- Hỗn hợp vi khuẩ nS bị đun chết trộn với vi khuẩ nR sống đem tiêm cho chuộ t chuột
b) Trong đoạn tương đồng không đánh dấu, trao đổi chéo ở đoạn giữa gen và tâm
20.8.4.1. Vit ảo Chlamydomonas reinhard
Loài vi tảo được sử dụng sớm nhất và nghiên cứu di truyền chi tiết hơn cả là Chlamydomonas reinhardii (hình 20.43), nó có chu trình sinh sản hữu tính. Ưu thế của đối tượng này là có thể tiến hành lai và phân tíchbộ bốn
không xếp theo thứ tự.
Hình 20.64- Cấu trúc và hình thái Chlamydomonas
a) Đặc điểm sinh học
Vi tảo Chl. reihardii có thể nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng dịch thể hay môi trường thạch đặc như các vi sinh vật khác. Các tế bào mọc thành khuẩn lạc trên môi trường thạch. Vi tảo có thể nuôi ngoài sáng (ánh sáng mặt trời hay đèn huỳnh quang thông dụng) hoặc trong tối (phải bổ sung axetat natri hoặc glucoz).. Trong điều kiện thí nghiệm, có thể nuôi các tế bào Chl. reinhardii để nhận các tế bào đồng nhất (synchronous culture), khi thay đổi chu kì 12 giờ sáng 12 giờ tối đều đặn. Theo dõi tổng hợp ADN cho thấy ADN của lục lạp tổng hợp vào giờ thứ 5-6 ngoài sáng, còn ADN của nhân tổng hợp khoảng giờ thứ 16 - 18, sau đó chia tế bào đồng loạt.
Chu trình sống của Chl. reihardii được nêu trên hình 20.65. Bình thường các tế bào dinh dưỡng tồn tại lâu dài ở trạng thái đơn bội n với 2 kiểu bắt cặp khác nhau mt+ (mating typ) và mt– tương đương với 2 giới tính, mà về hình thái thì rất giống nhau. Các tế bào dinh dưỡng nay có thể tạo nang bào tử kín hay túi bào tử (sporangia) và sinh sản vô tính tạo ra các tế bào con đơn bội.
Khi được kích thích, như nuôi trên môi trường dinh dưỡng thiếu nitơ, các tế bào dinh dưỡng chuyển thành các động bào tử (zoospores) mt+ và mt–. Sự kết hợp và phối hợp 2 loại tế bào khác kiểu bắt cặp mt+ và mt– sẽ tạo ra
hợp tử lưỡng bội 2n. Hợp tử này gặp điều kiện thuận lợi sẽ thực hiện giảm Roi
phân tạo ra 4 tế bào đơn bội n, mà chúng sinh sản vô tính tạo ra số lượng lớn tế bào dinh dưỡng.
Ở Chl. reinhardii có thể nhận được nhiều đột biến khác nhau, đặc biệt là các
đột biến sắc tố khác với màu khuẩn lạc xanh lục của dạng hoang dại như màu cam, vàng, trắng kem, xanh lợt,…thuận lợi cho nghiên cứu di truyền lục lạp và quang hợp.
Hình 20.65- Chu trình sống của vi tảo Chlamydomonas reinhardii
b)Các gen của lục lạp ởChlamydomonas reinhardii
Sự di truyền của lục lạp được nghiên cứu chi tiết hơn cả ở vi tảo
Chlamydomonas reinhardii. Tế bào của vi tảo này có một lục lạp lớn với đường kính trung bình 5 micrometer chứa 50 đến 80 bản sao của phân tử ADN vòng tròn dài 196 kb.
Bảng 20.8- Các đột biến trong nhóm liên kết gen của lục lạp
Các gen Kiểu hình đột biến
2.tm1-tm3 – tm9 2.Không mọc được ở 350C.
3.tm2 3.Mọc ở 35oC khi có streptomycin.
4.til1– til5 4.Hình thành khuẩn lạc nhỏở tất cả các loại MT.
5.ery1 5.Kháng erytromycin ở nồng độ 50 µ g/ml. 6.kan1 6.Kháng kanamycin ở 50µ g/ml. 7.spc1 7.Kháng spectinomycin ở 50µ g/ml. 8.spi1-spi5 8.Kháng spiramycin ở 50µ g/ml. 9.ole1-ole3 9.Kháng oleodomycin ở 50µ g/ml. 10.car-1 10.Kháng carbamycin ở 50µ g/ml. 11.elé 1 11.Kháng eleosin ở 50µ g/ml.
12.ery3-ery1 12.Kháng erythromycin, carbamycin, oleandomycin spyramycin ở nồng độ tùy các chất nêu trên.
13.sm2-sm5 13.Kháng streptomycin ở nồng độ 500µ g/ml.
14.sm3 14.Kháng streptomycin ở nồng độ 50µ g/ml.
15.sm4 15.Phụ thuộc streptomycin.
(phải có streptomycin mới mọc được).
