3.2.3.1. Kết quả đại thể gan, tụy chuột nhắt trắng
Bảng 3.26. Nhận xét về hình ảnh đại thể gan chuột nhắt trắng
Lô nghiên cứu Hình ảnh đại thể gan chuột
Lô 1 G n màu đỏ, mặt nhẵn, mật độ mềm, không phù nề, không xung huyết
Lô 2 Gan bạc màu, mật độ nhu mô lỏng lẻo, không phù nề, không xung huyết
Lô 3 G n hơi nhạt màu, mặt nhẵn, mật độ nhu mô lỏng lẻo, không phù nề, không xung huyết
Lô 4 Đ số gan bạc màu, mặt nhẵn, mật độ nhu mô lỏng lẻo, không phù nề, không xung huyết
Lô 5 Đ số gan bạc màu, mặt nhẵn, mật đô nhu mô lỏng lẻo, không phù nề, không xung huyết
3.2.3.2. Kết quả vi thể gan chuột nhắt trắng
Hình 3.11. Hình thái vi thể gan chuột lô chứng (HE x 400).Tế bào gan và các cấu
trúc khác bình thường.
Hình 3.12. Hình thái vi thể gan chuột lô mô hình (HE x 400)Tế bào gan và nhu mô gan nhiễm mỡ nặng, có nhiều hốc sáng. Tế bào
thoái hóa mức độ trung bình.
Hình 3.13. Hình thái vi thể gan chuột lô uống
gliclazid(A) (HE x 400).Tế bào gan và nhu mô
gan có hình ảnh nhiễm mỡ, có các hốc sáng, tế bào gan thoái hóa mức độ nhẹ.
Hình 3.14. Hình thái vi thể gan chuột lô uống
gliclazid (B) (HE x 400).Tế bào gan và nhu mô
gan nhiễm mỡ nặng, có nhiều hốc sáng, tế bào gan thoái hóa mức độ trung bình.
Hình 3.15. Hình thái vi thể gan chuột lô 4 uống
cao lỏng Ngưu b ng liều 20 g dược liệu (A) (HE
x 400). Tế bào gan và nhu mô gan nhiễm mỡ nặng, có nhiều hốc sáng, tế bào gan thoái hóa
mức độ trung bình.
Hình 3.16. Hình thái vi thể gan chuột lô 4 uống
cao lỏng Ngưu b ng liều 20 g dược liệu (B) (HE
x 400). Tế bào gan và nhu mô gan nhiễm mỡ, có các hốc sáng, tế bào gan thoái hóa mức độ nhẹ.
Hình 3.17. Hình thái vi thể gan chuột lô 5 uống
cao lỏng Ngưu b ng liều 40 g dược liệu (A) (HE
x 400). Tế bào gan và nhu mô gan nhiễm mỡ nặng, có nhiều hốc sáng, tế bào gan thoái hóa
mức độ trung bình.
Hình 3.18. Hình thái vi thể gan chuột lô 5 uống cao lỏng Ngưu b ng liều 40 g dược liệu
(B) (chuột số 96) (HE x 400). Tế bào gan và nhu mô gan nhiễm mỡ nhẹ, có ít hốc sáng, tế
bào gan thoái hóa mức độ nhẹ.
Chú thích: (A): sau 10 ngày,(B): sau 20 ngày uống thuốc.
3.2.3.3. Kết quả đại thể tụy
Nhìn bằng mắt thƣờng và k nh lúp thông thƣờng không quan sát thấy th y đổi bệnh lý nào của tụy giữa các lô chuột nhắt.
3.2.3.4. Kết quả vi thể tụy sau 20 ngày uống thuốc.
Hình 3.19. Hình thái vi thể tụy chuột lô chứng
(HE x 400) Tụy bình thường, giàu tế bào, có nhiều đảo tụy.
Hình 3.20. Hình thái vi thể tụy chuột lô mô hình
(HE x 400) Cấu trúc tụy bình thường nhưng không tìm thấy đảo tụy và ít tế bào.
Hình 3.21. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống
gliclazid (HE x 400)
Cấu trúc tụy bình thường, có nhiều đảo tụy.
Hình 3.22. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống cao
lỏng Ngưu b ng liều 20 g dược liệu (HE x 400)
Cấu trúc tụy bình thường, có tìm thấy đảo tụy và tế bào.
