B: Ả nh chụp các tiểu phần virus cúmA dưới kính hiển vi điện tử huỳnh quang.
1.3.5. Sự tiến hóa của virus cúmA/H5N
Năm 1996, H5N1 được phân lập từ ngỗng tại một ổ dịch ở Quảng Đông (Trung Quốc) và chủng này được coi là chủng nguyên thủy tạo nên các dòng virus gây bệnh cúm gia cầm trong những năm qua. Chủng virus nguyên thủy này, lúc đó cung cấp nguồn gen HA(H5) cho tiến trình tái tổ hợp tạo nên các biến chủng gây dịch bệnh trên gia cầm và người ở Hong Kong năm 1997, và nguồn gen khung khác của virus cúm A/H5N1 Hong Kong được kiến tạo từ virus cúm A có ở chim cút (Guan và cs, 2002). Riêng nguồn gen NA(N1) còn chưa biết được lấy từ đâu, nhưng cấu trúc của gen có hiện tượng xóa đi 57 nucleotide mã hóa cho 19 amino acid, tại vùng đầu N của protein neuraminidase, và đột biến “xóa gen” này của N1 có liên quan đến tính thích ứng của virus cúm từ thuỷ cầm lên gia cầm trên cạn và người. Đối với gen HA(H5) đột biến giãn nở chuỗi nối giữa HA1 và HA2 mã hóa cho các amino acid kiềm (Arginine và Lysine) có liên quan đến tiến trình tăng cường độc lực, và ở các chủng thuộc dòng Quảng Đông (Guangdong-like sublineage), các amino acid thông thường là -RRRKK- (Matrosovich và cs, 1999).
Sau một năm gây bệnh tại Hong Kong, do toàn bộ đàn gia cầm bị tiêu diệt, virus cúm A/H5N1 nguyên thủy gốc Quảng Đông không còn gia cầm cạn để gây bệnh, người ta tưởng chúng đã biến mất, nhưng thực tế chủng nguyên thủy này vẫn tiếp tục tồn tại trong ngỗng ở vùng Nam Trung Quốc, trở thành nguồn gen tái tổ hợp hình thành biến chủng mới (Cauthen và cs, 2000).
Trong các năm 1997 - 2002, một số biến chủng virus cúm A/H5N1 mang nhiều đặc tính kháng nguyên khác nhau của subtype H5 được hình thành tạo nên nhóm kháng nguyên (clade) 1 có độc lực cao với gà nhưng thấp đối với vịt. Tiếp tục, trong năm 2002 - 2003, gen HA(H5) có những đột biến mới do hậu quả của hiện tượng lệch kháng nguyên (antigenic drift), để rồi tạo nên biến chủng có tính gây bệnh cực kỳ cao, đặc biệt đối với vịt, và lây sang người. Đặc tính thích ứng gây bệnh trên người càng ngày càng cao dần, cùng với độc lực tăng cường đối với đa vật chủ bao gồm vịt, gà, ngan, ngỗng, chim cút, chim hoang dã và người, để rồi hình thành nhiều biến chủng xâm nhập các nước phía Nam châu Á trong đó có Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Lào, Campuchia…(Guan và cs, 2002)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21
Hình 1.6. Cây phát sinh loài dựa trên gen HA các virus cúm A/H5N1 độc lực cao (WHO)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22 Có thể nói, sau giai đoạn 1997 - 2003, virus cúm A/H5N1 đã đạt đến mức độ hoàn thiện về đặc tính gây bệnh và thích ứng đa vật chủ, trở nên mối nguy cơ gây bệnh rất cao đối với gia cầm và người trong các năm 2004 – 2005. Tuy nhiên, xét về di truyền học và tính kháng nguyên, các chủng H5N1 giai đoạn 1997 - 2002 vẫn mang tính đồng nhất kháng nguyên cùng với chủng nguyên thuỷ A/Gs/Gd/1/96 của Quảng Đông, và bắt đầu phân hóa ở giai đoạn dịch cúm ác liệt xảy ra năm 2003 - 2005. Sự xuất hiện của genotype Z với tính gây bệnh ác liệt trong những năm này ở các nước Đông Nam Á là bằng chứng của sự đột biến “lệch kháng nguyên” của cúm A/H5N1 (Lee và cs, 2007).
