- h tác dụng hạ glucose huyết : chuột nhắt trắng chủng Swiss, khoẻ mạnh, giống đực trọng lƣợng trung bình 20 ± 2g, hăn nuôi trong điều kiện đạt tiêu huẩn thí nghiệm đƣợ đặt hàng tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng.
2.2.3. Phƣơng tiện và máy móc
- Cột sắ ký.
- Chất hấp phụ: sili gel k h thƣớc hạt: 0,040 – 0,063 mm) (Merck) - Bản mỏng Silicagel GF254 (Merck)
- Cân kỹ thuật Sartorius - Cân phân tích Precisa - Đèn tử ngoại
- M y x định độ ẩm Sartorius - Kính hiển vi Leica CME - M y đo qu ng ELISA
- Máy ảnh LUMIX DMC TZ7
- Máy cất quay chân không Buchi Rotavapor R-200
- M y đo phổ khối lƣợng (ESI-MS): AGILENT 6310 LC-MSD Trap, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- M y đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- M y đo điểm nóng chảy: Kofler micro-hotstage, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Nghiên cứu về hóa học 2.3.1. Nghiên cứu về hóa học
- Định tính thành phần hóa học: Định tính các nhóm chất trong mẫu nghiên cứu bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng theo các tài liệu sau:
+ Bài giảng Dƣợc liệu I [3].
+ Thực tập Dƣợc liệu - Phần hóa học [4].
+ Phƣơng ph p nghiên ứu hóa học cây thuốc [13]. - Chiết xuất và phân lập
+ Chiết xuất bằng phƣơng ph p chiết nóng với dụng cụ chiết liên tục (Soxhlet) sử dụng dung môi: n-hexan, chloroform, ethyl acetat
+ Sử dụng phƣơng ph p sắc ký cột (CC) với chất hấp phụ là silicagel + Kiểm tr độ tinh khiết của các chất phân lập bằng SKLM với một số hệ dung môi khai triển.
- Nhận dạng chất tinh khiết: Nhận dạng chất phân lập đƣợc dựa trên dữ liệu phổ MS, NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT).
2.3.2. Nghiên cứu tác dụng trên đƣờng huyết
Tiến hành thử tác dụng hạ đƣờng huyết của cao lỏng Ngƣu bàng theo mô hình của Fabiola (2011)[25] và Elshater (2009) [39] với 2 mức liều 20g/kg và 40g/kg tại 2 mốc thời gian sau 10 ngày và sau 20 ngày uống thuốc.
Nơi thực hiện: Bộ môn Dƣợc lý – Trƣờng Đại học Y Hà Nội
Nguyên tắc: chuột đƣợc nuôi béo phì trong một khoảng thời gian nhất định bằng chế độ ăn giàu hất béo và fru tose, s u đó tiêm llox n gây đ i th o đƣờng. Sau khi tiêm alloxan cho chuột uống thuốc thử trong khoảng thời gian nhất định, định lƣợng đƣờng huyết và các chỉ số sinh hóa
Cách tiến hành: Chuột nhắt trắng giống đực khỏe mạnh đƣợc chia làm 10 lô (mỗi lô 10 con):
- Lô 1A,1B: Lô chứng: chế độ NFD + uống nƣớc cất.
- Lô 2A,2B: Lô mô hình: chế độ HFF + tiêm alloxan + uống nƣớc cất .
- Lô 3A,3B: Chế độ HFF + tiêm alloxan + uống gliclazid liều 30 mg/kg.
- Lô 4A,4B: Chế độ HFF + tiêm alloxan + uống thuốc cần thử với liều 1.
- Lô 5A,5B: Chế độ HFF + tiêm alloxan + uống thuốc cần thử với liều 2. Trong đó hế độ HFF là chế độ ăn giàu hất béo và fructose (high fat diet plus fructose) và chế độ NFD là chế độ ăn bình thƣờng (normal fat diet) Và A: lô chuột thử nghiệm trong 10 ngày, B: lô chuột thử nghiệm trong 20 ngày
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng của chế độ n N v của chuột nhắt tính trên 100g thức n. Thành phần Chế độ ăn b nh thƣờng (NFD) (%) Chế độ ăn giàu chất b o (HFD)* (%) Protein 28,05 18,23 Chất béo no 12,14 42,89 Carbonhydrat 59,81 38,88 Tổng 100,00 100,00
*Sirô fructose 55% (Daesang Corporation) được trộn thêm trong thức ăn của chuột nhắt c chế độ ăn D.
