Tiến hành thử tác dụng hạ đƣờng huyết của cao lỏng Ngƣu bàng theo mô hình của Fabiola (2011)[25] và Elshater (2009) [39] với 2 mức liều 20g/kg và 40g/kg tại 2 mốc thời gian sau 10 ngày và sau 20 ngày uống thuốc.
Nơi thực hiện: Bộ môn Dƣợc lý – Trƣờng Đại học Y Hà Nội
Nguyên tắc: chuột đƣợc nuôi béo phì trong một khoảng thời gian nhất định bằng chế độ ăn giàu hất béo và fru tose, s u đó tiêm llox n gây đ i th o đƣờng. Sau khi tiêm alloxan cho chuột uống thuốc thử trong khoảng thời gian nhất định, định lƣợng đƣờng huyết và các chỉ số sinh hóa
Cách tiến hành: Chuột nhắt trắng giống đực khỏe mạnh đƣợc chia làm 10 lô (mỗi lô 10 con):
- Lô 1A,1B: Lô chứng: chế độ NFD + uống nƣớc cất.
- Lô 2A,2B: Lô mô hình: chế độ HFF + tiêm alloxan + uống nƣớc cất .
- Lô 3A,3B: Chế độ HFF + tiêm alloxan + uống gliclazid liều 30 mg/kg.
- Lô 4A,4B: Chế độ HFF + tiêm alloxan + uống thuốc cần thử với liều 1.
- Lô 5A,5B: Chế độ HFF + tiêm alloxan + uống thuốc cần thử với liều 2. Trong đó hế độ HFF là chế độ ăn giàu hất béo và fructose (high fat diet plus fructose) và chế độ NFD là chế độ ăn bình thƣờng (normal fat diet) Và A: lô chuột thử nghiệm trong 10 ngày, B: lô chuột thử nghiệm trong 20 ngày
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng của chế độ n N v của chuột nhắt tính trên 100g thức n. Thành phần Chế độ ăn b nh thƣờng (NFD) (%) Chế độ ăn giàu chất b o (HFD)* (%) Protein 28,05 18,23 Chất béo no 12,14 42,89 Carbonhydrat 59,81 38,88 Tổng 100,00 100,00
*Sirô fructose 55% (Daesang Corporation) được trộn thêm trong thức ăn của chuột nhắt c chế độ ăn D.
Tất cả chuột ở 10 lô đƣợ định lƣợng glucose máu lần 1 khi bắt đầu tham gia nghiên cứu (nhịn đói qu đêm . Chuột trong các lô từ 2-5 ăn hế độ HFF, lô 1 ăn hế độ NFD trong 10 tuần liên tục, sau 10 tuần tất cả chuột đƣợ định lƣợng glucose máu lần 2. Tiêm alloxan liều 200mg/kg cho các lô chuột 2-5, lô 1 đƣợ tiêm nƣớc muối sinh lý. 72 giờ sau khi tiêm alloxan và nƣớc muối sinh lý, định lƣợng glucose máu lần 3, chọn các chuột ở các lô tiêm alloxan bị đ i th o đƣờng (có mứ glu ose khi đói trên 10mmol/l
đƣợc tham gia nghiên cứu. Các lô chuột đƣợc uống nƣớc cất hoặc thuốc cần thử tác dụng sau 1 thời gian nhất định sau khi gây mô hình. Ngày cuối cùng 10 ngày đối với lô A, 20 ngày đối với lô B) sau khi uống thuốc 1 giờ trƣớ đó huột đã đƣợc nhịn đói qu đêm định lƣợng glucose máu lần 4 và các chỉ số lipid m u, đồng thời lấy g n định lƣợng MDA trong dịch đồng thể gan và làm giải phẫu vi thể và lấy tụy để làm giải phẫu vi thể. Phương pháp xác định MDA dịch đồng thể gan:
Nguyên lý của phương pháp: MDA phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức trimethine có màu hồng và ó đỉnh hấp thụ cự đại ở bƣớc sóng 530-532nm.
Mật độ quang OD (XE) của dung dị h đo tỷ lệ thuận với nồng độ MDA. Hàm lƣợng MDA đƣợc tính theo hệ số chuyển đổi trên đƣờng cong chuẩn sử dụng MDA tinh khiết từ 2 nmol đến 40 nmol. Độ dố đƣờng cong chuẩn là 28,2.
Tiến hành: cân 0,25g gan chuột nhắt trắng nghiền với 6 ml KCl. Bƣớc 1: 1ml dung dịch nghiền từ phủ tạng thêm vào 0,25 ml acid ascorbic và 0,25 ml muối Mohr.
Bƣớc 2: Ủ 370
C trong 30 phút lấy ra cho thêm vào 0,5 ml dung dịch acid tricloacetic vào các ống, ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút.
Bƣớc 3: Lấy 1ml dịch nổi thêm vào 0,5 ml acid thiobarbituric.
Bƣớ 4: Đun sôi h thuỷ 20 phút s u đó để lạnh ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu hồng.
Bƣớ 5: Đo qu ng ở bƣớc sóng 532nm. Mô bệnh học:
Sau 10, 20 ngày uống thuốc, chuột ở lô đƣợc mổ để qu n s t đại thể toàn bộ ơ qu n. Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, tụy của 30% số chuột ở mỗi lô. Các xét nghiệm vi thể đƣợc thực hiện tại Trung tâm
nghiên cứu và phát hiện sớm Ung thƣ, do PGS.TS. Lê Đình Ro nh đọc và nhận định kết quả.
Đánh giá ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu b ng lên gan v tụy chuột sau khi uống thuốc:
Khi chuột đƣợc lấy máu xét nghiệm lần cuối, tiến hành mổ chuột lấy gan và tụy. X định trọng lƣợng g n và hàm lƣợng MDA. Quan sát mô bệnh học gan và tụy đại thể, vi thể) của 30% số chuột mỗi lô.