-Trị nhiệt độ , đ u răng, răng lợi sƣng đ u: Ngƣu bàng ăn 1 đồng ân, giã nƣớc, cho chút muối, nấu thành cao, mỗi lần dùng bôi lên răng lợi. Ngày bôi 2-3 lần [24].
-Trị trĩ lở: Ngƣu bàng ăn, lệ lô ăn hầm cùng ruột già lợn, uống [24] - Trị tai tự nhiên sƣng: Rễ Ngƣu bàng rửa sạch, cắt vụn, giã nhừ, lấy nƣớ 1 thăng, nấu thành o đắp lên trên chỗ sƣng [24]
- Trị chân tay mềm yếu, mệt mỏi không có sức: Rễ Ngƣu bàng hầm gà, hầm thịt uống [24].
1.6 . MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP GÂY TĂNG ĐƢỜNG HUYẾT TRÊN
THỰC NGHIỆM
Cơ hế gây tăng glu ose huyết của các mô hình: Đƣ glu ose từ bên ngoài vào ơ thể.
Tăng lƣợng glucose nội sinh bằng cách: Giảm sử dụng glucose ở tổ chức và ở ngoại vi hoặ tăng phân hủy glycogen thành glucose ở gan.
Gây tổn thƣơng hoặc phá hủy ơ qu n bài tiết insulin. Gây tăng đƣờng huyết bằng chế độ ăn.
Kết hợp phƣơng ph p.
1.6.1. Phƣơng pháp gây tăng glucose huyết bằng alloxan
Cơ hế gây ĐTĐ: Allox n là một hợp chất pyrimidin triketon có cấu trú tƣơng tự glu ose và id uri , t h lũy, gây độc trực tiếp và chọn lọc lên tế bào β ủa tiểu đảo tụy thông qua hệ thống vận chuyển glucose GLUT2. Bên trong tế bào xảy r qu trình tƣơng t giữa alloxan và các nhóm SH nội bào, đặc biệt là glutathion, sinh ra sản phẩm là acid dialuric có khả năng tự oxi hóa. Quá trình tự oxi hóa của chất này đã sản sinh ra các gốc superoxid: hydrogen peroxide và gốc hydroxyl. Các gốc hydroxyl là tác nhân cuối cùng gây tiêu diệt tế bào β, tế bào này có khả năng hống l ại
sự oxi hóa rất kém, vì vậy gây ra tình trạng ĐTĐ phụ thuộc insulin [37], [38], [61].
1.6.2. Phƣơng pháp gây tăng glucose huyết bằng Streptozotocin
Streptozoto in gây độc trực tiếp và chọn lọc trên tế bào β củ đảo tụy thông qua hệ thống vận chuyển GLUT2, bẻ gãy sợi ADN, ức chế sự sao chép ADN ức chế sự nhân lên của tế bào, dần dần dẫn đến hủy hoại tế bào đảo tụy và gây ra tình trạng ĐTĐ phụ thuộ insulin trên động vật thực nghiệm [61].
1.6.3. Phƣơng pháp gây ĐTĐ typ 2 do chế độ ăn giàu chất béo kết hợp alloxan
Nguyên tắc: Chuột đƣợc nuôi béo phì trong khoảng thời gian nhất định, s u đó đƣợ tiêm llox n để gây ĐTĐ typ 2. Cho huột uống thuốc trong khoảng thời gian nhất định, s u đó định lƣợng các chỉ số sinh hóa và giải phẫu mô bệnh họ để đ nh gi ảnh hƣởng của thuốc.
