3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Khảo sát khả năng sinh trưởng, sinh sản của ngựa bạch tại Thái Nguyên và Lào Cai.
-Địa điểm tiến hành khảo sát, đánh giá: Được thực hiện tại các hộ gia đình nuôi ngựa bạch tại huyện Phú Bình, Sông Công thuộc tỉnh Thái Nguyên và huyện Si Ma Cai tỉnh Lào Cai.
-Nội dung khảo sát:
+ Đo kích thước một số chiều đo (VN, DTC, CV) bằng thước dây. Tính khối lượng ngựa theo công thức: (VN2x DTC)/10800.
(Chỉ số VN, DTC đơn vị tính cm, khối lượng đơn vị tính kg)
Dài thân chéo: Điểm trước của xương bả vai đến điểm cuối xương u ngồi, đo theo đường chéo.
Vòng ngực: Chu vi vòng ngực sát sau xương bả vai
Cao vây: Ngựa đứng vị trí bằng phẳng, đo từ mặt đất đến cao vây. + Khảo sát tỷ lệ sinh sản của đàn ngựa bạch; số ngựa bạch con/tổng số ngựa được sinh ra từ đàn ngựa bạch mẹ chăn thả tự nhiên tại Thái Nguyên và Lào Cai bằng phương pháp phỏng vấn trực tiếp người chăn nuôi trong 3 năm (năm 2011, 2012, 2013) bằng phiếu phỏng vấn (mỗi huyện chọn ngẫu nhiên trên danh sách các hộ có nuôi ngựa bạch sinh sản để khảo sát, đảm bảo đủ số lượng mẫu n=30).
2.2.2.2. Đánh giá phẩm chất tinh dịch của ngựa bạch Việt Nam và ngựa bạch Tây Tạng - Trung Quốc nuôi tại Thái Nguyên
Sử dụng 1 ngựa đực bạch Việt Nam và 1 ngựa đực bạch Tây Tạng có trọng lượng từ 280 - 300 kg, độ tuổi 5 - 6 tuổi, được chăm sóc nuôi dưỡng theo đúng chế độ đực giống khai thác tinh và có chế độ cho ăn duy trì như nhau cho cả quá trình thí nghiệm.
-Chất lượng tinh dịch ngựa được đánh giá tại 3 mùa chính là hè (tháng 6), mùa đông (tháng 11) và mùa xuân (tháng 3).
-Tần suất khai thác: Ngựa được khai thác tinh 3 ngày một lần, và mỗi ngựa sẽ khai thác 5 lần/mùa. Số lần khai thác sẽ được coi như một lần lặp lại.
Đánh giá chất lượng tinh dịch ngựa đực bạch tại 2 tỉnh: mỗi tỉnh chọn 3 ngựa đực ngẫu nhiên để khai thác và đánh giá chất lượng tinh dịch.
* Phương pháp khai thác tinh
+ Chuẩn bị âm đạo giả và dụng cụ khai thác tinh: Lắp âm đạo giả phải đạt các tiêu chuẩn sau:
-Dương vật đưa vào âm đạo giả thẳng và thoải mái như bình thường.
-Lượng tinh xuất ra tương đương như khi trực giao và đảm bảo an toàn.
-Tinh xuất ra hoàn toàn tập trung vào cốc hứng tinh.
-Nhiệt độ trong âm đạo giả của ngựa: Mùa hè 39-400C, mùa đông 410C.
Bảng 2.1: Một số chỉ tiêu kỹ thuật âm đạo giả của ngựa
TT Các chỉ số ĐVT Số lượng
1 Chiều dài âm đạo giả cm 65
2 Chiều dài thân âm đạo giả cm 50
3 Đường kính lòng thân âm đạo giả cm 18
4 Nhiệt độ 0C 39-41
5 Lượng nước trong âm đạo giả. ml 900-950
+ Chuẩn bị ngựa đực, ngựa cái làm giá: Ngựa cái được chọn làm giá phải đang trong thời kỳ động dục. Khối lượng ngựa cái làm giá và ngựa đực không chênh lệch quá lớn (<150kg).
