NỘI DUNG – NGUYÊN LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2.Phương pháp nghiên cứu
2.3.2.1. Phương pháp điều tra hồi cứu
Phương pháp điều tra hồi cứu được sử dụng nhằm thu thập, tổng hợp thông tin từ các Trạm thú y, Chi cục thú y Hà Nội, Cục thú y về tình hình chăn nuôi gia cầm, diễn biến dịch cúm gia cầm, kết quả tiêm phòng vaccine, kết quả xét nghiệm giám
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41 sát huyết thanh sau tiêm phòng. Từ đó đánh giá được hiệu quả của việc tiêm phòng vaccine cúm trên thực địa của Thành phố Hà Nội.
2.3.2.2. Phương pháp phân tích dịch tễ học
Phương pháp phân tích dịch tễ học được dùng để đánh giá một số đặc điểm dịch tễ của bệnh cúm gia cầm trên địa bàn thành phố Hà Nội.
2.3.2.3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
* Mẫu huyết thanh:
Dùng bơm tiêm lấy 1 – 1,5 ml máu, để nghiêng, chờ máu đông chắt lấy huyết thanh.
* Bảo quản mẫu:
Mẫu gửi phải đặt trong hộp bảo quản có nhiệt độ từ 20C đến 80C trong quá trình vận chuyển. Phiếu gửi bệnh phẩm, danh sách mẫu kèm theo phải ghi rõ ràng, đầy đủ các thông tin cung cấp cho phòng xét nghiệm và phải đựng trong một túi nilon khác tách biệt với mẫu bệnh phẩm, tránh gây ướt làm thông tin không chính xác.
Mẫu bệnh phẩm gia cầm được Chi cục thú y Hà Nội gửi đến Trung tâm chẩn đoán – Cục thú y để xét nghiệm. Tại đây, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -200C.
2.3.2.4. Kiểm tra hiệu giá kháng thể và độ dài miễn dịch của gà và vịt sau tiêm phòng
Chọn 2 trại gà tại Phú Xuyên và 2 trại vịt tại Sơn Tây để làm thí nghiệm. - Bố trí thí nghiệm
+ Trại gà sinh sản 5000 con giống ISA BROWN: trong đó khoảng 4.900 con được tiêm vaccine cúm gia cầm, 100 con không tiêm làm đối chứng.
+ Trại vịt siêu trứng có quy mô 2.000 con: khoảng 1.900 con được tiêm vaccine cúm gia cầm, 100 con không tiêm làm đối chứng
- Trước khi tiêm vaccine lấy ngẫu nhiên 20 mẫu huyết thanh ở mỗi trại để kiểm tra kháng thể cúm gia cầm bằng phản ứng HI. Sau đó tiêm vaccine cúm A/H5N1 mũi 1 với liều 0,5 ml/con cho gà và vịt thí nghiệm. Đối với 2 trại vịt, tiêm nhắc lại mũi 2 với liều 0,5 ml/con sau 28 – 35 ngày. Riêng lô đối chứng không tiêm vaccine.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42 - Sau khi tiêm vaccine 30 – 60 – 90 – 120 ngày tương ứng với gà 44 – 74 – 104 – 134 ngày tuổi và vịt 74 – 104 – 134 – 164 ngày tuổi, tiến hành lấy ngẫu nhiên 20 mẫu máu gà và vịt đã tiêm phòng và lấy 10 mẫu máu ở lô đối chứng của mỗi trại. Dùng bơm tiêm lấy 3 ml máu ở tĩnh mạch cánh, để nghiêng, chờ máu đông, bảo quản trong thùng xốp có đá và vận chuyển đến Trung tâm Chẩn đoán – Cục Thú y để xét nghiệm.
2.3.2.5. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI): Sử dụng để kiểm tra hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng trên đàn gà.
* Chuẩn bị dung dịch:
- Dung dịch chống đông máu (Citrat natri 5%): Citrat natri 5 g Nước cất vừa đủ 100 ml
- Dung dịch pha loãng kháng nguyên và hồng cầu: NaCl 0,85%: NaCl 8,5 g Nước cất vừa đủ 100 ml - Dung dịch PBS 0,01M pH 7,2 Na2HPO4 1,096 g Na2HPO4…H2O 0,316 g NaCl 8,5 g Nước cất 1.000 ml
Các dung dịch trên, sau khi pha hấp tiệt trùng ở 121oC trong 30 phút. * Pha dung dịch hồng cầu gà 1%:
- Máu gà trống khoẻ mạnh đã trưởng thành, không có kháng thể cúm và Newcastle.
- Dùng bơm tiêm 5 hút sẵn 1 ml (10% thể tích) dung dịch chống đông (Natri Citrat 5%) rồi lấy máu gà cho vào ống nghiệm.
