- Cắn hloroform 10,36 g đƣợc phân lập trên cột silicagel, rửa giải với hệ dung môi n – hexan- eton 20:1 . C phân đoạn đƣợc kiểm tra bằng SKLM, thu đƣợ 4 phân đoạn C1 (1,15 g), C2 (3,21 g) , C3 (1,09 g), C4 (0,23g).
- Phân đoạn C2 (3,21g) tiếp tụ đƣợc phân lập trên cột silicagel, rửa giải với hệ dung môi n-hexan: aceton (6:1). C phân đoạn đƣợc kiểm tra bằng SKLM, thu đƣợ 3 phân đoạn C21 (2,03 g), C22 (0,12 g), C23 (0,87 g).
- Phân đoạn C21 2,03 g đƣợc phân lập trên cột silicagel, rửa giải với dung môi Chloroform thu đƣợ 2 phân đoạn C211 (1,03 g), C212 (0,63 g).
- Phân đoạn C211 tiếp tụ đƣợc phân lập trên cột silicagel, rửa giải với hệ dung môi n – hexan: aceton (15:1) (thể t h phân đoạn hứng: 10ml)
thu đƣợc 2 phân đoạn C2111 (320,4 mg), C2112 (128,4 mg). Các phân đoạn đƣợc kiểm tra bằng SKLM.
- Phân đoạn C2111 320,4 mg đƣợc phân lập trên cột silicagel, rửa giải với hệ dung môi n-hexan - aceton (9:1) thu đƣợ 30 phân đoạn. Kiểm tra bằng SKLM dồn các ống có thành phần giống nh u. Thu đƣợc hợp chất TA06 (32,7 mg) .
- Phân đoạn C212 tiếp tụ đƣợc phân lập trên cột silicagel, rửa giải với hệ dung môi n-hexan - aceton (15:1) thu đƣợ 2 phân đoạn C2121 75,53 mg , C2122 175,6 mg . C phân đoạn đƣợc kiểm tra bằng SKLM.
- Phân đoạn C2122 175,6 mg đƣợc phân lập trên cột silicagel, rửa giải với hệ dung môi n-hexan: aceton (9:1). Kết quả thu đƣợ 5 phân đoạn, s u khi ho b y hơi tự nhiên ó 1 phân đoạn có kết tinh trong ống nghiệm kí hiệu là TA05 (46,3 mg).
Thể tích phân đoạn hứng bằng 1/5 lƣợng silicagel nhồi cột.
Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn hloroform đƣợc thể hiện ở hình 3.5.
Hình 3.5: Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn chloroform chiết xuất từ rễ Ngưu bàng C2 C21 C211 C212 C2111 C2122 TA06 TA05 CC, Silicagel, n-hexan - aceton (20:1) CC, Silicagel, n-hexan - aceton (6:1) CC, Silicagel 100% Chloroform CC, Silicagel n-hexan - aceton (15:1) CC, Silicagel n-hexan-aceton (10:1) CC, Silicagel n-hexan - aceton (15:1) CC, Silicagel n-hexan - aceton (9:1) C
3.1.5.3. Kiểm tra độ tinh khiết và nhận dạng các chất phân lập đƣợc *Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất TA05
TA05 đƣợc kiểm tr độ tinh khiết bằng SKLM triển khai với 3 hệ dung môi:
Hệ I: n – hexan - ethyl acetate (8:1) Hệ II: n – hexan - aceton (8:2)
Hệ III: Chloroform - methanol (19:1,5)
Qu n s t dƣới AST sau khi phun thuốc thử valinin trong H2SO4 10% thấy xuất hiện 1 vết. Sơ bộ kết luận TA05 tƣơng đối tinh khiết (hình 3.6 và bảng 3.6).
Ngoài ra còn tiến hành sắc ký so sánh TA05 với cắn chloroform trên cùng một bản mỏng, hệ dung môi khai triển (Hệ IV): chloroform – aceton (9:1). Kết quả thể hiện ở hình 3.6.