Tất cả chuột ở 10 lô đƣợ định lƣợng glucose máu lần 1 khi bắt đầu tham gia nghiên cứu (nhịn đói qu đêm . Chuột trong các lô từ 2-5 ăn hế độ HFF, lô 1 ăn hế độ NFD trong 10 tuần liên tục, sau 10 tuần tất cả chuột đƣợ định lƣợng glucose máu lần 2. Tiêm alloxan liều 200mg/kg cho các lô chuột 2-5, lô 1 đƣợ tiêm nƣớc muối sinh lý. 72 giờ sau khi tiêm alloxan và nƣớc muối sinh lý, định lƣợng glucose máu lần 3, chọn các chuột ở các lô tiêm alloxan bị đ i th o đƣờng (có mứ glu ose khi đói trên 10mmol/l
đƣợc tham gia nghiên cứu. Các lô chuột đƣợc uống nƣớc cất hoặc thuốc cần thử tác dụng sau 1 thời gian nhất định sau khi gây mô hình. Ngày cuối cùng 10 ngày đối với lô A, 20 ngày đối với lô B) sau khi uống thuốc 1 giờ trƣớ đó huột đã đƣợc nhịn đói qu đêm định lƣợng glucose máu lần 4 và các chỉ số lipid m u, đồng thời lấy g n định lƣợng MDA trong dịch đồng thể gan và làm giải phẫu vi thể và lấy tụy để làm giải phẫu vi thể. Phương pháp xác định MDA dịch đồng thể gan:
Nguyên lý của phương pháp: MDA phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức trimethine có màu hồng và ó đỉnh hấp thụ cự đại ở bƣớc sóng 530-532nm.
Mật độ quang OD (XE) của dung dị h đo tỷ lệ thuận với nồng độ MDA. Hàm lƣợng MDA đƣợc tính theo hệ số chuyển đổi trên đƣờng cong chuẩn sử dụng MDA tinh khiết từ 2 nmol đến 40 nmol. Độ dố đƣờng cong chuẩn là 28,2.
Tiến hành: cân 0,25g gan chuột nhắt trắng nghiền với 6 ml KCl. Bƣớc 1: 1ml dung dịch nghiền từ phủ tạng thêm vào 0,25 ml acid ascorbic và 0,25 ml muối Mohr.
Bƣớc 2: Ủ 370
C trong 30 phút lấy ra cho thêm vào 0,5 ml dung dịch acid tricloacetic vào các ống, ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút.
Bƣớc 3: Lấy 1ml dịch nổi thêm vào 0,5 ml acid thiobarbituric.
Bƣớ 4: Đun sôi h thuỷ 20 phút s u đó để lạnh ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu hồng.
Bƣớ 5: Đo qu ng ở bƣớc sóng 532nm. Mô bệnh học:
Sau 10, 20 ngày uống thuốc, chuột ở lô đƣợc mổ để qu n s t đại thể toàn bộ ơ qu n. Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, tụy của 30% số chuột ở mỗi lô. Các xét nghiệm vi thể đƣợc thực hiện tại Trung tâm
nghiên cứu và phát hiện sớm Ung thƣ, do PGS.TS. Lê Đình Ro nh đọc và nhận định kết quả.
Đánh giá ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu b ng lên gan v tụy chuột sau khi uống thuốc:
Khi chuột đƣợc lấy máu xét nghiệm lần cuối, tiến hành mổ chuột lấy gan và tụy. X định trọng lƣợng g n và hàm lƣợng MDA. Quan sát mô bệnh học gan và tụy đại thể, vi thể) của 30% số chuột mỗi lô.
2.3.3. Xử lý số liệu:
Số liệu đƣợc nhập và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel [12]. Biểu diễn số liệu: giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (M±SD).
