2. Chƣơng 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.3.3.1. Phương pháp đánh giá bột và hạt
- Phương pháp đánh giá phân bố kích thước tiểu phân
Cân một khối lượng nhất định của bột (hạt) cho lên các rây có kích thước khác nhau. Tiến hành rung lắc để bột (hạt) qua các lớp rây, cân lại khối lượng còn lại trên mặt rây để đánh giá phân bố kích thước tiểu phân.
- Phương pháp xác định tỷ trọng [26] MH, HPMC, Avicel PH101
(Nghiền, rây qua rây 200)
Rây 1000 Cắt tạo hạt Sấy se Nhào ẩm Dập viên Sấy khô
Máy sấy tầng sôi
Sửa hạt Magnesi stearat Hàm ẩm 2- 3% Cân Trộn bột kép Máy trộn cao tốc Dd PVP 10%/Ethanol 96% Trộn cốm khô
27
Cân m (g) bột (hạt) cho vào ống đong 50 ml, đọc thể tích khối bột (Vt). Đặt ống đong lên máy đo tỷ trọng biểu kiến ERWEKA SVM với các thông số cài đặt: tần số gõ 100 lần/phút, gõ 300 lần. Đọc thể tích khối bột sau khi gõ (Vbk)
Kết quả: Tỷ trọng thô (dt), tỷ trọng biểu kiến (dbk)được tính theo công thức: dt = dbk =
Chỉ số Car (C) được xác định theo công thức [26]: C = x 100
Chỉ số C biểu thị khả năng trơn chảy của bột (hạt). C càng lớn khả năng chảy của bột (hạt) càng kém:
- C 15 : trơn chảy tốt.
- C trong khoảng 16 – 20 : trơn chảy tương đối tốt. - C trong khoảng 21 – 25 : có thể chảy được.
- C 26 : trơn chảy kém. Chỉ số Hausner được xác định theo công thức
H =
Chỉ số Hausner càng gần 1 thì khả năng chịu nén của bột càng tăng. - Phương pháp xác định độ trơn chảy của hạt:
Độ trơn chảy của hạt được xác định theo phương pháp đo khối lượng bột chảy trong một đơn vị thời gian bằng máy đo độ trơn chảy ERWEKA GWF với đường kính lỗ phễu 9 mm. Tốc độ chảy được tính theo công thức:
V = tgα Trong đó : v là tốc độ chảy (g/giây)
α là góc giữa đường thẳng biểu diễn sự phụ thuộc của khối lượng hạt chảy theo thời gian và trục hoành (trục thời gian).
- Phương pháp xác định độ ẩm của hạt:
Độ ẩm của hạt được xác định theo phương pháp xác định mất khối lượng do làm khô (theo phụ lục 9.6 DĐVN IV) [4] trên cân xác định độ ẩm nhanh Sartorius MA 30. Cân khoảng 1g bột (hạt) cho vào đĩa cân, đặt nhiệt độ 1050C, theo dõi và đọc kết quả.
- Phương pháp lấy mẫu kiểm tra độ đồng đều của bột và hạt:
Trong quá trình trộn bột kép, các mẫu được lấy ra tại 5 vị trí của thiết bị trộn vào mỗi thời điểm khác nhau để xác định độ đồng đều về hàm lượng dược chất
28
trong khối bột (hạt). Các vị trí lấy mẫu gồm 4 góc và ở tâm của thiết bị (Sơ đồ 2.3). Mỗi mẫu lấy khoảng 5g bột (hạt).
Sơ đồ 2.3. Các vị trí lấy mẫu định lượng 2.3.3.2. Phương pháp đánh giá viên
- Phương pháp đo độ cứng của viên:
Thiết bị: Máy đo độ cứng Pharmatest
Tiến hành: Đặt dọc viên caplet theo trục của máy, máy sẽ tác động vào trục của viên một lực đến khi vỡ viên. Ghi lại lực gây vỡ viên.