Hệ I Hệ II Hệ III Hệ IV
Hình 3.6. Sắc ký đồ của TA05 ở AST sau khi phun TT
Bảng 3.6: Kết quả SKLM của TA05 với 3 hệ dung môi ở AST sau khi phun TT
Hệ dung môi I II III
Rf ×100 18,87 32,14 49,12
*Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất TA06
TA06 đƣợc kiểm tr độ tinh khiết bằng SKLM triển khai với 3 hệ dung môi:
Hệ I: Chloroform - methanol (19:2) Hệ II: n-hexan – aceton (8:2) Hệ III: Toluen – ethyl acetat (7: 3)
Qu n s t dƣới AST sau khi phun thuốc thử valinin/ H2SO4 10% thấy xuất hiện 1 vết. Sơ bộ kết luận TA06 tƣơng đối tinh khiết (hình 3.7 và bảng 3.7).
Ngoài ra còn tiến hành sắc ký so sánh TA06 với cắn chloroform trên cùng một bản mỏng với hệ dung môi khai triển(Hệ IV): Toluene – Ethylacetat (7:2). Kết quả thể hiện ở hình 3.7.
Hệ I Hệ II Hệ III Hệ IV
Hình 3.7. Sắc ký đồ của TA06 ở AST sau khi phun TT
Bảng 3.7: Kết quả SKLM của TA06 với 3 hệ dung môi ở AST sau khi phun TT (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hệ dung môi I II III
Rf ×100 24,56 35,71 80,00
*Nhận dạng hợp chất TA05
- Tính chất: TA05 là dạng tinh thể hình kim, màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 170οC. T n trong hloroform, meth nol. Khó t n trong nƣớc.
Hình 3.8. Ảnh chụp tinh th 5 dưới vật kính 4
Phổ khối lƣợng, ESI-MS m/z = 411[M+H]+. Công thức phân tử là C29H46O. M = 410 đvC.
Phổ 1H-NMR cho thấy sự có mặt của 3 nhóm methyl bậ b δ 0,69 s, H -18 , δ 1,02 s, H-19 , δ 1,49 m, H-26), hai nhóm methyl bậ h i δ 0,91 (m, H-21 , δ 0,83 (t, 7,5, H-29). Trên phổ có sự xuất hiện tín hiệu hydroxymethine củ nhóm β-OH tại H-3 δ 3,52 m, 1H và 3 ặp nối đôi tại H-5/H-6 δ 5,35 1H, br d, 4,5, H-6), H-22/H-23 δ 5,25 1H, m, H-22)/ 5,17 (1H, m, H-23), H-25/H-27 δ 4,70 2H, d, H-27).
Trên phổ carbon 13C-NMR và DEPT thấy xuất hiện 29 tín hiệu carbon đặ trƣng ho một hợp chất steroid với 5 tín hiệu của nhóm methyl, 10 tín hiệu carbon methin, 9 tín hiệu carbon methylene và 6 tín hiệu carbon bậc 4. Các tín hiệu của 5 nhóm methyl xuất hiện tại các vị trí cộng hƣởng δC 12,08 (C-18), 19,41 (C-19), 21,10 (C-21), 12,13 (C-29) và 20,23 (C-26). Sự chuyển dịch về ph vùng trƣờng thấp của tín hiệu methyl δC 20,23 gợi ý liên hợp với một liên kết đôi. T n hiệu của 3 nối đôi đặ trƣng tại các vị trí cộng hƣởng δC
27)/25,75 (C-28). Bên cạnh đó òn xuất hiện tín hiệu của nhóm hydroxymethine tại vị trí cộng hƣởng 71,84 (C-3).
So sánh dữ liệu phổ của hợp chất TA05 với hợp chất 3β-stigmasta-4, 22, 25-trien-3-ol [72] thấy hoàn toàn phù hợp tại các vị tr tƣơng ứng.