Trong mô hình của Reed, Zang F và Srinivansan K, chuột đƣợc nuôi bằng chế độ ăn giàu hất béo có nồng độ glucose huyết tƣơng tự nhƣ huột đƣợc nuôi bằng chế độ ăn bình thƣờng nhƣng nồng độ insulin, acid béo tự do và trigly erid trong m u tăng o rõ rệt. Các tác giả đều nhận định chế độ ăn giàu hất béo gây ra tình trạng kháng insulin, khiến nhu cầu về bài tiết insulin tăng o hơn so với bình thƣờng [57], [71]. Theo một mô hình khác của Fabiola, chuột ũng đƣợc nuôi bằng chế độ ăn giàu lipid nhƣng ó bổ sung thêm fructose 60% vào thứ ăn ũng ho thấy đƣờng huyết, nồng độ cholesterol toàn phần, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, nồng độ triglycerid của chuột ăn hế độ ăn HFF o hơn nhiều so với chuột ăn hế độ ăn bình thƣờng [39]. Chế độ ăn giàu lipid gây r tình trạng kháng insulin và rối loạn chuyển hóa lipid, việc trộn thêm fru tose gây tăng rối loạn chuyển hóa ở gan vì khi nồng độ fructose trong gan quá cao sẽ dẫn đến tăng ƣờng t h lũy trigly erid ở gan và làm suy giảm khả năng huyển hóa
glucose và lipid ở g n do đó làm tăng nguy ơ mắc các bệnh về tim mạch [76], [83], [84]. Lúc này, chỉ cần tổn thƣơng ở tụy là có thể gây giảm sản xuất insulin, sẽ làm xuất hiện những biến đổi rõ rệt về glucose huyết và các chỉ số sinh hóa khác.
Trong mô hình gây ĐTĐ bằng alloxan của Elshater chuột sau khi tiêm alloxan, theo dõi nồng độ GH và các chỉ số sinh hóa khác, kết quả cho thấy 6 tuần sau khi tiêm alloxan với liều 150mg/kg nồng độ GH, cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL- holoesterol đều o hơn so với chuột bình thƣờng [25]. Do đó ó thể kết hợp hai mô hình trên để đ nh gi tác dụng của thuốc không chỉ trên GH và còn trên các chỉ số hóa sinh khác. Chế độ ăn HFF gây r tình trạng stress oxi hóa tại gan gây tổn thƣơng tế bào g n, do đó mô hình òn đ nh gi đƣợc ảnh hƣởng của thuốc lên khả năng hống oxi hóa củ g n thông qu định lƣợng MDA dị h đồng thể gan.
1.6.4. Một số phƣơng pháp khác.
Mô hình gây ĐTĐ typ 2 bằng chế độ ăn kết hợp STZ liều thấp [31], [63].
Mô hình gây tăng GH theo ơ hế chống phá hủy tế bào β ủ đảo tụy bằng một số hormon tăng trƣởng tuyến yên; hormon vỏ thƣợng thận (hydrocortison, cortison, dexamethason); hormon tủy thƣợng thận dren lin gây tăng GH nhƣng ít xuất hiện glucose niệu) [15], [73].
• Mô hình gây tăng đƣờng huyết bằng glucose ngoại sinh: liều hợp lý nhất có thể gây tăng glu ose huyết trên chuột nhắt trắng là 3g/kg thể trọng [15]
Mô hình gây tăng GH do ph hủy tế bào β đảo tụy bằng các hóa chất kh nhƣ: N-ethyl nitrosoure, vacor, dithizone, 8-hydroxyquinolon, monosodium glutamat [34], [45], [77].
Mô hình gây tăng GH bằng virus: một số virus dễ gây ĐTĐ nhƣ virus gây viêm não, viêm ơ tim dạng D, virus gây sởi Đức, virus gây bệnh bại liệt và quai bị.... [45].
Gây triệu chứng ĐTĐ tạm thời trên chuột lang bằng cách tiêm cho chuột huyết thanh của loài khác mà có chứa kháng thể kh ng insulin để gây ra tình trạng thiếu hụt insulin ở chuột [45].
Mô hình gây ĐTĐ bằng cắt bỏ tuyến tụy: mứ độ trầm trọng của bệnh tùy thuộc vào việc cắt bỏ một phần hay hoàn toàn tuyến tụy.
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
- Mẫu nghiên cứu: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Cành m ng ho , l tƣơi để gi m định tên khoa học.