Sử dụng phép thống kê so sánh hai giá trị trung bình test-t. Sự khác biệt của các giá trị trung bình ó ý nghĩ thống kê khi p ≤ 0,05.
CHƢƠNG 3
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC
3.1.1. Xác định độ ẩm dƣợc liệu
Bật m y đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 1100C. Trải đều khoảng 2g bột dƣợc liệu lên đĩ ân, đậy đĩ ân và đợi máy tự động hiện kết quả.
Độ ẩm dƣợc liệu là 8,62%.
3.1.2. Chiết xuất
Cân h nh x 500,05 g dƣợc liệu, chiết bằng phƣơng ph p hiết nóng với dụng cụ chiết liên tục (Soxhlet) lần lƣợt với các dung môi n- hex n, hloroform, ethyl et t. Bã dƣợc liệu đƣợ để b y hơi tự nhiên và sấy ở 600C trƣớc khi cho chiết tiếp với dung môi tiếp theo. Gộp dịch chiết từng phân đoạn và thu đƣợ 3 phân đoạn dịch chiết. C phân đoạn dịch chiết đƣợc cất thu hồi dung môi tới cắn đƣợc ký hiệu lần lƣợt là cắn H, cắn C, cắn E. Cân và t nh hàm lƣợng cắn phân đoạn theo công thức:
X= A 104
M (100- x)
Trong đó: X: hàm lƣợng cắn (%) x: độ ẩm củ dƣợc liệu (%)
a: khối lƣợng cắn (g) M: khối lƣợng dƣợc liệu đem ân g
Bảng 3.1 m lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ rễ Ngưu b ng
STT Phân đoạn Khối lƣợng
dƣợc liệu (g) Khối lƣợng cắn (g)
% so với nguyên liệu khô
1 n-hexan 500,05 8,0621 1,76
2 Chloroform 500,05 16,1029 3,52
Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ rễ ngưu b ng
3.1.3. Định tính các nhóm chất trong rễ Ngƣu bàng
Tiến hành chiết xuất và x định sự có mặt của các nhóm chất trong rễ Ngƣu bàng dựa trên các phản ứng hóa họ thƣờng quy. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.2.
Bột rễ Ngƣu bàng
Dịch chiết n-hexan Bã dƣợc liệu
Cắn H
Dịch chiết chloroform Bã dƣợc liệu
Cắn C
Dịch chiết ethylacetat
Cắn E
n-hexan, Soxhlet
n-hexan thu hồi Chloroform, Soxhlet
choloroform thu hồi Ethylacetat,
Soxhlet
ethylacetat thu hồi
Bảng 3.2. Kết quả định tính sơ bộ một số nhóm chất trong rễNgwu bàng. STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận 1 Flavonoid Phản ứng Cyanidin ++ Có Phản ứng với dd NaOH 10% ++++ Phản ứng với NH3 ++ Phản ứng với dd FeCl3 5% +++ 2 Glycosid tim Phản ứng Libermann – Burchardat + Không có Phản ứng Legal - Phản ứng Baljet - 3 Alcaloid Phản ứng với TT Mayer - Không có Phản ừng với TT Dragendorff - Phản ứng với TT Bouchardat - 4 Coumarin Phản ứng mở đóng vòng l ton +++ Có
Quan sát huỳnh quang +
Phản ứng với TT Diazo + 5 Tanin Phản ứng với dd FeCl3 5% ++++ Có Phản ứng với dd gelatin 1% ++++ Phản ứng với dd chì acetat 10% +++ Phản ứng với dd đồng acetat 10% ++
6 Saponin Quan sát hiện tƣợng tạo bọt - Không có
7 Anthranoid Phản ứng Borntraeger - Không có
8 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol + Có 9 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin 3% + Có 10 Đƣờng khử Phản ứng với TT Fehling A&B ++ Có
11 Acid hữu ơ Phản ứng với Na2CO3 + Có
12 Chất béo Thử trên giấy + Có
13 Carotenoid Phản ứng với H2SO4 đặc - Không có 14 Phytosterol Phản ứng Libermann- Burchardat ++++ Có
Ghi chú: (-) : Phản ứng âm tính (++) : Phản ứng dương tính rõ (+): Phản ứng dương tính (+++): Phản ứng dương tính rất rõ
Nhận xét: Sơ bộ kết luận trong rễ Ngƣu bàng ó hứa flavonoid, coumarin, tannin, acid hữu ơ, đƣờng khử, phytosterol, acid hữu ơ, hất béo, acid amin, polysaccharid; không có alcaloid, anthranoid, carotenoid, glycosid tim, saponin.