Bảng 3.8: Dữ liệu phổ NMR của TA05
C #C [72] C a,b H a,c 1 37,2 37,26 2 31,6 31,71 3 71,8 71,84 3,52 (1H, m) 4 42,3 42,34 5 140,7 140,80 - 6 121,7 121,70 5,35 (1H, br d, 4.5) 7 31,9 31,92 8 31,9 31,94 9 50,1 50,21 10 36,5 36,55 - 11 21,1 21,10 12 39,6 39,72 13 42,3 42,29 - 14 56,8 56,88 15 24,3 24,34 16 28,7 28,70 17 55,8 56,94 18 12,1 12,08 0,69 (3H, s) 19 19,4 19,41 1,02 (3H, s) 20 40,2 40,17 21 21,8 21,10 0,91 (3H, m)
22 137,2 137,20 5,25 (1H, m) 23 130,0 130,08 5,17 (1H, m) 24 52,0 52,02 25 148,6 148,62 - 26 20,2 20,23 1,49 (3H, m) 27 109,5 109,54 4,70 (2H, d, 5.5) 28 25,7 25,75 29 12,1 12,31 0,83 (3H, t, 7.5)
C của 3β-stigmasta-4, 22, 25-trien-3-ol đo trong CDCl3 [72],
a Đo trong CDCl3, b125 MHz, c500 MHz
Vậy TA05 là 3β-stigmasta-4, 22, 25-trien-3-ol.
Hình 3.9. Cấu trúc hóa học của hợp chất TA05
*Nhận dạng hợp chất TA06
- Tính chất: TA06 là dạng dầu màu vàng. Tan trong ethanol, methanol nóng, chloroform.
Phổ khối lƣợng, ESI-MS m/z = 447[M+H]+. Công thức phân tử là C29H50O3. M = 446 đvC.
Phổ 1H-NMR của TA06 chỉ ra các tín hiệu đặ trƣng ủa tetra-alkyl benzoquinones. Trên phổ có xuất hiện 3 tín hiệu đơn ủa 3 nhóm methyl trên vòng quinone tại δ 2,03 s, 6H, Me-2 và Me-5) và 2,06 (s, 3H, Me-3) chứng tỏ vòng quinone bị thay thế hết proton. Tín hiệu của nhóm methyl
đ nh với carbon gắn nhóm hydroxyl xuất hiện tại δ 1,23 s, H – Me-3‟ và 4 nhóm methyl tại δ 0,88 m, 6H, Me-15‟ , 0,89 m, 3H, Me-11‟ , 0,86 m, Me-7‟ .
Trên phổ 13C-NMR và DEPT thấy xuất hiện 29 tín hiệu carbon với 8 tín hiệu của các nhóm methyl, 3 tín hiệu carbon methin, 11 tín hiệu carbon methilen và 7 tín hiệu carbon bậc bốn. Trong đó, t n hiệu đặ trƣng ủa vòng quinone xuất hiện tại các vị trí cộng hƣởng δC 187,69 (C-1); 140,46 (C-2); 140,20 (C-3); 187,24 (C-4); 140,56 (C-5); 144,45 (C-6) và 3 nhóm methyl thế trên vòng quinone tại các vị trí cộng hƣởng δC 12,28 (Me-2); 12,36 (Me-3); 11,96 (Me-5). Ngoài ra còn có các tín hiệu của nhóm methyl đ nh với carbon bậc bốn có gắn nhóm hydroxyl xuất hiện tại δ 26,60 Me- 3‟ và 4 nhóm methyl tại δ 22,63 và 22,72 (2×Me-15‟ ; 19,76 Me-11‟ ; 19,71 (Me-7‟ . C t n hiệu của nhóm carbon methilen xuất hiện trong khoảng tín hiệu cộng hƣởng 21,34 – 42,32.