+ Rễ Ngƣu bàng tƣơi rửa sạch, thái mỏng, phơi se, rồi sấy khô ở 60ºC, nghiền thành bột thô, bảo quản trong túi nilon k n, để chỗ mát làm nguyên liệu nghiên cứu thành phần hóa học và thử tác dụng hạ đƣờng huyết.
- Nơi thu h i: Bãi giữa Sông Hồng, tổ 19, phƣờng Thƣợng Thanh, quận Long Biên, Hà Nội.
- Thời gian thu hái: 2/2012
Mẫu nghiên ứu đƣợc PGS. TS Nguyễn Khắc Khôi - Viện Sinh Thái và Tài Nguyên sinh vật gi m định tên khoa học là: Arctium lappa L., họ Cúc (Asteraceae)
- Mẫu nghiên cứu tác dụng sinh học:
Nguyên liệu đƣợc làm nhỏ sấy khô đem hiết bằng nƣớc 3 lần theo phƣơng pháp sắc mỗi lần sắc khoảng 2 giờ, dịch lọ thu đƣợ đem ô h thủy ở 60-70oC đến cao lỏng 1:1.
2.2. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 2.2.1.Thuốc thử, dung môi, hoá chất 2.2.1.Thuốc thử, dung môi, hoá chất
- Các thuốc thử, dung môi, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích đã ghi trong Dƣợ điển Việt Nam IV.
+ Gliclazid (Diamicron MR viên 30 mg) do Công ty Servier (Pháp) sản
xuất.
+ Alloxan lọ 20g của Hãng Bio Basic INC, Canada.
+ Kit định lƣợng các enzym và chất chuyển hoá trong máu: cholesterol toàn phần (TC), triglycerid (TG), LDL- cholesterol (LDL-C), HDL- cholesterol (HDL-C) của hãng Hospitex Diagnostics (Italy) và DIALAB GmbH (Áo).
+ Các hóa chất làm xét nghiệm mô bệnh họ đạt tiêu chuẩn.
2.2.2 Động vật th nghiệm
- h tác dụng hạ glucose huyết : chuột nhắt trắng chủng Swiss, khoẻ mạnh, giống đực trọng lƣợng trung bình 20 ± 2g, hăn nuôi trong điều kiện đạt tiêu huẩn thí nghiệm đƣợ đặt hàng tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng.
2.2.3. Phƣơng tiện và máy móc
- Cột sắ ký.
- Chất hấp phụ: sili gel k h thƣớc hạt: 0,040 – 0,063 mm) (Merck) - Bản mỏng Silicagel GF254 (Merck)
- Cân kỹ thuật Sartorius - Cân phân tích Precisa - Đèn tử ngoại
- M y x định độ ẩm Sartorius - Kính hiển vi Leica CME - M y đo qu ng ELISA
- Máy ảnh LUMIX DMC TZ7
- Máy cất quay chân không Buchi Rotavapor R-200
- M y đo phổ khối lƣợng (ESI-MS): AGILENT 6310 LC-MSD Trap, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- M y đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- M y đo điểm nóng chảy: Kofler micro-hotstage, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Nghiên cứu về hóa học 2.3.1. Nghiên cứu về hóa học
- Định tính thành phần hóa học: Định tính các nhóm chất trong mẫu nghiên cứu bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng theo các tài liệu sau:
+ Bài giảng Dƣợc liệu I [3].
+ Thực tập Dƣợc liệu - Phần hóa học [4]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Phƣơng ph p nghiên ứu hóa học cây thuốc [13]. - Chiết xuất và phân lập
+ Chiết xuất bằng phƣơng ph p chiết nóng với dụng cụ chiết liên tục (Soxhlet) sử dụng dung môi: n-hexan, chloroform, ethyl acetat
+ Sử dụng phƣơng ph p sắc ký cột (CC) với chất hấp phụ là silicagel + Kiểm tr độ tinh khiết của các chất phân lập bằng SKLM với một số hệ dung môi khai triển.
- Nhận dạng chất tinh khiết: Nhận dạng chất phân lập đƣợc dựa trên dữ liệu phổ MS, NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT).