3.1.4. Định tính cắn các phân đoạn
3.1.4.1. Định tính cắn phân đoạn n-hexan
Tiến hành x định sự có mặt của một số nhóm chất trong phân đoạn n- hexan, bằng phản ứng hóa học và bằng sắc ký lớp mỏng. Kết quả thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.2.
Bảng 3.3. Kết quả định tính một số nhóm chất trong phân đoạn n-hexan
STT Nhóm chất định tính
Phản ứng định tính Kết quả
Nhận xét
1 Flavonoid P.ƣ Cy nidin - Màu không th y đổi
P.ƣ với NH3 +
P.ƣ với FeCl3 5% + Màu x nh đen
P.ƣ với NaOH 10% +++ Màu vàng cam
2 Coumarin P.ƣ mở đóng vòng l ton +++ Pƣ huyển vị đồng phân cis-
trans
++
Pƣ di zo + Màu đỏ gạch
3 Tanin Pƣ với FeCl3 5% + Màu x nh đen
Pƣ với dd đồng acetat ++ Kết tủa
Pƣ với dd chì acetat + Tủa bông trắng Pƣ với dd gelatin 1% + Tủa bông trắng
4 Chất béo Thử trên giấy +++ Có
5 Phytosterol Phản ứng Libermann ++ Có
Ghi chú : - : âm tính + : dương tính nhẹ ++ : dương tính rõ +++ : dương tính rất rõ
Sơ bộ kết luận phân đoạn n-hexan có: Coumarin, tannin, chất béo, phytosterol
Tiến hành định tính cắn n-hexan bằng SKLM với các hệ dung môi thăm dò: Hệ I: n-hexan – Aceton (9:1)
Hệ II: n-hexan – Ethylacetat (9:1) Hệ III: Chloroform - Methanol (9:1) Hệ IV: Toluen - Aceton (9:1)
Hệ V: Toluen - Ethylacetat- Acid formic – Nƣớc (5:4:1:0,5)
Hệ VI: Toluen - Ethylacetat- Acid formic - Methanol (6:4:0,5:0,5) Hệ VII: Toluen – Ethylacetat – Acid formic (7:4:0,5)
Thuốc thử hiện màu: Vanilin/ H2SO4 10%/ EtOH Sau nhiều lần triển khai thấy hệ VII tách tốt nhất. (Hình 3.2)
3.1.4.2. Định tính cắn phân đoạn chloroform
Tiến hành x định sự có mặt của một số nhóm chất trong phân đoạn CHCl3, bằng phản ứng hóa học và bằng sắc ký lớp mỏng. Kết quả thể hiện ở bảng 3.4 và hình 3.3.
Bảng 3.4. Kết quả định tính một số nhóm chất trong phân đoạn CHCl3 STT Nhóm chất định tính Phản ứng định tính Kết quả Nhận xét 1 Flavonoid P.ƣ Cy nidin P.ƣ với NH3 P.ƣ với FeCl3 5% P.ƣ với NaOH 10% ++ + + +++ Màu hồng Màu x nh đen Màu vàng cam 2 Coumarin P.ƣ mở đóng vòng l ton P.ƣ huyển vị đồng phân cis- trans P.ƣ di zo +++ + + Màu đỏ gạch 3 Tanin P.ƣ với dd FeCl3 5% P.ƣ với dd đồng acetat 10% P.ƣ với dd chì acetat 10% P.ƣ với dd gelatin 1% ++ + +++ ++ Màu x nh đen Kết tủa Tủa bông trắng Tủa bông trắng
Ghi chú: - : âm tính + : dương tính nhẹ ++ : dương tính rõ +++ : dương tính rất rõ
Sơ bộ kết luận trong phân đoạn CHCl3 có : Flavonoid, tannin, coumarin.