- Phương pháp đo độ mài mòn của viên:
Thiết bị: Máy đo độ mài mòn Pharmatest PTFE
Tiến hành: Cân chính xác 20 viên (m1) vào trống quay, quay 100 vòng với tốc độ 25 vòng/phút. Lấy viên ra, làm sạch bụi, cân khối lượng viên còn lại (m2)
Tính độ mài mòn X% theo công thức: X% = x 100%
- Phương pháp đo bề dày của viên:
Sử dụng thước kẹp Mitutoyo 530 – 118 có độ chia 0,05 mm để đo bề dày viên.
- Phương pháp đánh giá độ đồng đều khối lượng:
Tiến hành theo phụ lục 11.3 DĐVN IV áp dụng cho viên nén [4]. - Phương pháp định lượng hàm lượng dược chất bằng UV-Vis:
Định lượng đo quang tại bước sóng 233 nm. So sánh mật độ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn, từ đó xác định hàm lượng dược chất trong viên.
Tiến hành:
Mẫu thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 0,1 g metformin hydroclorid, siêu âm với 70 ml nước trong 15 phút, thêm nước vừa đủ 100,0 ml và lắc đều. Lọc, bỏ 20 ml dịch lọc đầu. Pha loãng 10,0 ml dịch lọc này thành 100,0 ml
29
bằng nước, lắc đều. Tiếp tục pha loãng 10,0 ml dung dịch thu được thành 100,0 ml bằng nước.
Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,1 g metformin, hòa tan và pha loãng bằng nước đến nồng độ khoảng 10 µg/ml.
Hàm lượng dược chất trong viên được tính theo công thức: %MH = x 100%
Hàm lượng dược chất trong viên so với hàm lượng ghi trên nhãn: %MH’ =
Trong đó: %MH: Hàm lượng % metformin trong viên
%MH’: Hàm lượng % metformin trong viên so với hàm lượng ghi trên nhãn
Dt : mật độ quang của dung dịch thử Dc : Mật độ quang của dung dịch chuẩn
mt : Khối lượng của dược chất trong mẫu thử (g) mc : Khối lượng dược chất trong mẫu chuẩn (g) mtb: Khối lượng trung bình viên
- Phương pháp định lượng hàm lượng dược chất trong viên bằng phương pháp HPLC:
Tiến hành theo Dược điển Mỹ (USP 35, chuyên luận: viên nén metformin hydrochlorid giải phóng kéo dài) [53].
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Alliance Waters 2695D, autosampler, detector UV.
- Chất chuẩn: Metformin HCl 99,84%
- Cột µBondapak C18 3,9 x 30 cm, kích thước hạt 10 µm - Nhiệt độ cột 30ºC
- Tốc độ dòng 1 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu 10 µl - Detector UV đo tại 218 nm
- Pha động: Dung dịch đệm và acetonitril theo tỷ lệ 90:10 (v/v)
Cách pha dung dịch đệm: Hòa tan 1,0 g muối natri của acid 1-heptan sulfonic và 1,0 g natri clorid trong 1800 ml nước, điều chỉnh pH đến 3,85 bằng dung dịch acid phosphoric 0,05M. Thêm nước tới đủ thể tích 2000 ml.
30
Dung dịch đệm và acetonitril được đem đuổi khí bằng siêu âm trước khi sử dụng.
- Pha dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 12,5 mg chất chuẩn metformin. Hòa tan trong 70 ml dung dịch acetonitril trong nước 1,25% (v/v). Thêm dung dịch trên vào tới đủ thể tích 100 ml. Hút 10 ml dung dịch trên đem pha loãng thành 100 ml, được dung dịch chuẩn có nồng độ 12,5 µg/ml.
- Dung dịch thử: nghiền 10 viên metformin thành bột, cân chính xác khối lượng bột tương ứng với khối lượng trung bình của viên cho vào bình định mức 500 ml, thêm khoảng 300 ml dung dịch acetonitril 10% vào, ngâm và siêu âm khoảng 10 phút cho mẫu đồng nhất sau đó thêm dung dịch acetonitril 10% cho đủ 500 ml. Lọc qua màng lọc 0,45 µm, bỏ 3 ml dịch lọc ban đầu, lấy chính xác 25 ml dịch lọc pha loãng thành 200 ml. Hút 10 ml pha loãng tiếp thành 100 ml.