2.3.2. Nghiên cứu tác dụng trên đƣờng huyết
Tiến hành thử tác dụng hạ đƣờng huyết của cao lỏng Ngƣu bàng theo mô hình của Fabiola (2011)[25] và Elshater (2009) [39] với 2 mức liều 20g/kg và 40g/kg tại 2 mốc thời gian sau 10 ngày và sau 20 ngày uống thuốc.
Nơi thực hiện: Bộ môn Dƣợc lý – Trƣờng Đại học Y Hà Nội
Nguyên tắc: chuột đƣợc nuôi béo phì trong một khoảng thời gian nhất định bằng chế độ ăn giàu hất béo và fru tose, s u đó tiêm llox n gây đ i th o đƣờng. Sau khi tiêm alloxan cho chuột uống thuốc thử trong khoảng thời gian nhất định, định lƣợng đƣờng huyết và các chỉ số sinh hóa
Cách tiến hành: Chuột nhắt trắng giống đực khỏe mạnh đƣợc chia làm 10 lô (mỗi lô 10 con):
- Lô 1A,1B: Lô chứng: chế độ NFD + uống nƣớc cất.
- Lô 2A,2B: Lô mô hình: chế độ HFF + tiêm alloxan + uống nƣớc cất .
- Lô 3A,3B: Chế độ HFF + tiêm alloxan + uống gliclazid liều 30 mg/kg.
- Lô 4A,4B: Chế độ HFF + tiêm alloxan + uống thuốc cần thử với liều 1.
- Lô 5A,5B: Chế độ HFF + tiêm alloxan + uống thuốc cần thử với liều 2. Trong đó hế độ HFF là chế độ ăn giàu hất béo và fructose (high fat diet plus fructose) và chế độ NFD là chế độ ăn bình thƣờng (normal fat diet) Và A: lô chuột thử nghiệm trong 10 ngày, B: lô chuột thử nghiệm trong 20 ngày
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng của chế độ n N v của chuột nhắt tính trên 100g thức n. Thành phần Chế độ ăn b nh thƣờng (NFD) (%) Chế độ ăn giàu chất b o (HFD)* (%) Protein 28,05 18,23 Chất béo no 12,14 42,89 Carbonhydrat 59,81 38,88 Tổng 100,00 100,00
*Sirô fructose 55% (Daesang Corporation) được trộn thêm trong thức ăn của chuột nhắt c chế độ ăn D.
Tất cả chuột ở 10 lô đƣợ định lƣợng glucose máu lần 1 khi bắt đầu tham gia nghiên cứu (nhịn đói qu đêm . Chuột trong các lô từ 2-5 ăn hế độ HFF, lô 1 ăn hế độ NFD trong 10 tuần liên tục, sau 10 tuần tất cả chuột đƣợ định lƣợng glucose máu lần 2. Tiêm alloxan liều 200mg/kg cho các lô chuột 2-5, lô 1 đƣợ tiêm nƣớc muối sinh lý. 72 giờ sau khi tiêm alloxan và nƣớc muối sinh lý, định lƣợng glucose máu lần 3, chọn các chuột ở các lô tiêm alloxan bị đ i th o đƣờng (có mứ glu ose khi đói trên 10mmol/l
đƣợc tham gia nghiên cứu. Các lô chuột đƣợc uống nƣớc cất hoặc thuốc cần thử tác dụng sau 1 thời gian nhất định sau khi gây mô hình. Ngày cuối cùng 10 ngày đối với lô A, 20 ngày đối với lô B) sau khi uống thuốc 1 giờ trƣớ đó huột đã đƣợc nhịn đói qu đêm định lƣợng glucose máu lần 4 và các chỉ số lipid m u, đồng thời lấy g n định lƣợng MDA trong dịch đồng thể gan và làm giải phẫu vi thể và lấy tụy để làm giải phẫu vi thể. Phương pháp xác định MDA dịch đồng thể gan:
Nguyên lý của phương pháp: MDA phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức trimethine có màu hồng và ó đỉnh hấp thụ cự đại ở bƣớc sóng 530-532nm.