Một số đột biến kháng streptomycine đã được thu nhận và nhận thấy ở một số có sự di truyền trong nhân, số khác có sự di truyền ngoài nhân.
Theo Sager (1975), ởChlamydomonas reinhardii có các đột biến trong nhóm liên kết gen của lục lạp như sau (bảng 20.8):
– Mất khả năng quang hợp; để mọc được ngoài ánh sáng và trong tối cần bổ sung đường khử là axetat.
– Nhạy cảm với nhiệt độ cao hoặc thấp.
– Tính đề kháng với thuốc kháng sinh hoặc có nhu cầu được cung cấp thuốc kháng sinh.
Tất cả các đột biến trên có sự di truyền theo một cha mẹ (uniparental inheritance), có kiểu bắt cặp mt+ (có thể coi là dòng mẹ). Điều này liên quan đến sự hình thành lục lạp trong hợp tử, bằng cách nào đó chỉ nhận ADN từ
lục lạp mt+.
Năm 1954, R.Sager đã nghiên cứu các đột biến kháng streptomycin ở
Chlamydomonas reinhardii từ dạng hoang dại nhạy cảm sm-s. Một số đột biến sm–r có sự di truyền nhiễm sắc thể với sự phân li 1:1. Tuy nhiên, một số đột biến có sự di truyền khác thường như sau:
sm–r mt+ × sm–s mt–→→→→ tất cả thế hệ con đều sm–r với tỉ lệ1mt+: 1mt– sm–s mt+ × sm–r mt–→→→→ tất cả thế hệ con đều sm–s với tỉ lệ1mt+: 1mt–
Như vậy, ở đây khi có sự hoán đổi cha mẹ trong lai, thế hệ con đều có kiểu hình streptomycin của mt+. Sự truyền thụ tính trạng này được gọi là sự di truyền theo một cha mẹ (uniparental inheritance). Sager coi mt+ như dòng mẹ và trường hợp trên giống như di truyền theo dòng mẹ. Các gen kiểu bắt cặp mt có tỉ lệ phân li của gen trong nhân là 1: 1.
Ở C. reinhardii, streptomycin có tác động gây đột biến. Các đột biến nhận được do tác động bởi streptomycin đều có sự di truyền theo một cha mẹ (bảng 20.9).
Đặc biệt đột biến smt4 còn gọi là smd (streptomycin – dependent) chỉ mọc khi trong môi trường nuôi có streptomycin.
Sager đã tiến hành thí nghiệm chứng minh sự di truyền của các gen nêu trên liên quan đến cpADN của lục lạp. Các kĩ thuật dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu N15 và li tâm trên thang nồng độ CsCl được sử dụng. CpADN của hai cha mẹđem lai được đánh dấu khác nhau: một dạng mang N14 nhẹ, dạng kia mang N15 nặng. Tỉ trọng của cpADN từ các tế bào cha mẹ như vậy tương ứng với 1,69 và 1,70. Nhờ li tâm trên thang nồng độ CsCl có độ nhạy cao nên có thể ghi nhận sự khác nhau giữa các dòng cha mẹ và dòng lai (bảng 20.9).
Bảng 20.9- Tỷ trọng của cpADN ở thế hệ con từ các tổ hợp lai Chlamydomonas Tổ hợp lai Tỉ trọng của cpADN của hợp tử (g/cm3 ) N14 mt+ x N14 mt– 1,69 N15 mt + x N15mt– 1,70 N15 mt + x N14mt– 1,70 N14 mt + x N15mt– 1,69
Trên thực tế, các kết quả này cho thấy cpADN của cha mẹ mt– bị mất hoặc bị phân hủy như thế nào đó. Sự mất đó kèm theo mất các đột biến (ví dụ: sm) trên cha mẹmt–.
Các thí nghiệm khác theo nguyên tắc tương tự được tiến hành với việc sử dụng các đoạn RFLP. Mỗi dòng cha mẹ có cpADN với RFLP khác nhau. Kết quả cũng cho thấy cpADN ở thế hệ con nhận được từ dòng mt+.
Như vậy, có thể kết luận rằng cpADN của Chlamydomonas được truyền thụ từ một dòng cha mẹ (uniparental) và các gen của nó cũng có sự truyền thụ tương tự.
c) Lập bản đồ các gen của Chlamydomonas
Trong tổ hợp lai mt+sm–r × mt–sm–s có khoảng 0,1% thế hệ hợp tử con mang cả sm–r và sm–s. Các hợp tử như vậy là hợp tử hai cha mẹ
(biparental zygote) và được gọi là cytohet (cytoplasmically heterozygote). Tần số các cytohet có thể tăng lên 40–100% ở thế hệ hợp tử con nếu mt+
được chiếu tia tử ngoại trước khi lai.
Ở Chlamydomonas, các cytohet hay hợp tử hai cha mẹ được dùng làm điểm xuất phát cho tất cả các nghiên cứu về sự phân li và tái tổ hợp của các gen lục lạp. Trên cơ sở nhiều tổ hợp lai, R.Sager đã nêu ra bản đồ vòng tròn của cpADN với các gen tương ứng.