Hình 3.23. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống
cao lỏng Ngưu b ng liều 40 g dược liệu (HE x
400)
Cấu trúc tụy bình thường, có nhiều tế bào trong đảo tụy.
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN • Về mặt hóa học
Rễ Ngƣu bàng là một dƣợc liệu đƣợc sử dụng khá phổ biến trên thế giới. Tại Nhật Bản, Ngƣu bàng đƣợc phối hợp cùng nấm đông ô, à rốt, củ cải trắng thành món nh dƣỡng sinh bổ dƣỡng. Tại Trung Quốc, Canada, rễ Ngƣu bàng đƣợc sử dụng điều trị đ i th o đƣờng, Gout,….Tuy nhiên tại Việt Nam, rễ Ngƣu bàng t đƣợc sử dụng và nghiên cứu. Vì vậy, đề tài nghiên cứu đƣợc tiến hành là thực sự cần thiết để góp phần nâng cao giá trị sử dụng củ dƣợc liệu này.
Trên thế giới các nhà khoa họ đã phân lập đƣợc một số thành phần từ rễ Ngƣu bàng: r tigenin, b i lin, genestin, arctiin, acid chlorogenic, di r tigenin. Đề tài đã phân lập đƣợc 2 hợp chất TA05, TA06 đƣợc xác đinh ấu trúc lần lƣợt là: 3-β-stigmasta-4,22,25-trien-3-ol, α- tocopherol quinon.
• Về tác dụng của 2 hợp chất phân lập đƣợc theo các nghiên cứu trƣớc đây.
α- to ơpherol quinon đƣợc biết đến là một dẫn chất của α- tocopherol. Năm 1991, N izli R sool và ộng sự đã phân lập đƣợc α- tocopherol quinon từ dịch chiết chloroform của Prsoralea plicata bằng phƣơng ph p sắc ký cột [78]. Cũng bằng sắc ký cột từ dịch chiết hloroform đề tài đã phân lập đƣợc α- to opherol quinon. Đây là lần đầu tiên phân lập đƣợc α- tocopherol quinon từ rễ Ngƣu bàng. T dụng dƣợc lý của α- tocopherol quinon đã đƣợc chứng minh qua nhiều nghiên cứu. Theo đó, hất có tác dụng chống oxy hóa [52]và ức chế sản xuất các yếu tố gây viêm thông qua giảmTNF-α, IL-1β và tăng IL-4 [52]. Bên cạnh đó theo [62], [86] rễ Ngƣu bàng có tác dụng chống viêm và chống oxy hóa. Nhƣ vậy việc phân lập
định mối quan hệ giữa thành phần hoá học với tác dụng sinh học của rễ Ngƣu bàng.
3-β-stigmasta-4,22,25-trien-3-ol thuộc nhóm phytosterol là hợp chất lần đầu tiên đƣợc phân lập trong rễ Ngƣu bàng. Trƣớ đó vào năm 2004, M ri n H. đã phân lập đƣợc 3-β-stigmasta-4,22,25-trien-3-ol từ dịch chiết ethanol của Porcelia macrocarpa [72]. Về mặt tác dụng dƣợc lý nhiều hợp chất thuộ nhóm phytosterol đã đƣợc chứng minh là có tác dụng hạ đƣờng huyết nhƣ 3-O-[β-D-glucopyranosyl]-stigmasta-5,25(27)-dien đƣợc phân lập từ ây mƣớp đắng (Momordica charantia – họ Bí
(Curcurbitaceae)) [69], stigmasta-7,22-dien-3-ol phân lập từ Phytolacca Americana (họ Phytolaccaceae) [54]và stigmast-4-en-3-ol, stigmast-4-en- 3-one phân lập từ vỏ ây Đào lộn hột (Anacardium occidentale) [26]. Về mặt cấu trúc các tác giả cho rằng có thể sự có mặt nối đôi ở vị trí 4,5 và nhóm chức chứa oxy ở vị trí C3 củ nhân steroid đóng v i trò qu n trọng quyết định tác dụng hạ đƣờng huyết. Mặt khác, theo nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết trên mô hình chuột mắc bệnh tiểu đƣờng do streptozotocin của Jianfeng Cao và cộng sự năm 2012 ho thấy dịch chiết ethanol của rễ ây Ngƣu bàng BRE làm giảm đ ng kể lƣợng đƣờng huyết và tăng insulin [31]. Nhƣ vậy câu hỏi đặt ra là liệu có mối tƣơng qu n nào giữa thành phần 3-β-stigmasta-4,22,25-trien-ol với tác dụng hạ đƣờng huyết của rễ Ngƣu bàng hay không.