Mật độ quang OD (XE) của dung dị h đo tỷ lệ thuận với nồng độ MDA. Hàm lƣợng MDA đƣợc tính theo hệ số chuyển đổi trên đƣờng cong chuẩn sử dụng MDA tinh khiết từ 2 nmol đến 40 nmol. Độ dố đƣờng cong chuẩn là 28,2.
Tiến hành: cân 0,25g gan chuột nhắt trắng nghiền với 6 ml KCl. Bƣớc 1: 1ml dung dịch nghiền từ phủ tạng thêm vào 0,25 ml acid ascorbic và 0,25 ml muối Mohr.
Bƣớc 2: Ủ 370
C trong 30 phút lấy ra cho thêm vào 0,5 ml dung dịch acid tricloacetic vào các ống, ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút.
Bƣớc 3: Lấy 1ml dịch nổi thêm vào 0,5 ml acid thiobarbituric.
Bƣớ 4: Đun sôi h thuỷ 20 phút s u đó để lạnh ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu hồng.
Bƣớ 5: Đo qu ng ở bƣớc sóng 532nm. Mô bệnh học:
Sau 10, 20 ngày uống thuốc, chuột ở lô đƣợc mổ để qu n s t đại thể toàn bộ ơ qu n. Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, tụy của 30% số chuột ở mỗi lô. Các xét nghiệm vi thể đƣợc thực hiện tại Trung tâm
nghiên cứu và phát hiện sớm Ung thƣ, do PGS.TS. Lê Đình Ro nh đọc và nhận định kết quả.
Đánh giá ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu b ng lên gan v tụy chuột sau khi uống thuốc:
Khi chuột đƣợc lấy máu xét nghiệm lần cuối, tiến hành mổ chuột lấy gan và tụy. X định trọng lƣợng g n và hàm lƣợng MDA. Quan sát mô bệnh học gan và tụy đại thể, vi thể) của 30% số chuột mỗi lô. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.3. Xử lý số liệu:
Số liệu đƣợc nhập và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel [12]. Biểu diễn số liệu: giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (M±SD).
Sử dụng phép thống kê so sánh hai giá trị trung bình test-t. Sự khác biệt của các giá trị trung bình ó ý nghĩ thống kê khi p ≤ 0,05.
CHƢƠNG 3
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC
3.1.1. Xác định độ ẩm dƣợc liệu
Bật m y đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 1100C. Trải đều khoảng 2g bột dƣợc liệu lên đĩ ân, đậy đĩ ân và đợi máy tự động hiện kết quả.
Độ ẩm dƣợc liệu là 8,62%.
3.1.2. Chiết xuất
Cân h nh x 500,05 g dƣợc liệu, chiết bằng phƣơng ph p hiết nóng với dụng cụ chiết liên tục (Soxhlet) lần lƣợt với các dung môi n- hex n, hloroform, ethyl et t. Bã dƣợc liệu đƣợ để b y hơi tự nhiên và sấy ở 600C trƣớc khi cho chiết tiếp với dung môi tiếp theo. Gộp dịch chiết từng phân đoạn và thu đƣợ 3 phân đoạn dịch chiết. C phân đoạn dịch chiết đƣợc cất thu hồi dung môi tới cắn đƣợc ký hiệu lần lƣợt là cắn H, cắn C, cắn E. Cân và t nh hàm lƣợng cắn phân đoạn theo công thức:
X= A 104
M (100- x)
Trong đó: X: hàm lƣợng cắn (%) x: độ ẩm củ dƣợc liệu (%)
a: khối lƣợng cắn (g) M: khối lƣợng dƣợc liệu đem ân g
Bảng 3.1 m lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ rễ Ngưu b ng
STT Phân đoạn Khối lƣợng
dƣợc liệu (g) Khối lƣợng cắn (g)
% so với nguyên liệu khô
1 n-hexan 500,05 8,0621 1,76
2 Chloroform 500,05 16,1029 3,52
Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ rễ ngưu b ng
3.1.3. Định tính các nhóm chất trong rễ Ngƣu bàng
Tiến hành chiết xuất và x định sự có mặt của các nhóm chất trong rễ Ngƣu