Hàm lượng dược chất trong viên được tính theo công thức: %MH = x x 100
Trong đó: St: diện tích pick mẫu thử Sc: diện tích pick mẫu chuẩn
Cc: Nồng độ dung dịch chuẩn (mg/ml) Ct: Nồng độ dung dịch thử (mg/ml) - Phương pháp thử độ hòa tan:
Tiến hành thử độ hòa tan theo chuyên luận thử độ hòa tan viên nén metformin giải phóng kéo dài của dược điển Mỹ USP 35 Test 10 [53].
Pha môi trường: dung dịch đệm phosphat 0,05M (hòa tan 6,8 g KH2PO4 trong 250 ml nước, thêm 77 ml dung dịch NaOH 0,2N và 500 ml nước, điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 2N hoặc HCl 2N đến pH 6,8 và thêm nước đến đủ 1000 ml.
Thiết bị: cánh khuấy
Tốc độ khấy: 100 vòng/phút
Thời điểm lấy mẫu: mỗi giờ từ 1 đến 12 giờ.
Pha dung dịch chuẩn: MH chuẩn được pha trong môi trường đệm phosphat với nồng độ: 5 µg/ml, sau đó để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ. (Cân chính xác khoảng 50 mg metformin cho vào bình định mức 100 ml, thêm môi trường vừa đủ 100 ml. Đem dung dịch đi siêu âm khoảng 15 phút. Sau đó hút chính xác 1 ml
31
cho vào bình định mức 100 ml. Thêm môi trường vừa đủ 100 ml. Lọc dung dịch thu được qua màng lọc 0.45 µm).
Dung dịch thử: Tại các thời điểm định lấy mẫu hút 10 ml dung dịch hòa tan và bù lại 10 ml môi trường đệm. Đem ly tâm với tốc độ 2500 vòng/phút trong 10 phút. Pha loãng dung dịch với môi trường để đạt được nồng độ khoảng 5 µg/ml.
Đo quang phổ tử ngoại ở bước sóng 233 nm. Mẫu trắng: dung dịch đệm phosphat pH 6,8
Nồng độ MH (mg/ml) trong dung dịch tại thời điểm bất kì: Ci = (AU/AS) x CS
Trong đó AU: Độ hấp thụ của dung dịch thử AS: Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn CS: nồng độ của dung dịch chuẩn Ci: nồng độ dung dịch thử
% MH giải phóng tại lần hút mẫu thứ n được tính theo công thức: Qn = [Cn x (V-(n-1)Vs) + (C1 + C2 + ...+ Cn-1) x Vs] x 100/L Trong đó:
Qn: Hàm lượng %MH giải phóng tại lần hút mẫu thứ n n : Số lần hút mẫu
Cn: Nồng độ dung dịch mẫu thử tại lần hút mẫu thứ n V: Thể tích môi trường ban đầu (1000 ml)
Vs: Thể tích mẫu thử (10 ml)
L: khối lượng MH trong viên (500 mg)
Yêu cầu: % MH giải phóng theo thời gian [53]:
1h: 25 – 45% 3h: 50 – 70% 10h: ≥ 85%
2.3.4. Phương pháp phân tích mô hình động học giải phóng dược chất
Quá trình giải phóng dược chất từ viên được phân tích theo các mô hình động học giải phóng: mô hình bậc không, bậc một, Weilbull, Hisxon–Crowell, Higuchi, Hopfenberg và Korsmeyer–Peppas với sự trợ giúp của phần mềm Mathcad 14. Hệ số tương đồng R2 của mô hình nào càng gần 1 và giá trị AIC càng nhỏ thì quá trình giải phóng dược chất từ viên càng phù hợp với mô hình đó.
32
2.3.5. Phương pháp đánh giá độ ổn định của viên
Viên nén metformin giải phóng kéo dài được ép vỉ nhôm và tiến hành bảo quản ở điều kiện thực (nhiệt độ phòng) và điều kiện lão hóa cấp tốc (40±2 0C, RH 75±5%) trong thời gian 3 tháng [15].
Tiến hành đánh giá về hình thức cảm quan, hàm lượng dược chất còn lại và khả năng kiểm soát giải phóng dược chất từ viên.