Việ phân lập đƣợ 3-β-stigmasta-4,22,25-trien-ol và α- tocopherol quinon là một đóng góp mới ủ khó luận, góp phần nghiên cứu sâu hơn về thành phần hoá học của rễ Ngƣu bàng, nghiên ứu đƣợc phần nào mối quan hệ giữa các thành phần hoá học với các tác dụng sinh họ , định hƣớng giải thích cách sử dụng dƣợc liệu này theo kinh nghiệm dân gian, mở ra hƣớng mới để nghiên cứu sâu hơn về tác dụng sinh học rễ Ngƣu bàng.
• Về tác dụng của cao lỏng Ngƣu bàng trên glucose huyết và các chỉ số sinh hóa khác trên chuột nhắt trắng
Bình thƣờng có thể gây ĐTĐ bằng chế độ ăn giàu chất béo kết hợp tiêm llox n đã gây kh ng insulin, rối loạn chuyển hó đặc biệt là chuyển hóa lipid. Việc cho thêm fructose vào chế độ ăn làm tăng thêm rối loạn chuyển hóa ở gan do fructose chuyển hóa hoàn toàn ở gan và theo nhiều on đƣờng khác nhau. Để cải thiện tình trạng này thƣờng phải dung thuốc kéo dài đặc biệt là thuốc có nguồn gố dƣợc liệu. Do đó trong mô hình trên phải cho chuột uống thuốc trong thời gi n dài hơn nghiên ứu khác.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 10 ngày uống thuốc ở cả 2 mức liều 20g/kg và 40g/kg: nồng độ GH ó xu hƣớng hạ nhƣng hƣ ó sự khác biệt so với lô mô hình (p>0,05). Nhýng sau 20 ngày uống thuốc với cả 2 mức liều 20g/kg và 40g/kg đều cho thấy nồng độ GH giảm rõ rệt so với lô mô hình (lô 2), (p<0,05). Kết quả giải phẫu vi thể tụy ũng ho thấy cấu trúc tụy bình thƣờng có nhiều đảo tụy ở các lô uống dƣợc liệu và lô uống gli l zid. Trong khi đó lô mô hình ó t tế bào tụy. Kết quả trên cho thấy cao lỏng có tác dụng bảo vệ tế bào tụy trƣớ độc tính của alloxan. Tuy nhiên, sau 20 ngày uống thuốc ở cả 2 mức liều đều cho thấy tác dụng hạ đƣờng huyết nhƣng trong thử nghiệm này hƣ thấy đƣợc sự so sánh giữa 2 mức liều.
Kh ng insulin thƣờng đi kèm với béo phì và tình trạng béo phì lại làm tăng nguy ơ mắ ĐTĐ typ 2 và kéo theo nhiều bệnh kh [60]. Nhƣ vậy, tình trạng kháng insulin ở bệnh nhân ĐTĐ typ 2 kèm theo béo phì thƣờng nghiêm trọng hơn ở những bệnh nhân ĐTĐ typ2 không kèm theo béo phì [85]. Các nghiên cứu đã hỉ ra rằng độ nhạy cảm với insulin trong ĐTĐ typ2 đƣợc cải thiện khi bệnh nhân giảm cân [35], có thể do sự tăng ƣờng kích thích insulin vận chuyển glu ose vào trong ơ [41]. Vì vậy
insulin của bệnh nhân ĐTĐ typ 2. Kết quả cho thấy sau 10 ngày uống cao lỏng Ngƣu bàng ở liều 40g/kg cho thấy cân nặng chuột giảm rõ rệt so với lô mô hình (p<0,05). Sau 20 ngày uống thuốc nhận thấy ở cả 2 mức liều 20g/kg và 40g/kg đều có tác dụng giảm cân nặng của chuột so với lô mô hình p<0,05 . Do đó, cao lỏng Ngƣu bàng ó thể giúp cải thiện tốt hơn tình trạng kháng insulin ở bệnh nhân ĐTĐT typ 2 kèm theo béo phì.