- Ly tâm 1.000 – 1.500 vòng/phút, trong 15 phút, hút bỏ huyết tương và bạch cầu, cho thêm nước sinh lý (NaCL 0,85%) vào hồng cầu, lắc đều. Ly tâm như trên 3 - 4 lần để rửa hồng cầu, sau lần ly tâm cuối hút bỏ nước ở trên.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43 - Pha hồng cầu thành huyễn dịch 1% bằng cách pha 1 ml hồng cầu với 99ml nước muối sinh lý.
- Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt độ 4 - 80C. Hồng cầu sau khi pha có thể dùng 4 - 5 ngày (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết thì loại bỏ).
* Xác định hiệu giá của virus kháng nguyên:
Dùng phản ứng ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin – HA) để chuẩn độ kháng nguyên chuẩn H5.
Dùng đĩa làm phản ứng ngưng kết có các giếng, đáy chữ V gồm 12 cột và 8 hàng. - Nguyên liệu: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Kháng nguyên chuẩn: Kháng nguyên là virus cúm vô hoạt subtype H5 chuẩn. Pha kháng nguyên H5 cho phản ứng HI là 4 đơn vị HA/25µl.
+ Hồng cầu gà 1%. - Tiến hành phản ứng:
Cho 25µl PBS (pH 7,2) vào các giếng từ cột 1 đến cột 12 hàng A và B. Cho 25µl kháng nguyên chuẩn vào các giếng ở cột 1 của hàng A và B.
Pha loãng bậc 2 kháng nguyên kiểm tra. Chuyển 25µl từ giếng 1 đến giếng 11 rồi bỏ đi 25µl.
Cột 12 dùng làm đối chứng, chứa 25µl PBS và 25µl hồng cầu gà 1%. Cho 25µl hồng cầu gà 1% vào các giếng phản ứng.
Lắc nhẹ bằng tay hoặc bằng máy. Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút đọc kết quả. - Đọc kết quả:
Phản ứng (-): Hồng cầu lắng đều ở dưới đáy.
Phản ứng (+): Xảy ra hiện tượng ngưng kết, hồng cầu ngưng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng.
Đọc hiệu giá ngưng kết: Hiệu giá ngưng kết kháng nguyên được đánh giá ở độ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.
- Xác định tỷ lệ pha kháng nguyên 4HA thích hợp:
Lấy độ pha loãng cuối cùng có ngưng kết hồng cầu chia cho 4. Ví dụ: Hiệu giá HA mà chúng ta kiểm tra được là 1/128. Đơn vị 4HA = 128 : 4 = 32
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44 Như vậy sẽ trộn 1 phần kháng nguyên chuẩn với 31 phần PBS để đạt được dung dịch kháng nguyên 4 HA.
* Xác định hiệu giá kháng thể:
Dùng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (Haemagglutination Inhibition - HI) để xác định hiệu giá kháng thể của gà đã được tiêm vaccine cúm gia cầm.
Đĩa làm phản ứng ngăn trở ngưng kết có đáy chữ V gồm 12 cột và 8 hàng. - Nguyên liệu:
+ Kháng nguyên chuẩn (subtype H5) 4 đơn vị HA/25µl. + Hồng cầu gà 1%.
+ Huyết thanh: Huyết thanh làm phản ứng được chắt từ mẫu máu gà thí nghiệm và máu gà đối chứng, bảo quản ở 4 - 80C.
- Tiến hành phản ứng:
Nhỏ 25µl PBS vào các giếng đáy chữ V của đĩa 96 giếng. Nhỏ tiếp 25µl huyết thanh vào giếng đầu tiên (từ A1 → H1).
Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25µl huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự đến giếng 11 và bỏ đi 25µl cuối cùng.
Nhỏ 25µl kháng nguyên 4 HA đã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1 - 11. Thêm 25µl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12).
Lắc đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút.
Nhỏ 25µl hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng của đĩa, lắc đều. Để ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 30 phút.
- Đọc kết quả:
Phản ứng (+) (tức là có kháng thể): Có hiện tượng hồng cầu lắng xuống đáy thành cục tròn giống như đối chứng.
Phản ứng (-) (không có kháng thể): Có hiện tượng ngưng kết xảy ra ở giếng phản ứng.
Hiệu giá kháng thể HI là độ pha loãng huyết thanh cao nhất vẫn còn lượng kháng thể để ngăn cản 4HA virus gây ngưng kết hồng cầu.
Trong máu gà, nếu hiệu giá HI ≥ 4log2 thì cá thể gà đó được bảo hộ đối với virus cúm cường độc.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});