Hình 1.7. Sự tiến hóa của các clade virus H5N1 theo thời gian (WHO)
Cuối năm 2005, có nhiều dưới dòng của virus cúm A/H5N1 cùng lúc được hình thành, đó là sự xuất hiện phân dòng Thanh Hải (Qinghai and Qinghai-like sublineage) và phân dòng Phúc Kiến (Fujian and Fujian-like sublineage), tràn ngập châu Á bao gồm Trung Quốc, Hong Kong, Việt Nam, Indonesia, Thái Lan, tràn sang Trung Á, châu Âu và châu Phi có tính gây bệnh cao đối với người. Các chủng thuộc dưới dòng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23 Phúc Kiến có cấu trúc gen NA(N1) không thay đổi nhiều, nhưng gen HA(H5) có motif amino acid ở vùng nối của điểm cắt protease là -RRRK-, giảm mất một Lysine (K) so với các chủng dưới dòng Quảng Đông. Do vậy kể từ 2006 đến nay, nhiều chủng/dòng virus cúm A/H5N1 cùng tồn tại gây bệnh, trong đó có nước ta. Trong các năm 2006 - 2008, tuy bình diện dịch cúm gia cầm không ác liệt như những năm 2003-2005, nhưng do xuất hiện nhiều chủng A/H5N1 có biến động kháng nguyên và độc lực, vấn đề dịch tễ học cúm A/H5N1 có thể đã trở nên phức tạp hơn (Zhao và cs, 2008).
Hình 1.8. Sự phân bố của các clades virus cúm gia cầm trên thế giới từ 2003 - 2009 (Pfeiffer, 2011)
Trong giai đoạn 1996-2001, virus cúm gia cầm độc lực cao H5N1 chủ yếu chỉ lưu hành ở phía Nam Trung Quốc. Giai đoạn này ghi nhận có 4 clade virus A/H5N1 khác nhau là clade 0, clade 3, clade 5 và clade 9, trong đó clade 0 là virus thuỷ tổ A/Goose/Guangdong/96 và những virus khác cùng loại. Qua sơ đồ tiến hoá của virus cúm gia cầm H5N1 độc lực cao (hình 1.7) qua các giai đoạn khác nhau, có thể nhận thấy sự biến đổi liên tục của virus cúm và đặc biệt là có những clade virus tiếp tục tiến hoá và phân loại thành các nhánh phụ như clade 2: Năm 2004 chỉ có 1 lớp clade 2; Đến năm 2005 clade 2 đã tiến hoá thành 5 nhánh phụ thuộc lớp thứ 2 từ clade 2.1 – 2.5, rồi đến năm 2008 chúng lại tiến hoá thành lớp thứ 3. Hiện nay các
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24 chuyên gia quốc tế đang tiếp tục tổng hợp và phân tích sự phát sinh loài của virus cúm và có thể sự phát sinh loài còn đa dạng hơn nữa.
Cho đến nay tất cả 10 clade của virus cúm gia cầm độc lực cao H5N1 đã được phát hiện và phân lập ở khu vực Đông Á có thể cùng hoặc ở các thời điểm khác nhau. Về trình tự gen, hầu hết các virus cúm H5N1 của khu vực Đông Á đều bắt nguồn từ Trung Quốc và Hong Kong và cũng được tìm thấy tại Nhật Bản và Hàn Quốc. Một số clade không phát hiện thấy ở Đông Á là clade 2.1.2 và 2.1.3. Dường như chúng đã tiến hóa ở Indonesia sau khi tổ tiên của chúng xâm nhập từ tỉnh Hồ Nam của Trung Quốc năm 2002-2003. Một số clade cho đến nay chỉ mới phát hiện thấy ở Trung Quốc (ví dụ các clade 4, 6 và 9) trong khi các clade khác có liên quan đến các vụ dịch chính (clade 1 ở khu vực sông Mê Kông từ năm 2004-2005, clade 2.1 ở Indonesia năm 2004, clade 2.2 lan rộng từ châu Á sang châu Âu và châu Phi từ năm 2005, và clade 2.3.4 đã tấn công các nước Việt Nam, Lào và Thái Lan từ năm 2005) đều đã được phân lập ở Trung Quốc trước khi được phát hiện thấy ở những nơi khác (Wang và cs, 2008).