Bảng 3.9: Dữ liệu phổ NMR của TA06
C #C [78] C a,b Ha,c 1 187,7 187,69 - 2 140,5 140,46 - 3 140,5 140,20 - 4 187,0 187,24 - 5 140,6 140,56 - 6 144,5 144,45 - Me-2 12,3 12,28 2,03 (3H, s) Me-3 12,4 12,36 2,06 (3H, s) Me-5 12,0 11,96 2,03 (3H, s) 1‟ 21,4 21,43 2,56 (2H, m) 2‟ 40,3 40,29 1,05-1,61 3‟ 70,7 72,69 - 4‟ 42,3 42,33 1,05-1,61 5‟ 21,2 21,34 1,05-1,61
7‟ 32,7 32,83 1,05-1,61 8‟ 29,7 29,71 1,05-1,61 9‟ 24,5 24,51 1,05-1,61 10‟ 37,5 37,46 1,05-1,61 11‟ 32,7 32,79 1,05-1,61 12‟ 37,3 37,32 1,05-1,61 13‟ 24,8 24,80 1,05-1,61 14‟ 39,4 39,40 1,05-1,61 15‟ 28,0 27,99 1,05-1,61 Me-15‟ 22,6 22,63 0,88 (3H, m) Me-15‟ 22,7 22,72 0,88 (3H, m) Me-11‟ 19,8 19,76 0,89 (3H, m) Me-7‟ 19,7 19,71 0,86 (3H, m) Me-3‟ 27,8 26,60 1,23 (3H, s)
C của α - tocopherolquinone đo trong CDCl3 [78],
a Đo trong CDCl3, b125 MHz, c500 MHz.
Hợp chất TA06 đƣợ x định là α – tocopherolquinone (2,3,5- trimethyl-6- 3‟-O-methyl)-phytyl-1, 4-benzoquinone) nhờ việc so sánh với số liệu phổ của hợp chất α - tocopherolquinone [78]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2. NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT CỦA CAO LỎNG RỄ NGƢU BÀNG LỎNG RỄ NGƢU BÀNG
3.2.1 Kết quả nghiên cứu sau 10 ngày uống thuốc
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của chế độ n v cao lỏng Ngưu b ng lên cân nặng chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc
Cân nặng chuột (gam)
STT lô chuột Trƣớc nghiên cứu Sau 10 tuần ăn chế độ HFF/NFD Sau 10 ngày uống thuốc Lô 1 19,10 ± 0,99 31,80 ± 1,48 34,80 ± 2,20 Lô 2 19,10 ± 1,20 36,35 ± 3,30 *** 38,20 ± 2,97 ** Lô 3 19,20 ± 1,14 36,25 ± 3,60 ** 36,50 ± 2,64 Lô 4 19,20 ±0,79 36,00 ± 1,89 *** 37,20 ± 1,55 * Lô 5 19,33 ±1,22 36,33 ± 1,87 *** 35,44 ± 2,51 Δ
*/Δ: p< , 5 ; **/ ΔΔ: p< , 1; ***/ ΔΔΔ: p< , 1, * là giá trị p so với lô 1, Δ là p so với lô 2
Kết quả bảng 3.10 cho thấy cân nặng chuột ở tất cả các lô so với lô 1 tại thời điểm trƣớc nghiên cứu không có gì khác biệt (p>0,05). Sau 10 tuần ăn chế độ nhiều năng lƣợng và fructose, cân nặng chuột tăng nh nh hơn so với lô 1 chuột ăn hế độ bình thƣờng (p<0,01 hoặc p< 0,001). Lô 3 (uống gliclazid) và lô 4 (uống cao lỏng Ngƣu bàng liều 20 g/kg thể trọng), cân nặng chuột hƣ ó sự th y đổi rõ rệt so với lô mô hình (lô 2) (p > 0,05). Ở lô 5 (uống cao lỏng Ngƣu bàng liều 40 g /kg thể trọng), cân nặng giảm hơn rõ rệt so với lô mô hình (lô 2) (p < 0,05).
