Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (mẫu sống): Tỷ lệ mẫu sống (%) = Tổng số mẫu sống (mẫu) x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Tỷ lệ mẫu chết: Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tổng số mẫu chết (mẫu) x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Tỷ lệ tái sinh:
Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = Tổng số mẫu tái sinh (mẫu)
x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Hệ số nhân: Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi (chồi) Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu) Chất lượng chồi bật: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Chồi mập, xanh đậm: Chồi khoẻ, xanh. + Chồi trung bình: Chồi khỏe, xanh nhạt + Chồi kém: Chồi yếu, xanh nhạt. - Số rễ trung bình/cây: Số rễ trung bình/cây (rễ) = Tổng số rễ ra (rễ) Tổng số mẫu cấy (mẫu) Chất lượng rễ: + Rễ tốt : Rễ khoẻ, dài. + Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn + Rễ kém: Rễ nhỏ, ngắn. - Tỷ lệ cây sống: Tỷ lệ cây sống (%) = Tổng số cây sống (cây) X 100% Tổng số cây ban đầu (cây)
Tỷ lệ cây chết:
Tỷ lệ cây chết (%) =
Tổng số cây chết (cây)
X 100% Tổng số cây ban đầu (cây)
Chất lượng cây con (tình trạng, màu sắc)
- Thu thập và xử lý kết quả bằng phần mềm thống kê toán học Microsoft Excel 2003 và phần mềm IRRISTAT 5.0.
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu nuôi cấy chồi đỉnh và chồi nách đến khả năng tái sinh chồi của các giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159 khả năng tái sinh chồi của các giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159
Trong nuôi cấy mô của đa số cây trồng, khi đưa mẫu từ ngoài vào trong ống nghiệm người ta thường phải khử trùng mẫu nuôi cấy. Các chất khử trùng có tác dụng diệt nấm, vi khuẩn, nhưng cũng gây độc cho mô nuôi cấy.
Đỉnh sinh trưởng và các chồi ngủ gần ngọn được lớp lá non bao bọc nên khá sạch, nếu được lấy trong điều kiện thời tiết nắng ráo thì không cần khử trùng cũng có thể nuôi cấy được với tỷ lệ nhiễm khá thấp. Do vậy chúng tôi không tìm chất khử
trùng mà chỉ nghiên cứu khả năng tạo chồi từ đỉnh sinh trưởng và chồi ngủ của ba giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159.
Chồi đỉnh bóc hết lá, chồi nách gạt bỏ lớp vảy, cắt miếng 1cm × 1cm, cấy vào môi trường MS để kích thích bật chồi, theo dõi và cấy chuyển 3 lần trong 3 tuần. Kết quảđược trình bày trên bảng 1:
Bảng 4.1: Khả năng tạo chồi của chồi của ba giống mía Br7515, Br2 và QĐ93- 159 sau 3 tuần nuôi cấy
Công thức Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) Br2 Br7515 QĐ 93-159 Số chồi tạo thành Tỷ lệ tạo chồi (%) Số chồi tạo thành Tỷ lệ tạo chồi (%) Số chồi tạo thành Tỷ lệ tạo chồi (%) CT1 30 34 113 37 123a 35 117 CT2 30 30 100 32 107b 31 103 CV% 3,8 5,0 5,2 LSD 0,5 9,24 13,06 13,06 Hình 4.2. Biểu đồ thể hiện khả năng tạo chồi của chồi của ba giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159 sau 3 tuần nuôi cấy
Đối với giống Br2 với giá trị LSD05đạt 9,24 hai công thức có ý nghĩa ở mức
độ tin cậy 95%. Trong đó CT1 (chồi đỉnh) tỷ lệ tạo chồi đạt 113% cao hơn CT2 (chồi nách) chỉ đạt tỷ lệ 100%.