Hình 1.9. Thời gian xuất hiện của các clade H5N1 ở Việt Nam từ 2001-2007 (Wallace và cs, 2007)
Virus A/H5N1 gây nên dịch cúm gia cầm ở Việt Nam từ cuối năm 2003. Tuy nhiên, qua điều tra, người ta đã từng phát hiện thấy virus A/H5N1 có mặt ở chợ gia
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25 cầm sống Việt Nam từ năm 2001 (Nguyen và cs, 2005). Qua nghiên cứu bằng phân tích phát sinh loài các virus cúm đã từng phát hiện ở Việt Nam từ năm 2001-2007, đã phát hiện thấy ít nhất có sáu clade (nhánh) HA khác nhau của virus cúm H5N1 độc lực cao từng xuất hiện và lưu hành ở Việt Nam. Sáu clade HA khác nhau này khi phân tích theo hệ thống danh pháp quốc tế rất tương đồng với các virus A/H5N1 tiền thân đã được xác định trước đó: clade 0 - giống virus HK97(A/HK/483/97); clade 1 - giống virus HK821(A/Dk /HK/821/02); clade 2.3.2 - giống virus E319 (A/Dk/China/E319-2/03); clade 2.3.4 - giống virus FJ584 (A/Ck/Fujian/584/05); clade 3 - giống virus GX22 (A/Dk/GX/22/01); clade 5 - giống virus F1(A/swine/Fujian/F1/01). Sáu clade virus này nằm cùng nhóm với các virus tiền thân được phân lập trước đây tại Trung Quốc và Hồng Công và các virus tiền thân này có thể được coi là tổ tiên của các dòng virus cúm gia cầm độc lực cao xâm nhập vào Việt Nam (Wallace và cs, 2007).
2007 2008 2009 2010
Hình 1.10. Sự phân bố các clade virus H5N1 khác nhau theo không gian
(Màu đỏ: clade 2.3.4; màu xanh lá cây: clade 1;màu xanh dương: clade 7 và màu vàng: clade 2.3.2).
Cho đến năm 2007, có 2 clade virus A/H5N1 chủ yếu lưu hành ở Việt Nam là clade 1 và clade 2.3.4. Trong đó clade 1 đã xuất hiện từ năm 2003/2004 phân bố
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26 trong cả nước, nhưng chủ yếu chỉ còn lưu hành ở phía miền Nam từ năm 2007 cho đến nay; còn clade 2.3.4 xuất hiện từ năm 2007, trước đó đã lưu hành rộng rãi ở phía Nam Trung Quốc và xuất hiện phân bố và lưu hành chủ yếu ở miền Bắc Việt Nam, và đã thay thế cho clade 1 kể từ năm 2007 (Wallace và cs, 2007).
Từ năm 2008-2010, dịch cúm gia cầm H5N1 độc lực cao vẫn tiếp tục xảy ra và hầu hết các mẫu virus A/H5N1 thu thập được trong các chương trình giám sát và các ổ dịch đều được thu thập để phân tích và giám sát sự biến đổi của chúng. Kết quả phân tích gen HA/H5 của virus được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài. Kết quả cho thấy trong giai đoạn 2008-2010, các virus A/H5N1 ở Việt Nam, đặc biệt là ở phía Bắc chủ yếu thuộc về clade 2.3.4, đồng thời các virus trong clade này cũng xuất hiện thành 1 lớp thứ tư thành 4 nhóm (2.3.4.1-2.3.4.4) (Nguyen, 2010).
Từ năm 2009-2010, virus A/H5N1 thuộc clade 2.3.2 cũng đã xuất hiện ở Việt Nam và về mặt di truyền những virus này tương tự các virus A/H5N1 ở chim hoang và gia cầm của nhiều nước ở Đông Âu, Hồng Công, Trung Quốc, Hàn Quốc.
Một số virus H5N1 thuộc clade 7 được phân lập ở biên giới phía Bắc và một số chợ gia cầm sống ở phía Bắc Việt Nam.