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu b ng lên nồng độ glucose máu chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc
STT lô chuột
N ng độ glucose máu mmol L
Trƣớc nghiên cứu
Sau 10 tuần ăn chế độ HFF/NFD
Sau 72 giờ tiêm nƣớc muối sinh lý/alloxan Sau 10 ngày uống thuốc Lô 1 3,04 ±0,85 3,24 ±1,05 3,35 ±0,92 3,34 ±1,00 Lô 2 3,21 ±0,67 9,08 ±0,64 *** 17,69 ±3,81 *** 16,91 ±3,64 Lô 3 3,18 ±0,92 9,08 ±0,69 *** 17,21 ±3,42 *** 12,91 ±2,44 Δ Lô 4 3,28 ±0,69 9,38 ±0,81 *** 17,94 ±2,78 *** 16,64 ±1,72 Lô 5 3,24 ±0,75 9,11 ±0,84 *** 17,97 ±3,51 *** 15,28 ±2,63
*/Δ: p< , 5;**/ ΔΔ: p< , 1 ; ***/ ΔΔΔ: p< , 1; * là giá trị p so với lô 1, Δ là p so với lô 2
Kết quả bảng 3.11 cho thấy nồng độ glucose máu ở các lô chuột ăn hế độ nhiều năng lƣợng và fructose trong 10 tuần tăng lên rõ rệt so với thời điểm trƣớc nghiên cứu và so với lô 1 ăn hế độ bình thƣờng, p<0,001). Sau khi tiêm alloxan liều 200mg/kg, nồng độ glu ose m u tăng lên rất cao. Tại thời điểm sau 10 ngày uống thuốc, các chuột ở lô 3 (uống gliclazid) có nồng độ glucose máu thấp hơn rõ rệt so với lô mô hình (p < 0,05). Lô 4 (uống cao lỏng Ngƣu bàng liều 20 g/kg) và lô 5 (uống cao lỏng Ngƣu bàng liều 40 g/kg), nồng độ glu ose m u ó xu hƣớng giảm nhƣng hƣ ó sự khác biệt ó ý nghĩ so với lô mô hình (lô 2), (p>0,05).
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu b ng lên nồng độ cholesterol toàn phần trên chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc
STT lô chuột N ng độ cholesterol toàn phần (mg/dl) So với lô 1 So với lô 2
Lô 1 3,06 ± 0,45
Lô 2 5,33 ± 1,00 p<0,001
Lô 3 5,13 ± 1,13 p<0,001 p>0,05
Lô 4 5,18 ± 0,97 p<0,001 p>0,05
Kết quả bảng 3.12 cho thấy: Sau 10 tuần ăn hế độ nhiều năng lƣợng và fructose, nồng độ cholesterol toàn phần tăng o hơn rõ rệt so với lô 1 (chuột ăn hế độ bình thƣờng, p<0,001). Ở lô 5 (HFF + uống cao lỏng Ngƣu bàng liều 40 g/kg thể trọng), nồng độ cholesterol toàn phần có xu hƣớng tăng t hơn so với lô mô hình (lô 2 nhƣng hƣ ó sự khác biệt (p >0,05).