Tác dụng hạ GH và làm giảm khối lƣợng ơ thể của chuột thí nghiệm có thể do Sitosterol-β-D-glucopyranosid, một chất ức chế hoạt động củ glu osid se là ơ sở để điều trị tiểu đƣờng và béo phì [74]. Ngoài r γ- glucoside-fructose ester (inulin) có khả năng điều hò lƣợng glucose trong máu. Inulin là một chất thuộc nhóm cabonhydrat có trong rễ Ngƣu bàng có thể hoạt động trên các receptor trên bề mặt tế bào, do đó tăng khả năng dung nạp glucose ở mức cao [87]. Ngoài ra acid chlorogenic (trong rễ Ngƣu bàng ũng đƣợc chứng minh có tác dụng trên đƣờng huyết [56].
Tăng holesterol ở tiểu đảo tụy có thể gây chết tế bào β, làm giảm bài tiết insulin. Ngƣợc lại, giảm cholesterol ở tiểu đảo tụy làm tăng bài tiết insulin [63]. Mà ở bệnh nhân ĐTĐ typ 2 holesterol thƣờng tăng o. Do đó, những thuố điều trị ĐTĐ ó t dụng làm giảm cholesterol trong huyết tƣơng sẽ làm giảm tính kháng insulin và làm tăng bài tiết insulin. Chế độ ăn HFF kết hợp tiêm alloxan làm nồng độ cholesterol toàn phần tăng o rõ rệt.Trong nghiên cứu trên, sau 10 ngày và 20 ngày uống cao lỏng nồng độ cholesterol toàn phần ó xu hƣớng giảm nhƣng hƣ thấy có sự khác biệt so với lô mô hình. Do vậy ở cả 2 mức liều với 2 mốc thời gi n đều không thấy có tác dụng hạ cholesterol toàn phần.
LDL-cholesterol là một trong những nguyên nhân h nh gây xơ vữa động mạch và các biến chứng tim mạ h. Ngƣợc lại, HDL- cholesterol vận chuyển cholesterol từ các tế bào ngoại vi về g n để đào thải ra ngoài bằng đƣờng mật lại có vai trò bảo vệ, nghĩ là lƣợng HDL àng o thì nguy ơ
bị xơ vữ động mạch càng thấp [20]. Chế độ ăn HFF kết hợp alloxan làm tăng ả LDL và HDL- cholesterol trong máu so với chế độ ăn bình thƣờng. Sau khi uống cao lỏng Ngƣu bàng trong thời gian 10 ngày và 20 ngày nồng độ LDL- holesterol trong m u ó xu hƣớng tăng t hơn so với lô mô hình nhƣng sự khác biệt này không ó ý nghĩ thống kê (p>0,05) ở cả 2 mức liều đem thử. Ngƣợc lại ở liều 20g/kg làm tăng nồng độ HDL-cholesterol ở cả 2 thời gian là 10 ngày và 20 ngày uống cao lỏng. Vì vậy cao lỏng Ngƣu bàng có khả năng giảm thiểu nguy ơ vữ xơ động mạch và biến chứng tim mạch ở những bệnh nhân ĐTĐ typ 2 ó kèm theo béo phì.
Triglycerid có thể lắng đọng ở gan gây thoái hóa mỡ, gây kháng insulin, lắng đọng ở tế bào β ủ đảo tụy là nguyên nhân làm giảm khả năng bài tiết insulin [43]. Nhƣ vậy, thuốc có tác dụng làm giảm nồng độ triglycerid sẽ có tác dụng ngăn hặn hoặc giảm các tác dụng trên. Tuy nhiên, cả 2 mức liều đều không có tác dụng này.
