3.5.1.1. Quy trình chuẩn hóa phương pháp phân tắch xác ựịnh dư lượng sudan I, sudan IV trong trứng bằng kỹ thuật UPLC-MS/MS.
Bước 1. Xác ựịnh tắnh ựặc hiệu/chọn lọc
Phân tắch các mẫu trứng trắng, lặp lại 6 lần. Yêu cầu mẫu trắng thì phải không ựược cho tắn hiệu phổ khối của chất cần phân tắch.
Sau khi chuẩn bị mẫu trắng, thêm chuẩn ở hàm lượng khoảng 2 LOD, lặp lại tối thiểu 6 lần. So sánh kết quả mẫu trắng thêm chuẩn với mẫu trắng, so sánh sắc ựồ của hai
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 32 nhóm mẫu ựể ựánh giá tắnh ựặc hiệu/chọn lọc với yêu cầu khối phổ phải ựạt số ựiểm IP ≥ 4 (trong ựó: ion mẹ tương ứng là 1ựiểm IP và ion con tương ứng là 1,5 ựiểm IP).
Bước 2. Xác ựịnh giới hạn phát hiện (LOD)
Mẫu trắng ựược thêm chuẩn sudan I, sudan IV ở các nồng ựộ 2, 5, 7,5 và 10 ppb. Xử lý mẫu và thực hiện phân tắch trên thiết bị UPLC-MS/MS ựể tìm nồng ựộ nhỏ nhất mà tắn hiệu phổ khối m/z của sudan I, sudan IV trên nền mẫu lòng ựỏ trứng xuất hiện ựầy ựủ (IP là 4 ựiểm). Sau ựó tắnh toán giá trị LOD theo công thức:
S
3 ≤ T = ---- ≤ 15 Trong ựó S là tắn hiệu; N là nhiễu ựường nền N của sudan
Khi ựó giới hạn phát hiện (LoD) ựược tắnh theo công thức: Cmin
LOD = 3 x --- T
Bước 3. Xác ựịnh giới hạn quyết ựịnh (CCα) và (CCβ):
+ Thắ nghiệm xác ựịnh giới hạn quyết ựịnh (CCα):
Chuẩn bị 20 mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng ựộ nhỏ nhất mà PTN có thể phát hiện và khẳng ựịnh; tắnh trung bình, tắnh ựộ lệch chuẩn (phải khác 0) và tắnh CCα theo công thức: CCα = trung bình + 2,33 SD.
→ đánh giá: trong số 20 mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng ựộ nhỏ nhất mà PTN có thể phát hiện và khẳng ựịnh, không có quá 01 mẫu có nồng ựộ vượt CCα.
+ Thắ nghiệm xác ựịnh khả năng phát hiện (CCβ):
Chuẩn bị 20 mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng ựộ CCα, tắnh trung bình, tắnh ựộ lệch chuẩn và tắnh CCβ theo công thức: CCβ = CCα + 1,64 SD.
→ đánh giá: trong số 20 mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng ựộ CCα, không có quá 01 mẫu có nồng ựộ vượt CCβ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 33 Chuẩn bị mẫu trắng thêm chuẩn sudan I, sudan IV có nồng ựộ từ 10 tới 500 ộg/kg. Chuẩn bị mẫu và phân tắch mẫu theo quy trình phân tắch. Bơm dịch chiết lên hệ thống máy UPLC-MS/MS và phần mềm của thiết bị sẽ tự lập phương trình tuyến tắnh y = ax + b.
→ Tiêu chắ chấp nhận: hệ số hồi quy 0,99 ≤ R2 ≤1.
Bước 5. Xác ựịnh ựộ thu hồi (R%), ựộ chụm (CV%) và ựộ chụm trung gian (CVp)
Chuẩn bị mẫu trắng thêm chuẩn sudan I, sudan IV có nồng ựộ 1 ; 2 và 3 X ộg/kg; mỗi nồng ựộ làm 6 lần, lập lại 3 ngày (trong ựó X là nồng ựộ mà phương pháp phân tắch có thể phát hiện, khẳng ựịnh và ựịnh lượng, thường trong phòng thắ nghiệm sẽ lấy nồng ựộ X cao hơn nồng ựộ mà phương pháp phân tắch có thể phát hiện, khẳng ựịnh và ựịnh lượng). Sau ựó tiến hành chiết và làm sạch mẫu theo quy trình phân tắch. Cuối cùng bơm dịch chiết lên hệ thống máy UPLC- MS/MS và tắnh toán kết quả.
→ đánh giá: ựánh giá kết quả thắ nghiệm theo quy ựịnh trong quyết ựịnh 657/2002/EC (Decision 657/EC, 2002).
- độ thu hồi ựạt yêu cầu khi giá trị tắnh nằm trong khoảng 80 -110% (Hàm lượng chất(10-100 ppb)).
- độ chụm và ựộ chụm trung gian ựạt yêu cầu khi giá trị tắnh nằm trong khoảng ≤ 15% (Hàm lượng chất(10-100 ppb)).
2.5.1.2. Thắ nghiệm xác ựịnh khả năng nhiễm chất nhuộm màu sudan I, IV vào trứng chim cút thắ nghiệm.
Thắ nghiệm 1. Xác ựịnh khả năng nhiễm chất nhuộm màu sudan I, IV vào lòng ựỏ trứng bằng ựường thức ăn.
- động vật thắ nghiệm: Cút mái ựược nuôi bằng thức ăn cho cút ựẻ. - Bố trắ thắ nghiệm:
Lô 1 (lô ựối chứng âm): 10 chim cút mái ựược nuôi bằng thức ăn không bổ sung chấtnhuộm màu sudan I và IV.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 34 Lô 2 (lô bổ sung sudan I): 10 chim cút mái ựược nuôi bằng thức ăn có bổ sung chấtnhuộm màu sudan I.