2.3.6. Phương pháp đánh giá sự tương đồng của hai đồ thị giải phóng dược chất
Để so sánh quá trình giải phóng dược chất từ mẫu thử so với viên đối chiếu sử dụng hệ số tương đồng f2 [38]:
f2 (%) = 50 x log [(1 + Rt –Tt)2)-0,5 x 100] Trong đó: n: Số điểm lấy mẫu
Rt: phần trăm MH giải phóng tại thời điểm t của mẫu đối chiếu Tt: phần trăm MH giải phóng tại thời điểm t của mẫu thử
Mỗi công thức viên được thử hòa tan 3 lần và lấy kết quả trung bình. Hai đồ thị được coi là tương đương nếu 50≤ f2 ≤ 100, f2 càng lớn thì hai đồ thị càng giống nhau.
2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu thống kê
- Các tính toán: Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn SD, độ lệch chuẩn tương đối RSD, phương trình hồi quy và hệ số tương quan được thực hiện bằng chương trình phần mềm Excel.
- Mô hình động học giải phóng dược chất được xác định bằng phần mềm Mathcad 14.
33
3. Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Thẩm định một số tiêu chí trong phƣơng pháp định lƣợng 3.1. Thẩm định một số tiêu chí trong phƣơng pháp định lƣợng
3.1.1. Phương pháp UV
3.1.1.1. Độ đặc hiệu
- Tiến hành quét phổ UV-Vis dung dịch tá dược với đường nền là dung dịch đệm phosphat pH 6,8 từ bước sóng 200 – 400nm cho thấy không có cực đại hấp thụ ở bước sóng 233 nm (phụ lục 2.1)
- Tiến hành quét phổ UV-Vis dung dịch metformin nồng độ khoảng 5 µg/ml và dung dịch metformin pha trong hỗn hợp tá dược (HPMC K100M, PVP K90, Avicel PH 101, magnesi stearat) với đường nền là dung dịch đệm phosphat pH 6,8 đều cho cực đại hấp thụ ở bước sóng 233nm (phụ lục 2.2, 2.3).
- Như vậy tại bước sóng 233nm tá dược không ảnh hưởng tới khả năng hấp thụ quang của metformin. Do đó có thể tiến hành đo quang tại bước sóng 233nm để định lượng hàm lượng metformin trong các mẫu định lượng và thử nghiệm hòa tan.
3.1.1.2. Độ tuyến tính
Đo mật độ quang của dãy dung dịch metformin có nồng độ lần lượt là 0.5 µg/ml, 1 µg/ml, 2 µg/ml, 3 µg/ml, 4 µg/ml, 5 µg/ml, 6 µg/ml trong dung dịch đệm phosphat pH 6,8 tại bước sóng 233 nm. Kết quả được trình bày như bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Nồng độ dung dịch metformin và mật độ quang tương ứng
Nồng độ (µg/ml) 0.5 1 2 3 4 5 6 Mật độ quang D 0,046 0,093 0,169 0,264 0,352 0,441 0,529
Hình 3.1. Mối tương quan giữa nồng độ dung dịch metformin và mật độ quang D
y = 0.087x + 0.000 R² = 0.999 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 2 4 6 8 Đ ộ h ấ p t h ụ D Nồng độ dung dịch(µg/ml)
34
Nhận xét: Từ kết quả trên ta thấy mật độ quang D và nồng độ dung dịch metformin trong dung dịch đệm phosphat pH 6,8 trong khoảng nồng độ 0,5 µg/ml đến 6 µg/ml có mối quan hệ tuyến tính với hệ số tương quan R2 là 0,999.
