Theo quyết ựịnh 657/2002/EU, chuẩn hóa phương pháp thử là yêu cầu bắt buộc của phép thử áp dụng tại phòng thử nghiệm. đó là việc khẳng ựịnh bằng kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan các yêu cầu xác ựịnh cho việc áp dụng phương pháp thử.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 25
1.3.2.1. Quy trình chuẩn bị mẫutóm tắt như sau (quy trình của hãng Waters, phù hợp với thiết bị UPLC-MS/MS):
1g ổ 0,01mg (mẫu trứng) vào ống ly tâm 10ml) ↓ 5ml acetonitrile ↓ siêu âm 30 phút ↓ Ly tâm 10.000 vòng/phút ( 5 phút ) ↓ Hút lớp trên ( lần 1) ↓ 5ml acetonitrile
( thêm vào phần còn lại, ựể tách thêm 1 lần nữa) ↓
Siêu âm 30 phút ↓
Ly tâm 10.000 vòng/phút ( 5 phút ) ↓
Hút lớp trên ( lần 2) trộn vào dung dịch lần 1 ↓
Thêm 2ml H2O ↓
để ở nhiệt ựộ - 20oC ( 20 phút)
(Mục ựắch tách Tạp chất ( protein, mỡ ) trong dung dịch) ↓ Ly tâm 10.000 vòng/phút ( 5 phút) ↓ Hút lớp trên ↓ Lọc qua ựầu lọc ( d (lỗ)= 0,2ộm) Vào bình ựịnh mức 10ml ↓
Cho dung môi của pha ựộng vào Pha loãng ựến ựịnh mức 10ml
↓
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 26 ↓
Phân tắch bằng UPLC-MS/MS
Ghi chú: trong việc chuẩn bị mẫu ựể phân tắch sudan I, IV trên mẫu vỏ trứng, thay vì cân 1 g mẫu và cho vào 5 mL ACN ựể chiết siêu âm, phòng thắ nghiệm xếp trứng vào cốc thủy tinh, ựổ ACN ngập quả trứng và cho vào máy siêu âm trong 30 phút, lấy dịch chiết này ựem xử lý theo các bước của quy trình.
1.3.2.2. Các thông số cần xác dịnh: a, Tắnh ựặc hiệu/chọn lọc
Là khả năng phân biệt chất cần phân tắch với các chất khác. Trong kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ, yêu cầu ựiểm nhận dạng (IP) phải ≥ 4 (tối thiểu phải có ion mẹ là 1 ựiểm, 2 ion con, mỗi ion là 1,5 ựiểm).
b, Giới hạn phát hiện (LOD)
Là nồng ựộ nhỏ nhất của chất phân tắch cho vào mẫu trắng, sau khi chuẩn bị mẫu, ựo trên máy cho tắn hiệu (S) so với nhiễu ựường nền (N) ựáp ứng ựược ựiều kiện ≥ 3.
c, Giới hạn quyết ựịnh (CCα) và khả năng phát hiện (CCβ)
Giới hạn quyết ựịnh (CCα) là nồng ựộ nhỏ nhất của chất phân tắch trong mẫu mà phương pháp ựưa ra kết luận là mẫu dương tắnh khi xác suất lỗi dương tắnh giả α = 1%.
Khả năng phát hiện (CCβ) là nồng ựộ thấp nhất của chất phân tắch trong mẫu mà phương pháp có thể phát hiện ựược khi xác suất lỗi âm tắnh giả β = 5%.
d, Xác ựịnh ựộ tuyến tắnh
Chuẩn bị mẫu trắng thêm chuẩn ở ắt nhất 5 nồng ựộ khác nhau. Chuẩn bị mẫu theo quy trình phân tắch và ựo trên thiết bị UPLC-MS/MS. Chương trình phần mềm của thiết bị sẽ tự lập phương trình tuyến tắnh y = ax + b. Tiêu chắ chấp nhận: hệ số hồi quy 0,99 ≤ R2 ≤1.
e, độ thu hồi (%)
Tắnh bằng tỷ lệ % hàm lượng chất phân tắch ựo ựược thực tế từ mẫu trắng thêm chuẩn so với nồng ựộ cho vào.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 27
f, độ lập lại (ựộ chụm)
độ lập lại ựánh giá mức ựộ biến ựộng của kết quả thử nghiệm ựược thực hiện bởi cùng một người trong cùng phòng thử nghiệm. đánh giá ựộ lặp lại của phép thử thường thực hiện trên mẫu trắng thêm chuẩn vào ở 3 ngưỡng nồng ựộ 1x, 1,5x, 2x MRPL, mỗi nồng ựộ ựược kiểm nghiệm lập lại 6 lần. Tiêu chắ ựánh giá là hệ số biến thiên (CV%) theo quy ựinh trong quyết ựịnh 657/2002/EC.
g, độ chụm trung gian (SR)
độ chụm trung gian diễn tả mức ựộ biến ựộng trong phạm vi phòng thử nghiệm thực hiện trong các ngày khác nhau. Tuy nhiên, không cần thiết nghiên cứu riêng rẽ sự ảnh hưởng của từng nhân tố. để ựánh giá ựộ chụm trung gian của phép thử, phép thử ựược thực hiện trên mẫu trắng thêm chất chuẩn ở 3 nồng ựộ khác nhau (1x, 1,5x, 2x MRPL), mỗi nồng ựộ ựược kiểm nghiệm 6 lần, thực hiện 3 ngày khác nhau. Tắnh hệ số biến thiên (CV%) chụm ở mỗi nồng ựộ phân tắch; Tiêu chắ ựánh giá là hệ số biến thiên (CV%) theo quy ựịnh trong quyết ựịnh 657/2002/EC.
Ghi chú: Trong các phòng thử nghiệm, thường kết hợp các thắ nghiệm ựể tắnh ựộ thu hồi, ựộ chụm, ựộ chụm trung gian (SR) và thắ nghiệm bố trắ ựể xác ựịnh ựộ thu hồi, ựộ chụm không nhất thiết phải bố trắ ở 3 nồng ựộ khác nhau là 1x, 1,5x, 2x MRPL (có thể xê dịch).