Lô 3 (lô bổ sung sudan IV): 10 chim cút mái ựược nuôi bằng thức ăn có bổ sung chấtnhuộm màu sudan IV.
- Liều lượng sudan I, IV bổ sung vào thức ăn chăn nuôi là 10 mg/kg thức ăn sudan I cho lô 2 và sudan IV cho lô 3 (tham khảo theo bài báo ỔỔBa tỉnh Trung Quốc có trứng vịt lòng ựỏ tươi" ựăng trên báo tuổi trẻ online ngày 17 tháng 11 năm 2006 (Uyên Kim, 2006).
- Các ựiều kiện chăm sóc nuôi dưỡng khác thông thường như chăn nuôi cút ựẻ. Theo dõi thắ nghiệm; thu các mẫu trứng ở các lô thắ nghiệm ựể ựem phân tắch ựể xác ựịnh sự nhiễm chất nhuộm màu sudan I, IV vào lòng ựỏ trứng bằng ựường thức ăn.
Thắ nghiệm 2:Xác ựịnh khả năng nhiễm chất nhuộm màu sudan I, IV vào lòng ựỏ trứng bằng ựường ngâm trứng trong nước muối bão hoà có hòa trộn chất nhuộm màu sudan I và IV.
- Bố trắ thắ nghiệm: Trứng dùng cho thắ nghiệm này lấy từ lô ựối chứng âm của thắ nghiệm 1 (trứng không chứa chất nhuộm màu sudan I và IV) mà ở ựó trứng ựược ngâm trong nước muối bão hòa trong thời gian 3 tuần (theo kỹ thuật của Trung tâm thông tin KH&CN quốc gia, 2005).
- Cụ thể như sau:
Lô 1 (lô ựối chứng âm): 10 trứng ngâm trong nước muối bão hoà.
Lô 2a (Lô sudan I, 12,5ộg/ml): 10 trứng ngâm vào dung dịch nước muối bão hoà có hòa trộn sudan I ở hàm lượng 12,5 ộg/ml.
Lô 2b (Lô sudan I, 250 ộg/ml) : 10 trứng ngâm vào dung dịch nước muối bão hoà có hòa trộn sudan I ở hàm lượng 250 ộg/ml.
Lô 3a (Lô sudan IV, 12,5 ộg/ml) : 10 trứng ngâm vào dung dịch nước muối bão hoà có hòa trộn sudan IV ở hàm lượng 12,5 ộg/ml.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 35 Lô 3b (Lô sudan I, 250 ộg/ml): 10 trứng ngâm vào dung dịch nước muối bão hoà có hòa trộn sudan IV ở hàm lượng 250 ộg/ml.
Ghi chú: đầu tiên chất nhuộm màu sudan I hoặc IV ựược hòa tan trong dung môi ethanol ở nồng ựộ 100 mg/ml. Sau ựó dung dịch ựặc này ựược thêm vào dung dịch nước muối bão hòa theo những lượng nhất ựịnh ựể nồng ựộ sudan I hoặc IV hòa trộn trong nước muối bão hòa ngâm trứng ựó ở nồng ựộ 12,5 và 250 ộg/ml.
- Theo dõi thắ nghiệm. Sau 03 tuần vớt trứng và phân tắch ựể xác ựịnh sự nhiễm chất nhuộm màu sudan I, IV vào lòng ựỏ trứng bằng ựường ngâm trong nước muối bão hòa có hòa trộn sudan I, IV.
2.5.1.3. Thắ nghiệm xác ựịnh khả năng nhiễm chất nhuộm màu sudan I, IV vào trứng gà và vịt trong thực ựịa
a, điều tra tình hình chăn nuôi, cơ sở thu gom, cơ sở chế biến trứng và lấy mẫu.. - điều tra bằng phiếu ựiều tra ựược thiết kế sẵn (Phụ lục 1 và phụ lục 2). - Lấy mẫu trứng gà và vịt gồm trứng tươi, trứng muối tại cơ sở thu gom, cơ sở chế biến trứng và các hộ chăn nuôi.
Phân bổ mẫu như sau:
Phân bổ mẫu trứng thu thập ựể phân tắch chất nhuộm màu sudan I, sudan IV
Hộ chăn nuôi (mẫu)
Cơ sở thu gom (mẫu) Cơ sở chế biến trứng vịt muối (mẫu) Thông tin về mẫu Trứng gà tươi Trứng vịt tươi Trứng gà tươi Trứng vịt tươi Trứng vịt muối Số lượng (mẫu) 20 20 15 15 20 Ớ Ghi chú:
- Mỗi mẫu tối thiểu 5 trứng nhưng không quá 10 trứng;
- Chủ ựộng lấy 05 mẫu trứng vịt tươi có vết phẩm màu ựỏ hồng tại hộ chăn nuôi và 02 mẫu trứng vịt tươi có phẩm màu ựỏ hồng tại cơ sở thu gom.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
* Thắ nghiệm
- Mẫu trứng thu thập ựược, ựem phân tắch chỉ tiêu sudan I, IV trong lòng trắng, trong lòng ựỏ, trên vỏ trứng có vết chất phẩm màu, vỏ trứng không có vết phẩm màu và vỏ trứng vịt muối.
→ Kết hợp kết quả phân tắch sudan I, IV trong các mẫu thu thập ựược với thông tin về phương thức chăn nuôi, thu gom, chế biến trứng gia cầm ựể tìm con ựường lây nhiễm chất nhuộm màu sudan I, IV vào trứng gà và vịt.