+ Thao tác lấy tinh: Cầm âm đạo giả đưa ngang vai, cánh tay cầm thẳng đứng, để âm đạo giả nghiêng xuống 30- 350. Phải luôn giữ góc độ này trong khi đợi cũng như trong khi lấy tinh. Tư thế cầm âm đạo giả một cách thoải mái, tự nhiên, sao cho đực giống tự thúc dương vật vào âm đạo. Khi đực giống cảm nhận được các kích thích như ôn độ, áp lực và độ nhờn của âm đạo giả sẽ có phản xạ xuất tinh nhanh chóng. Ngựa đực xuất tinh (từ 1 đến 1,5 phút). Khi ngựa đực xuất tinh xong, do phản xạ cương cứng đã hết, dương vật
sẽ trở lại trạng thái bình thường và tự nó tụt ra khỏi âm đạo giả. Kỹ thuật viên nghiêng âm đạo giả về cốc hứng tinh và xả hơi trong âm đạo giả rồi nhanh chóng đưa cốc hứng tinh vào phòng thí nghiệm tiến hành lọc bỏ keo phèn, đánh giá thể tích, hoạt lực và mầu tinh dịch. Sau đó lấy 5ml tinh nguyên làm mẫu để kiểm tra các chỉ tiêu khác. Nếu tinh dịch có hoạt lực (A ≥ 60%) thì được xử lý để đưa vào đông lạnh.
- Phương pháp đánh giá và so sánh phẩm chất tinh dịch của hai giống ngựa: Tinh dịch ngựa được đánh giá bằng các phương pháp thường quy trong phòng thí nghiệm thông qua các chỉ tiêu: Thể tích tinh dịch (V), Mầu sắc tinh dịch, Hoạt lực tinh trùng (A), Nồng độ tinh trùng (C), Áp suất thẩm thấu (ASTT), tỷ lệ kỳ hình (K), độ pH và lượng keo phèn.
* Đánh giá tinh dịch ngựa bằng phương pháp thường quy
- Thể tích tinh dịchV(ml)
Thể tích tinh dịch là lượng tinh thu được trong một lần xuất tinh của con vật lấy tinh. Đó là lượng tinh thu được sau khi đã lọc bỏ toàn bộ keo phèn bằng cách lọc qua lớp vải gạc. Sử dụng dụng cụ đo dung lượng như ống đong, cốc đong có chia độ, đặt thăng bằng ngang tầm mắt. Đọc kết quả theo mặt cong của mặt thoáng tinh dịch.
- Mầu tinh dịch:Quan sát trực quan bằng mắt thường ngay sau khi khai thác tinh.
- Sức hoạt động (hoạt lực) của tinh trùngA(%):
Sức hoạt động của tinh trùng được đánh giá bằng phần trăm số tinh trùng tiến thẳng/tổng số tinh trùng. Dùng đũa thuỷ tinh vô trùng lấy một giọt tinh nguyên nhỏ lên phiến kính trong, sạch đã để ấm 370C. Dùng lamen khô, sạch đậy lên giọt tinh sao cho giọt tinh dịch giàn đều bốn cạnh của lamen. Đưa phiến kính lên soi dưới kính hiển vi với độ phóng đại 200 lần. Tiến hành ước lượng tỷ lệ phần trăm số tinh trùng tiến thẳng so với tổng số tinh trùng có trong vi trường mà ta quan sát được. Việc đánh giá cho điểm được tiến hành
theo thang điểm 10 của Milovanov, công việc tiến hành ngay sau khi khai thác tinh, cụ thể như bảng sau:
Điểm 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 A (%) 95- 100 85- 94 75- 84 65- 74 55- 64 45- 54 35- 44 25- 34 15- 24 5- 14 - Nồng độ tinh trùng C (triệu/ml)
Nồng độ tinh trùng là số lượng tinh trùng có trong một đơn vị thể tích tinh dịch. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng phương pháp xác định nồng độ bằng buồng đếm hồng bạch cầu (buồng đếm Newbower). Đối với tinh dịch ngựa chúng tôi dùng ống hút bạch cầu.