Giống mía Br7515 với giá trị LSD05 đạt 13,06 hai công thức có ý nghĩa ở
mức độ tin cậy 95%. Trong đó CT1 có tỷ lệ tạo chồi đạt 123% cao hơn so với công thức 2 đạt 107%.
Đối với giống QĐ93-159 với giá trị LSD05 đạt 13,06 hai công thức có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Trong đó CT1 có tỷ lệ tạo chồi đạt 117% cao hơn so với công thức 2 chỉđạt 103%.
Ở cả 3 giống công thức 1 (vật liệu nuôi cấy chồi đỉnh) đều có tỷ lệ tạo chồi cao hơn công thức 2 (vật liệu nuôi cấy chồi nách). Như vậy nên sử dụng chồi đỉnh làm vật liệu nuôi cấy.
ở cả 3 giống tỷ lệ tạo chồi đều lớn hơn 100% nên khả năng đưa 3 giống mía vào nuôi cấy mô là hoàn toàn có thể.
4.2. Ngiên cứu ảnh hưởng của các chất đến quá trính tái sinh và nhân nhanh chồi mía chồi mía
Ngoài tái sinh chồi trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng mía cũng có thể nhân giống bằng phương pháp tái sinh chồi từ mô sẹo. Các biến dị soma có thể tránh được nếu sử dụng nồng độ auxin không quá cao và hạn chế số lần cấy chuyển . Phương pháp này rất có ý nghĩa với các giống có hiện tượng tiết nhiều hợp chất polyphenol làm chết đỉnh sinh trưởng và chồi nách . Ở đây chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và nước dừa lên quá trình tái sinh chồi từ callus. Sau khi tạo thành, các mô sẹo màu trắng, rắn chắc là loại có khả năng tái sinh cao được chọn để tái sinh chồi.
4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với Kinetin(0, 2mg/l MT) lên quá trình tái sinh chồi từ callus của ba giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159
BAP đã được xác định là có vai trò rất lớn trong quá trình tái sinh chồi của mía (Trương Thị Thủy, Vương Đình Tiến, Bùi Bá Hồng, 2002; Hà Thị Thúy, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh, 2002). Tuy nhiên đối với các giống khác nhau, tác động của BAP có sự khác nhau. Davenpoort và cộng sự đã chứng minh Kinetin được thí nghệm trên các loại thực vật khác nhau thì đều cho kết quả chồi tái sinh tốt ở nồng
độ 0, 2 mg/l MT [12]. Do vậy chúng tôi quyết định nghiên cứu thí nghiệm với nồng
độ Kinetin không thay đổi trong suốt quá trình thí nghiệm là 0,2mg/l MT, BAP thay
đổi nồng độ từ 0 - 2,5mg/l MT. Để tìm hiểu xem BAP sẽảnh hưởng như thế nào khi nông độ kinetin cốđịnh và nồng độ BAP bao nhiêu sẽ cho khả năng tạo chồi của ba giống mía là cao nhất chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nồng dộ khác nhau kết hợp với Kinetin(0, 2mg/l MT) lên qua trình tái sinh chồi từ
callus. Kết quảđược thể hiện ở bảng 4.2.