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu b ng lên nồng độ triglycerid trên chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc
STT lô chuột N ng độ triglycerid (mg/dl) So với lô 1 So với lô 2
Lô 1 0,59 ± 0,10
Lô 2 1,04 ± 0,34 p<0,001
Lô 3 0,92 ±0,12 p<0,001 p>0,05
Lô 4 1,01 ±0,22 p<0,001 p>0,05
Lô 5 0,99 ± 0,21 p<0,001 p>0,05
Kết quả bảng 3.13 cho thấy: Sau 10 tuần ăn hế độ nhiều năng lƣợng và fructose, nồng độ trigly erid tăng o hơn rõ rệt so với lô 1 (chuột ăn chế độ bình thƣờng, p<0,001). Ở lô 4 và lô 5 nồng độ triglycerid có xu hƣớng tăng t hơn so với lô 2 mô h nh nhƣng vẫn chƣ ó sự khác biệt (p>0,05). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu b ng lên nồng độ LDL- cholesterol trên chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc
STT lô chuột N ng độ LDL - cholesterol (mg/dl) So với lô 1 So với lô 2
Lô 1 1,78 ± 0,57
Lô 2 3,77 ± 1,19 p<0,001
Lô 3 3,46 ± 1,15 p<0,001 p>0,05
Lô 4 2,92 ± 0,77 p<0,05 p>0,05
Lô 5 2,94 ± 1,10 p<0,05 p>0,05
Kết quả bảng 3.14 cho thấy: Sau 10 tuần ăn hế độ nhiều năng lƣợng và fructose, nồng độ LDL - holesterol tăng o hơn rõ rệt so với lô 1 (chuột ăn
holesterol ó xu hƣớng tăng t hơn so với lô 2 (mô hình nhƣng ũng vẫn chƣ có sự khác biệt (p>0,05).
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu b ng lên nồng độ HDL - cholesterol trên chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc
STT lô chuột N ng độ HDL- cholesterol (mg/dl) So với lô 1 So với lô 2
Lô 1 1,17 ± 0,23
Lô 2 1,35 ±0,40
Lô 3 1,49 ± 0,43 p<0,05 p>0,05
Lô 4 1,95 ± 0,74 p<0,05 p<0,05
Lô 5 1,74 ± 0,40 p<0,05 p>0,05
Kết quả bảng 3.15 cho thấy: Sau 10 tuần ăn hế độ nhiều năng lƣợng và fructose, nồng độ HDL - holesterol tăng o hơn so với lô 1 (chuột ăn hế độ bình thƣờng). Ở lô 3, lô 4 và lô 5 nồng độ HDL - cholesterol có xu hƣớng tăng o hơn so với lô 2 mô hình nhƣng sự khác biệt chỉ có ý nghĩ thống kê với lô 4 uống cao lỏng Ngƣu bàng liều 20g dƣợc liệu (p <0,05).
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu b ng lên chỉ số khối lượng gan tương đối trên chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc.
STT lô chuột Khối lƣợng gan tƣơng đối
(khối lƣợng gan/10 gam thể trọng) So với lô 1 So với lô 2
Lô 1 0,35 ± 0,08
Lô 2 0,44 ± 0,13
Lô 3 0,46 ± 0,04 p<0,05 p>0,05
Lô 4 0,44 ± 0,08 p>0,05
Lô 5 0,43 ± 0,15 p>0,05
Kết quả bảng 3.16 cho thấy: Khối lƣợng g n tƣơng đối ó xu hƣớng tăng o ở lô ăn hế độ nhiều năng lƣợng và fructose so với lô 1 ăn hế độ bình thƣờng)
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu b ng lên h m lượng MDA dịch đồng thể gan chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc.
STT lô chuột Hàm lƣợng MDA (nmol/100gam gan) So với lô 1 So với lô 2
Lô 1 10,26 ± 1,47
Lô 2 15,42 ± 2,16 p<0,001 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lô 3 13,38 ± 4,59 p>0,05
Lô 4 13,34 ± 2,46 p<0,05 p>0,05
Lô 5 11,78 ± 4,83 p<0,05
Kết quả bảng 3.17 cho thấy: hàm lƣợng MDA dị h đồng thể gan ở lô 2 mô hình tăng lên rõ rệt so với lô 1 p<0,001 . Hàm lƣợng MDA dị h đồng thể g n ó xu hƣớng tăng o ở lô ăn hế độ nhiều năng