Cách tiến hành: Dùng ống hút bạch cầu khô, sạch hút tinh dịch đến vạch 0,5 sau đó hút tiếp dung dịch pha loãng NaCl 3% (giết chết tinh trùng) đến vạch 11, bịt hai đầu ống pha loãng đảo nhẹ nhàng ống hút, khi tinh dịch đã được pha loãng 20 lần (khi hút không để hiện tượng sủi bọt). Bỏ đi 3-4 giọt ban đầu và dùng lamen khô sạch đậy lên mặt buồng đếm, đặt miệng ống hút bạch cầu vào mép của lá kính ở khu vực buồng đếm để đưa tinh dịch vào buồng đếm. Sau đó đưa buồng đếm lên kính hiển vi với độ phóng đại 200 lần, tiến hành đếm tinh trùng trong 5 ô nằm ở 4 góc và 1 ô nằm giữa đường chéo. Mỗi ô lớn gồm 16 ô nhỏ, mỗi ô nhỏ có thể tích (mm3): (1/20)x(1/20)x(1/10)
Công thức tính: C = n x 106.
C : Nồng độ tinh trùng trong tinh dịch (triệu/ml) n : Là số tinh trùng đếm được ở 5 ô lớn
106 : Là chỉ số quy đổi nồng độ tinh trùng về 1ml tinh nguyên
- Sức kháng của tinh trùng(R)
Sức kháng của tinh trùng được đánh giá bằng phương pháp của Milovanov. Dùng dung dịch NaCl 1% pha loãng các mức khác nhau. Đối với ngựa, chúng tôi sử dụng phương pháp 3 lọ. Cụ thể như sau:
Hút 0,01 ml tinh dịch nguyên cho vào lọ I chứa 5ml dung dịch NaCl 1% , khuấy nhẹ, lắc đều cho tinh dịch hòa tan vào nước muối. Như vậy, ở
lọ I tinh dịch được pha loãng 500 lần. Hút lưu dung dịch ở lọ I cho vào lọ II đã chứa sẵn lưu NaCl l%, lắc nhẹ, khuấy đều. Lúc này, tinh dịch trong lọ II được pha loãng 1000 lần. Lấy 0,5ml dung dịch ở lọ II cho vào lọ III đã có sẵn 0,5 ml NaCl 1%, lắc nhẹ, khuấy đều. Tinh dịch ở lọ III được pha loãng 2000 lần.
Lấy một giọt dung dịch ở lọ III đưa lên kính hiển vi để quan sát, nếu vẫn thấy còn tinh trùng hoạt động thì cho thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% vào, lắc nhẹ, khuấy đều rồi lại đưa lên kính hiển vi quan sát. Cứ tiến hành như vậy cho đến khi không còn tinh trùng hoạt động nữa thì dừng lại. Lúc đó, sức kháng của tinh trùng được tính theo công thức sau:R = ro + rn
Trong đó:
- R: là sức kháng của tinh trùng.
- ro: là độ pha loãng tại thời điểm kiểm tra đầu tiên.
- r: là mức pha loãng sau mỗi lần cho thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1%. - n: là số lần cho thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% đến khi tinh trùng chết hết.
- Tỷ lệ kỳ hình(K): Xác định tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng như sau:
Nhỏ một giọt tinh dịch lên phiến kính sạch, khô (nếu tinh dịch có nồng độ đậm đặc thì pha thêm vài giọt dung dịch NaCl 0,85% hoặc dung dịch Natri xitrat 2,9%). Trộn đều hỗn hợp này bằng đũa thủy tinh, dùng cạnh của một phiến kính khác phiết nhẹ và dàn mỏng giọt tinh dịch (lưu ý thao tác phải nhẹ nhàng, đều tay, tránh chà xát nhiều lần).
Để cho lớp tinh dịch khô trong không khí (tuyệt đối không được làm khô bằng hình thức hơ nóng trên ngọn lửa), sau đó hơ qua phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn để cố định tiêu bản.
Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm xanh methylen (có thể nhuộm đỏ fuchsine, giemsa hoặc tím violet). Đợi vài phút cho thuốc nhuộm thấm vào tinh trùng (mùa hè: 5-7 phút; mùa đông: 10 - 15 phút), rồi đem rửa tiêu bản bằng nước sạch.
Chú ý: Khi rửa nên dùng ống hút hút nước và nhỏ từng giọt vào tiêu bản, tránh giội mạnh. Không được rửa trắng hết tiêu bản, rửa đến khi thấy tiêu bản còn màu nhạt của thuốc nhuộm thì dừng lại. Đợi tiêu bản khô, đem quan sát trên kính hiển vi có độ phóng đại 400-600 lần.
Để đánh giá về tỷ lệ kỳ hình, người ta phân vi trường thành ô để đếm và tính tỷ lệ kỳ hình ít nhất trên 500 tinh trùng đếm được. Tỷ lệ kỳ hình được tính theo công thức: K= (n x 100)/N
Trong đó: K: tỷ lệ kỳ hình, đơn vị tính % n: Số tinh trùng kỳ hình đếm được.
N: Tổng số tinh trùng đếm được (cả kỳ hình và không kỳ hình).
- Áp suất thẩm thấu của tinh dịch (milliosmol/kg): Sử dụng máy đo áp suất thẩm thấu Osmometer của hãng Minitub, các bước tiến hành cụ thể như sau:
Dùng pipet hút lấy 200l tinh dịch nguyên cho vào tube (tinh dịch trước khi đo phải để ở nhiệt độ thường) rồi đưa tube vào máy để đo ASTT. Khi máy hiển thi +1999 thì hạ cần xuống buồng tạo đông, máy tự động chạy từ +1999 đến - 800 thì có tiếng bíp, báo hiệu chuẩn bị kích đông. Khi máy chạy đến -1000 tiến hành kích đông vào ống có tinh nguyên cần đo, động tác kích đông phải nhanh và dứt khoát. Sau 1 phút máy sẽ tự động báo kết quả áp suất thẩm thấu tinh dịch cần đo.
- Độ pH của tinh dịch: Kiểm tra độ pH của tinh dịch giấy đo pH có khoảng cách 0,1 - 0,2. Cách tiến hành cụ thể như sau: Dùng đũa thuỷ tinh lấy một giọt tinh dịch nhỏ lên giấy pH và sau 3 giây thì so sánh màu của giấy với bảng màu chuẩn.
Những lô tinh dịch có hoạt lực ≥70% sẽ được đưa vào xử lý và đông lạnh trong thí nghiệm.
2.2.2.3. Xác định thời điểm truyền tinh thích hợp trong thời gian động dục
- Ngựa cái được đưa thí nghiệm: được lựa chọn trong độ tuổi >4 tuổi, có khối lượng trên 160 kg (sau khi đã sinh được một lứa) tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển chăn nuôi miền núi - Viện Chăn nuôi.
-Số lượng ngựa đưa vào thí nghiệm 15 con (mỗi giai đoạn là 5 con).
- Xác định động dục ở ngựa bằng đực thí tình (dắt ngựa đực qua đàn vào 8 giờ sáng hàng ngày).
-Tinh được dẫn phối 1 lần vào 8h sáng ngày thứ 5, thứ 6 và thứ 7 của chu kỳ động dục và thử nghiệm ở mùa xuân.
- Kỹ thuật dẫn tinh cho ngựa bằng tinh cọng rạ
Tinh cọng rạ được sử dụng thí nghiệm là tinh cọng rạ tiêu chuẩn. Trước khi đưa vào thí nghiệm tiến hành lấy mẫu ngẫu nhiên 05 cọng đem giải đông để kiểm tra chất lượng.
Tinh cọng rạ tiêu chuẩn phải đạt các chỉ số sau khi giải đông như sau: + Thể tích cọng rạ (V): 0.5ml/cọng
+ Hoạt lực sau giải đông (A)35% + Tổng số tinh trùng25 triệu/cọng rạ.