Hình 4.3: Chồi tái sinh từ callus sau 1 tuần cấy chuyển
Bảng 4.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với Kinetin(0, 2mg/l MT) lên quá trình tái sinh chồi từ callus của hai giống mía
Br2 và Br7515 CT Nồng độ BAP (mg/l) Số mẫu cấy Sau 3 tuần
nuôi cấy Br2 nuôi cấy Br7515 Sau 3 tuần Chất lượng
chồi Số chồi
thu được Hệ số nhân
Số chồi
thu được Hệ số nhân
CT1 0 30 105 3,5 123 4,1 - CT2 0,5 30 135 4,5 162 5 4 + CT3 1,0 30 147 4,9 129 6,3 ++ CT4 1,5 30 198 6,6 204 6, 8 + CT5 2,0 30 132 4,4 168 5,6 + CT6 2,5 30 129 4,3 165 5,5 + CV(%) 3,4 3,4 LSD0, 5 0,28 0,34
Bảng 4.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với Kinetin(0, 2mg/l MT) lên quá trình tái sinh chồi từ callus của giống mía QĐ 93-159 MT Nồng độ BAP (mg/l) Số mẫu cấy
Sau 3 tuần nuôi cấy Qđ 93-159 Chất lượng chồi Số chồi thu được Hệ số nhân CT1 0 30 102 3,4 - CT2 0.5 30 135 4,5 + CT3 1.0 30 153 5,1 ++ CT4 1.5 30 195 6,5 + CT5 2.0 30 135 4,5 + CT6 2.5 30 129 4,3 + CV% 4,6 LSD0, 5 0,38 Chú giải:
(- )Chồi gầy, xanh nhạt( +) Chồi gầy, xanh (++) Chồi mập, xanh đậm
Hình 4.4: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với Kinetin(0, 2mg/l MT) lên quá trình tái sinh chồi từ callus của ba giống
Ở giống Br2 với giá trị LSD05 đạt 0,28 các công thức thí nghiệm có sự sai khác nhau có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Trong đó nồng độ BAP 1,5mg/l (CT4) thu được hệ số nhân chồi cao nhất 6,6 chồi/mẫu, chất lượng Chồi mập, xanh đậm. kế tiếp là công thức 3 bổ sung BAP 1mg/l hệ số nhân chồi đạt 4,9 chồi/mẫu. tiếp theo đó là CT2, CT5 và CT6 có hệ số nhân chồi lần lượt là 5,4, 5,6 và 5,3. Hệ số
nhân chồi thấp nhất ở CT1 (ĐC) không bổ sung BAP là 3,5.
Ở giống Br7515 với giá trị LSD05đạt 0,34 các công thức thí nghiệm có sự sai khác nhau có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Trong đó nồng độ BAP 1,5mg/l (CT4) thu được hệ số nhân chồi cao nhất 6,5 chồi/mẫu, chất lượng Chồi mập, xanh đậm. kế tiếp là công thức 3 bổ sung BAP 1mg/l hệ số nhân chồi đạt 5,1chồi/mẫu. tiếp theo đó là CT2, CT5 và CT6 có hệ số nhân chồi lần lượt là 4,5, 4,5 và 4,3. Hệ số
nhân chồi thấp nhất ở CT1 (ĐC) không bổ sung BAP là 4,1.
Ở giống QĐ93-159 với giá trị LSD05đạt 0,38 các công thức thí nghiệm có sự
sai khác nhau có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Trong đó nồng độ BAP 1,5mg/l (CT4) thu được hệ số nhân chồi cao nhất 6,6 chồi/mẫu, chất lượng Chồi mập, xanh
đậm. kế tiếp là công thức 3 bổ sung BAP 1mg/l hệ số nhân chồi đạt 4,9 chồi/mẫu. tiếp theo đó là CT2, CT5 và CT6 có hệ số nhân chồi lần lượt là 4,5, 4,4 và 4,3. Hệ
số nhân chồi thấp nhất ở CT1 (ĐC) không bổ sung BAP là 3,4.
Kết quả được giải thích như sau: BAp là chất kích thích sinh trưởng khi sử
dụng nồng độ thích hợp tuy nhiên nếu sử dụng hàm lượng cao quá dẫn đến ức chế
quá trình sinh trưởng của mẫu – gây độc cho mẫu. Hệ số nhân chồi mía tăng dần từ
0 – 1,5mg/l do ở nồng độ này nó kích thích sự hình thành chồi nách, ngăn chặn sự
già hóa. Tuy nhiên tăng BAP lên 2mg/l hệ số nhân chồi giảm do cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào làm giảm sự hình thành chồi.