Chế độ ăn HFF gây tăng sản sinh và phì đại các mô mỡ. Kết quả cho thấy s u hơn 10 tuần ăn hế độ ăn HFF và 20 ngày uống thuốc trọng lƣợng g n ó xu hƣớng tăng o hơn với lô ăn hế độ ăn thông thƣờng nhƣng vẫn hƣ ó sự khác biệt, riêng ở lô uống gliclazid trọng lƣợng gan tăng rõ rệt so với lô chứng (lô 1), (p<0,05). Kết quả vi thể gan ở các lô cho thấy tế bào g n và nhu mô g n đều nhiễm mỡ nặng đến trung bình, có nhiều hốc sáng. Tế bào thoái hóa ở mứ độ trung bình. Từ kết quả trên cho thấy cao lỏng Ngƣu bàng ó t dụng làm giảm sự tích tụ mỡ tại gan của chuột bị gây béo phì và tăng GH bằng chế độ ăn kết hợp tiêm alloxan.
MDA là một sản phẩm đƣợc tạo ra trong quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào gan. Các chất chống oxy hóa hoạt động càng mạnh thì càng làm giảm quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, làm giảm nồng độ MDA. Trong mô hình gây ĐTĐ băngchế độ ăn HFF và fructose kết hợp tiêm
chất chống oxy hóa củ ơ thể gây tổn thƣơng đến các mô và phá vỡ chức năng ủa tế bào, gây nên các biến chứng củ ĐTĐ nhƣ biến chứng tim mạch [17]. Để đ nh gi khả năng hống oxy hóa của mẫu nghiên cứu tiến hành định lƣợng MDA dị h đồng thể gan. Từ kết quả cho thấy chế độ ăn HFF sau 10 tuần gây ra stress oxy hóa gây tổn hại đến tế bào gan, cao lỏng Ngƣu bàng 40g/kg ó t dụng làm giảm hàm lƣợng MDA sau 10 ngày uống thuốc. Còn với liều 20g/kg phải sau 20 ngày uống thuốc mới có tác dụng chống oxy hóa. Các nghiên cứu gần đây ho thấy thành phần chính của rễ Ngƣu bàng là fl vonoid và id phenoli trong đó id caffeoylquinic (acid chlorogenic và acid dicaffeoylquinic) và quercetin là những hợp chất quan trọng nhất, các hợp chất này đã đƣợc chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa mạnh [40]. Vì vậy, Ngƣu bàng ó t dụng chống oxy hó do đó ó thể làm giảm các biến chứng của bệnh ĐTĐ typ 2.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
1. KẾT LUẬN
Sau gian thực nghiệm, luận văn đã thu đƣợc các kết quả sau: • Về hóa học:
X định đƣợc trong rễ Ngƣu bàng ó hứa: flavonid, coumarin, tanin, acid hữu ơ, đƣờng khử, phytosterol, polysaccharid, chất béo, acid amin; không có alcaloid, anthranoid, carotenoid, glycosid tim, saponin bằng các phản ứng hóa họ thƣờng quy.
Chiết đƣợ 3 phân đoạn: n-hexan, chloroform, ethylacetat. Tiến hành định tính các nhóm chất trong cắn 3 phân đoạn trên bằng các phản ứng hóa họ thƣờng quy và SKLM.
Xác định đƣợc hàm lƣợng cắn phân đoạn n-hexan, chloroform, ethylacetat so với dƣợc liệu khô lần lƣợt là 1,76%, 3,52%, 5,46%.
Từ cắn chloroform đã phân lập và nhận dạng đƣợc 2 chất: α- tocopherol quinon và 3-β-stigmasta-4,22,25-trien-3-ol.
• Về tác dụng sinh học:
Đề tài bƣớ đầu đã thăm dò và thử tác dụng của cao lỏng rễ Ngƣu bàng trên glucose huyết và các chỉ số sinh hóa khác cho kết quả cụ thể sau:
- Cao lỏng rễ Ngƣu bàng liều 20g/kg và 40g/kg uống 20 ngày liên tục có tác dụng hạ glucose máu trên mô hình gây đ i đƣờng typ 2 ở chuột nhắt trắng thông qua chỉ số sinh hóa máu và giải phẫu vi thể tụy.
- Cao lỏng rễ Ngƣu bàng liều 40g/kg sau 10 ngày uống thuốc và liều 20g/kg sau 20 ngày uống thuốc có tác dụng chống oxy hóa thông qua làm giảm nồng độ MDA dị h đồng thể gan chuột nhắt trắng.
- Cao lỏng rễ Ngƣu bàng ó một phần tác dụng điều chỉnh rối loạn