Phương pháp dẫn tinh cọng rạ:
+ Chuẩn bị nước giải đông ở trong cốc hoặc trong bình giải đông có nhiệt độ 37,50C.
+ Thả tinh cọng rạ vào bình giải đông có sẵn nước ấm ở nhiệt độ 37,50C.
+Dùng pinch gắp cọng rạ khỏi bình giải đông, lau khô.
+ Cầm cọng rạ có đầu hàn lên trên, vẩy nhẹ vài lần để điều chỉnh phần không khí trong cọng rạ và dồn tinh dịch xuống.
+ Dùng hộp cắt chuyên dụng cắt đầu hàn của cọng rạ, cắt nhanh và vuông góc, cắt khoảng 0,5 cm.
Dẫn tinh: Dùng tinh cọng rạ (có hoạt lực tinh trùng sau giải đông,
A35%) dẫn tinh cho ngựa cái. Vị trí dẫn tinh ở thân sừng tử cung bên có nang trứng chín và rụng.
- Kiểm tra kết quả thụ thai bằng phương pháp kiểm tra qua trực tràng sau 21-25 ngày sau khi truyền tinh.
2.2.2.4. Xác định ảnh hưởng của một số phương pháp truyền tinh nhân tạo đến tỷ lệ thụ thai ở ngựa bạch
a. Xác định ảnh hưởng của phương pháp truyền tinh đơn và truyền tinh kép đến tỷ lệ thụ thai.
- Ngựa cái được chọn theo tiêu chuẩn như thí nghiệm 2.2.2.3. Mỗi lô thí nghiệm chọn 5 ngựa cái.
-Đối với lô 1 (truyền tinh đơn): Ngựa được cho truyền tinh vào 8h sáng 1 lần sử dụng một cọng tinh để phối.
-Đối với lô 2 (truyền tinh kép): Ngựa được cho truyền tinh vào 8h sáng 1 lần sử dụng 2 cọng tinh để phối.
- Kỹ thuật dẫn tinh và phương pháp theo dõi tỷ lệ thụ thai như thí nghiệm 2.2.2.3
b. Xác định ảnh hưởng của phương pháp phối lặp lại đến tỷ lệ thụ thai - Ngựa cái được chọn theo tiêu chuẩn như thí nghiệm 2.2.2.3. Mỗi lô thí nghiệm chọn 5 ngựa cái.
-Đối với lô 1 (truyền tinh đơn): Ngựa được truyền tinh vào 8h sáng 1 lần sử dụng một cọng tinh để phối.
- Đối với lô 2 (truyền tinh kép - lặp lại): Ngựa được truyền tinh vào 8h sáng 1 lần, lặp lại lần 2 vào 16h buổi chiều (mỗi lần sử dụng 01 cọng tinh để phối).
- Kỹ thuật dẫn tinh và phương pháp theo dõi tỷ lệ truyền thai như thí nghiệm 2.2.2.3.
2.2.2.5. Ứng dụng kết quả thí nghiệm để truyền tinh nhân tạo cho ngựa bạch ở 2 tỉnh Thái Nguyên và Lào Cai
- Tuyển chọn ngựa cái nền để đưa vào thí nghiệm: Mỗi tỉnh chọn 10 ngựa cái nền theo tiêu chuẩn để tiến hành theo dõi dẫn tinh bằng tinh cọng rạ. Tiêu chuẩn ngựa đưa vào thí nghiệm:
+ Tuổi phối giống lần đầu: >4 tuổi (sau khi đã sinh 01 lứa). + Khối lượng phối giống lần đầu: >160 kg.
-Tinh cọng rạ dùng để truyền tinh: Sử dụng tinh cọng rạ đạt tiêu chuẩn.
-Thời gian truyền tinh trong chu kỳ động dục: Sử dụng kết quả của thí nghiệm ở phần 2.2.2.3.
- Phương pháp truyền tinh và đánh giá kết quả: Sử dụng phương pháp của thí nghiệm ở phần 2.2.2.4.