3.1.1.3. Độ đúng
Độ đúng của phương pháp được xác định dưới sự có mặt của các tá dược (HPMC K100M, PVP K90, Avicel PH 101, magnesi sterat) được tiến hành tại các nồng độ 80%, 100% và 120% nồng độ định lượng C0 (5 µg/ml). So sánh giá trị thực
(Ctìm thấy) và giá trị lý thuyết (Clý thuyết) để xác định độ đúng của phương pháp. Kết
quả thu được như trong bảng 3.2:
Bảng 3.2. Độ đúng của phương pháp định lượng UV
STT 80% C0 100% C0 120% C0 Clý thuyết (µg/ml) Ctìm thấy (µg/ml) Độ đúng (%) Clý thuyết (µg/ml) Ctìm thấy (µg/ml) Độ đúng (%) Clý thuyết (µg/ml) Ctìm thấy (µg/ml) Độ đúng (%) 1 4,05 4,17 102,97 5,15 5,06 98,25 6,03 6,09 101,00 2 4,09 4,13 100,98 4,95 5,02 101,41 5,91 6,08 102,88 3 3,98 4,07 102,26 5,08 5,16 101,57 5,92 5,89 99,49 4 3,89 3,95 101,54 5,04 4,93 97,82 6,01 5,95 99,00 5 4,02 3,97 98,76 4,86 4,92 101,23 5,98 6,08 101,67 TB 101,30 100,06 101,81 SD 1,61 1,86 1,6 RSD % 1,59 1,86 1,57
Kết quả cho thấy ở tất cả các nồng độ đều có tỷ lệ tìm lại cao (97,82 – 102,97%) và có giá trị RSD < 2%. Độ đúng trung bình tổng là 100,72% với RSD = 1,67%). Như vậy phương pháp đo quang có độ đúng tương đối tốt.
3.1.1.4. Độ chính xác
Độ chính xác của phương pháp UV được xác định dưới sự có mặt của các tá dược (HPMC K100M, PVP K90, Avicel PH 101, magnesi stearat) được tiến hành trong ngày và khác ngày tại các nồng độ 80%, 100% và 120% so với nồng độ định lượng C0 (5 µg/ml).
35
Bảng 3.3. Độ hấp thụ trong ngày và khác ngày của phương pháp định lượng UV
Nhận xét: Từ bảng 3.3 nhận thấy phương pháp UV có độ lặp lại trong ngày cũng như khác ngày cao với RSD < 2%.
Như vậy qua đánh giá một số tiêu chí cho thấy phương pháp định lượng UV có thể định lượng được tương đối chính xác nồng độ MH trong các mẫu thử khi có mặt của tá dược trong dung dịch.
3.1.2. Đánh giá sự tương thích của hệ thống HPLC theo phương pháp định
lượng trong USP 35
Tiêm lặp lại 6 lần vào hệ thống HPLC dung dịch chuẩn metformin trong pha động với nồng độ là 12,5 µg/ml. Kết quả phân tích, được trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký
STT Metformin hydroclorid tR (phút) Diện tích (mAU.s) 1 2,424 359951 2 2,425 360001 3 2,425 358535 4 2,427 358100 5 2,425 357584 6 2,425 360251 Trung bình 2,425 359070 SD 0,001 1138 RSD (%) 0,041 0,317 STT
DTrong ngày DKhác ngày
80% C0 100% C0 120% C0 80% C0 100% C0 120% C0 Lần 1 0,3582 0,4453 0,5213 0,3623 0,4365 0,5245 Lần 2 0,3560 0,4517 0,5284 0,3617 0,4354 0,5312 Lần 3 0,3611 0,4386 0,5328 0,3658 0,4418 0,5352 Lần 4 0,3512 0,4365 0,5334 0,3524 0,4385 0,5254 Lần 5 0,3598 0,4359 0,5392 0,3639 0,4498 0,5397 Lần 6 0,3682 0,4434 0,5424 0,3732 0,4517 0,5364 TB 0,3591 0,4419 0,5329 0,3632 0,4423 0,5321 SD 0,0057 0,0061 0,0076 0,0067 0,0069 0,0062 RSD (%) 1,58 1,38 1,42 1,85 1,57 1,16
36
Kết quả ở bảng 3.4 nhận thấy giá trị RSD của thời gian lưu, diện tích pic của MH đều nhỏ hơn 2%. Như vậy hệ thống HPLC ổn định và phù hợp để tiến hành định lượng dược chất trong viên MH GPKD.
3.2. Xây dựng công thức cho viên caplet
Công thức viên được lựa chọn trong tài liệu [5] có thành phần như sau:
Bảng 3.5. Công thức bào chế viên lựa chọn
Thành phần Khối lượng (mg) Meformin hydroclorid 500 HPMC K100M 279 PVP K90 45 Magnesi stearat 9 Avicel PH101 67 Tổng 900
Ở nghiên cứu trước viên nén MH giải phóng kéo dài được bào chế theo