Tiến hành định tính cắn Chloroform bằng SKLM với các hệ dung môi thăm dò:
Hệ I: n-hexan – Aceton (9:1) Hệ II: n-hexan – Ethylacetat (9:1) Hệ III: Chloroform - Methanol (9:1) Hệ IV: Toluen - Aceton (9:1)
Hệ V: Toluen - Ethylacetat- Acid formic – Nƣớc (5:4:1:0,5)
Hệ VI: Toluen - Ethylacetat- Acid formic - Methanol (6:4:0,5:0,5)
Thuốc thử hiện màu: vanilin/H2SO4 10%/ EtOH. Sau nhiều lần triển khai thấy hệ VII tách tốt nhất. (Hình 3.3)
3.1.4.3. Định tính cắn phân đoạn Ethylacetat
Tiến hành x định sự có mặt của một số nhóm chất trong phân đoạn EtOAc, bằng phản ứng hóa học và bằng sắc ký lớp mỏng. Kết quả thể hiện ở bảng 3.5 và hình 3.4.
Bảng 3.5. Kết quả định tính một số nhóm chất trong phân đoạn EtOAc
STT Nhóm chất định tính Phản ứng định tính Kết quả Nhận xét 1 Flavonoid P.ƣ Cy nidin P.ƣ với NH3 P.ƣ với FeCl3 5% P.ƣ với NaOH 10% ++ + + ++ Chuyển màu hồng Màu x nh đen Màu vàng cam 2 Coumarin P.ƣ mở đóng vòng l ton
P.ƣ chuyển vị đồng phân cis- trans P.ƣ di zo +++ ++ + Màu đỏ gạch 3 Tanin P.ƣ với dd FeCl3 5% P.ƣ với dd đồng acetat 10% P.ƣ với dd chì acetat 10% P.ƣ với dd gelatin 1% +++ +++ ++ + Màu x nh đen Kết tủa Tủa bông trắng Tủa bông trắng
ghi chú: - : âm tính + : dương tính nhẹ ++ : dương tính rõ +++ : dương tính rất rõ
Sơ bộ kết luận trong phân đoạn ethyacetat có : Tannin, flavonoid, coumarin.
Tiến hành: định tính cắn EtOAc bằng SKLM với các hệ dung môi thăm dò: Hệ I : n-hexan – Ethylacetat (5:5)
Hệ II : Ethylacetat – Methanol – Nƣớc (5:3:1)
Hệ III: Toluen – Ethylacetat – Acid formic (5,5:4:0,5)
Hệ V: Chloroform – Methanol (9:1)
Thuốc thử hiện màu: vanilin/ H2SO4 10%/ EtOH Sau nhiều lần triển khai thấy hệ III tách tốt nhất (Hình 3.4)
AST UV254 UV365 TT,AST AST UV254 UV365 TT,AST Hình 3.2. Sắ ký đồ cắn H Hình 3.3. Sắ ký đồ cắn C
AST UV254 UV365 TT, AST Hình 3.4. Sắ ký đồ cắn E
3.1.5. Phân lập
3.1.5.1. Chuẩn bị cột
Cột thủy tinh có nút mài và khóa. Rửa sạch, làm khô, lắp cố định cột vào giá theo chiều thẳng đứng.Dùng đũ thủy tinh dài để lót một lớp bông (loại bông thấm nƣớc) lên trên ống thoát dịch của cột.
Cân một lƣợng sili gel ần dùng vào cốc có mỏ Lƣợng silicagel nhồi cột gấp từ 25 – 50 lần lƣợng mẫu lên cột . Thêm dung môi dùng để ổn định cột vào, dùng đũ thủy tinh khuấy đều cho tới khi hết bọt khí.
Mở vòi, rót hỗn dịch trên vào cột, cho dung môi chảy và để silicagel lắng tự nhiên xuống đ y ột. Khi dung môi chảy gần đến lớp mặt thoáng Silicagel trong cột, tiếp tục bổ sung dung môi lên cột. Chú ý không để lớp silicagel trong cột bị khô. Tiếp tục dùng dung môi hứng đƣợc rót lên cột và