Vậy với nồng độ BAP là 1,5 kết hợp với Kinetin 0,2mg/l thì cho hệ số nhân chồi là cao nhất đạt 6,5 với giống QĐ 93-159, 6,6 với giống BR2 và 6, 8 với giống
BR7515, chất lượng Chồi mập, xanh đậm được sủ dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình tái sinh chồi từ callus cau 3 tuần nuôi cấy
4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi từ callus của ba giống mía Br2, Br7515 và QĐ93-159 ba giống mía Br2, Br7515 và QĐ93-159
Công bố đầu tiên về việc sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô được nhà khoa học Van Overbeek và cộng sự của ông tìm ra. Sau đó thì tác dụng tích cực của nước dừa đã được nhiều nhà khoa học khác chứng nhận. Nước dừa là hợp chất tự
nhiên chứa nhiều chất khoáng, vitamin, hợp chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin có tác dụng kích thích hình thành chồi. Đây là thành phần không thể
thiếu trong quá trình tạo chồi và cụm chồi từ callus. Để biết được nồng độ nước dừa thích hợp nhất cho nuôi cấy mô ba giống mía chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình hình thành chồi allus. Kết quả được thể hiện ở
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi từ callus ở 2 giống mía BR2 và BR7515 MT Nồng độ (%) Số mẫu cấy
Sau 3 tuần nuôi cấy Br2
Sau 3 tuần nuôi
cấy Br7515 Chất lượng chồi Số chồi thu được Hệ số nhân Số chồi thu được Hệ số nhân CT1 0 30 46 1, 6 66 2, 2 - CT2 5 30 54 1, 8 84 2, 8 + CT3 10 30 66 2, 2 132 4.4 ++ CT4 15 30 123 4, 1 159 5, 3 + CT5 20 30 81 2, 7 126 4, 2 + CV (%) 5,7 5,5 LSD0, 5 0,25 0,38
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi từ callus ở giống mía QĐ 93-159
MT Nồng độ (%)
Số mẫu cấy
Sau 3 tuần nuôi cấy Qđ 93-159 Chất lượng chồi Số chồi thu được Hệ số nhân CT1 0 30 51 1, 7 - CT2 5 30 57 1, 9 + CT3 10 30 66 2, 2 ++ CT4 15 30 120 4, 0 + CT5 20 30 84 2, 8 + CV (%) 5,6 LSD0, 5 0,25 Chú giải:
Hình 4.6: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi từ
callus của ba giống mía Br2, Br7515 và QĐ93-159
Ở giống Br2 với giá trị LSD05 đạt 0,25 các công thức thí nghiệm có sự sai khác nhau có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Trong đó nồng độ nước dừa 15% (CT4) thu được hệ số nhân chồi cao nhất 4,1 chồi/mẫu, chất lượng Chồi mập, xanh
đậm. Kế tiếp là công thức 5 bổ sung nước dừa 20% hệ số nhân chồi đạt 2,7 chồi/mẫu. Tiếp theo đó là CT3 có hệ số nhân chồi 2,2 chồi/mẫu. Hệ số nhân chồi thấp nhất ở CT1 (ĐC) và CT2 chỉđạt hệ số nhân là 1,6 chồi/mẫu và 1,8 chồi trên mẫu.
Ở giống Br7515 với giá trị LSD05đạt 0,38 các công thức thí nghiệm có sự sai khác nhau có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Trong đó nồng độ nước dừa 15% (CT4) thu được hệ số nhân chồi cao nhất 5,3 chồi/mẫu, chất lượng Chồi mập, xanh
đậm. Kế tiếp là công thức 5 bổ sung nước dừa 20% hệ số nhân chồi đạt 2,7 chồi/mẫu và công thức 3 bổ sung 10% nước dừa đạt hệ số nhân 4,4 chồi/mẫu. Tiếp theo đó là CT2 có hệ số nhân chồi 2,8 chồi/mẫu. Hệ số nhân chồi thấp nhất ở CT1 (ĐC) chỉđạt hệ số nhân là 2,2 chồi/mẫu.