Chỳng tụi tiếp tục tiến hành giải trỡnh tự gen mó húa 16S rARN. Kết quả giải trỡnh tự gen 16S rARN được so sỏnh với cỏc trỡnh tự gen 16S rARN trong ngõn hàng gen quốc tế dựa vào phần mềm Clustal X. Trờn cơ sở đú, chỳng tụi xõy dựng cõy chủng loại phỏt sinh dựa vào phần mềm njplot
Trỡnh tự gen mó húa 16S rARN của chủng B11.11 tương đồng 99,9 % (1399/1400 bp) với đoạn gen 16S rARN của vi khuẩn Bacillus licheniformis_X68416; tương đồng 99,6 % (1394/1400 bp) với đoạn gen 16S rARN
của vi khuẩn Bacillus sonorensis_AF302118; tương đồng 99,4 % (1391/1400 bp) với đoạn 16S rARN của vi khuẩn Bacillus aerius_AJ831843 (Hỡnh 3.17). Theo
nghiờn cứu của Kim và cộng sự, cựng với hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis và
Bacillus cereus, Bacillus licheniformis là một trong cỏc chủng thuộc chi Bacillus cú
khả năng nitrate húa và khử nitrate trong điều kiện hiếu khớ, và lượng amoni đó chuyển sang khớ N2 là 33% sau 4 giờ nuụi cấy [34].
Hỡnh 3.17. Sơ đồ cõy phỏt sinh chủng loại của chủng B11.11
Staphylococcus aureus_X68417
Bacillus aerophilus_AJ831844
Bacillus stratosphericus_AJ831841
Bacillus altitudinis_AJ831842 99
Bacillus pumilus_AY876289
Bacillus safensis_AF234854
99 100
Bacillus aerius_AJ831843
Bacillus licheniformis_X68416
B11.11
100
Bacillus sonorensis_AF302118 63
Bacillus atrophaeus_AB021181
Bacillus siamensis_GQ281299
Bacillus amyloliquefaciens_AB255669
Bacillus methylotrophicus_EU194897 57
Bacillus vallismortis_AB021198
Bacillus mojavensis_AB021191
Bacillus subtilis_AB042061
Bacillus subtilis subsp spizizenii_AF 54 78 88 52 81 100 97 100 99 0.01
Ngụ Thị Kim Toỏn 51 K19 – Sinh học thực nghiệm
Hỡnh 3.18. Sơ đồ cõy phỏt sinh chủng loại của chủng B21.10
Kết quả giải trỡnh tự gen 16S rARN của chủng B21.10 tương đồng 99,8% (1397/1400 bp) với đoạn gen 16S rARN của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens_AB255669 và Bacillus methylotrophicus_EU194897; tương
đồng 99,6% (1395/1400 bp) với đoạn gen 16S rARN của vi khuẩn Bacillus vallismortis_AB021198; tương đồng 99,6% (1394/1400 bp) với đoạn gen 16S
rARN của vi khuẩn Bacillus siamensis_GQ281299 (Hỡnh 3.18). Trong nghiờn cứu của Zhang cựng cộng sự, Bacillus methylotrophicus cú khả năng chuyển húa cả
NH4 +
và NO2 -
thành khớ N2O với hiệu suất tương ứng là 51,58 và 5,81 mg/l/ngày [68].
Staphylococcus aureus_X68417
Bacillus aerophilus_AJ831844
Bacillus stratosphericus_AJ831841
Bacillus altitudinis_AJ831842 99
Bacillus pumilus_AY876289
Bacillus safensis_AF234854 99
100
Bacillus aerius_AJ831843
Bacillus licheniformis_X68416
Bacillus sonorensis_AF302118 100
Bacillus atrophaeus_AB021181
Bacillus mojavensis_AB021191
Bacillus subtilis subsp spizizenii_AF074970
Bacillus subtilis_AB042061 77
Bacillus vallismortis_AB021198
Bacillus amyloliquefaciens_AB255669
Bacillus siamensis_GQ281299
Bacillus methylotrophicus_EU194897
B21.10 50 80 89 79 68 80 100 97 100 99 0.01
Ngụ Thị Kim Toỏn 52 K19 – Sinh học thực nghiệm
Hỡnh 3.19. Sơ đồ cõy phỏt sinh chủng loại của chủng B23.2
Kết quả giải rỡnh tự gen 16S rARN của chủng B23.2 tương đồng 97,8% (1370/1401 bp) với đoạn gen 16S rARN của vi khuẩn Pseudomonas pseudoalcaligenes_Z76666; tương đồng 97,6% (1368/1401 bp) với đoạn gen 16S
rARN của vi khuẩn Pseudomonas mendocina_D84016 (Hỡnh 3.19). Kết quả này
cho thấy, chủng B23.2 cú thể thuộc chi Pseudomonas. Đõy là kết quả được cụng bố đầu tiờn về vi khuẩn Pseudomonas pseudoalcaligenes cú khả năng chuyển húa nitrite trong mụi trường so với nghiờn cứu của Zhang và cộng sự về khả năng chuyển húa của chủng Pseudomonas stutzeri cú khả năng chuyển húa nitrite [67].
Azorhizophilus paspali_AJ308318
Azotobacter beijerinckii_AJ308319
Azotobacter chroococcum_AB175653
Pseudomonas aeruginosa_X06684
Pseudomonas otitidis_AY953147
Pseudomonas resinovorans_Z76668 73
Serpens flexibilis_GU269546
Pseudomonas tuomuerensis_DQ868767
Pseudomonas stutzeri_AF094748
Pseudomonas xanthomarina_AB176954
Pseudomonas oleovorans subsp. lubricanti_DQ842018
Pseudomonas alcalophila_AB030583
Pseudomonas pseudoalcaligenes_Z76666 100 Pseudomonas mendocina_D84016 B23.2 66 76 71 50 100 57 92 68 93 89 0.01
Ngụ Thị Kim Toỏn 53 K19 – Sinh học thực nghiệm
.
Hỡnh 3.20. Sơ đồ cõy phỏt sinh chủng loại của chủng A4.2
Trỡnh tự gen 16S rARN của chủng A4.2 tương đồng 99.9% (1411/1413 bp) với đoạn gen 16S rARN của vi khuẩn Bacillus licheniformis_X68416 khi so sỏnh với cỏc trỡnh tự gen 16S rARN của cỏc vi sinh vật trong ngõn hàng gen quốc tế (Hỡnh 3.20). Điều này cho chỳng tụi kết luận: chủng A4.2 thuộc chi Bacillus. Đõy là cụng bố đầu tiờn ở Việt Nam, chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis cú khả năng xử lý photpho trong nước thải bằng việc tớch lũy vào cơ thể vi sinh vật, một phần cung cấp năng lượng cho cỏc quỏ trỡnh sinh húa và trao đổi chất.
Staphylococcus aureus_X68417
Bacillus cibi_AY550276
Bacillus indicus_AJ583158
Bacillus idriensis_AY904033 100
Bacillus isabeliae_AM503357 100
Bacillus aerophilus_AJ831844
Bacillus altitudinis_AJ831842
Bacillus stratosphericus_AJ831841 99
Bacillus safensis_AF234854
Bacillus pumilus_AY876289 99
97
Bacillus aerius_AJ831843
Bacillus licheniformis_X68416
A4.2
100
Bacillus sonorensis_AF302118 100
Bacillus atrophaeus_AB021181
Bacillus malacitensisBacillus axarquiensis__AY603656 AY603657
Bacillus mojavensis_AB021191 59
Bacillus subtilis_AB042061 77
Bacillus vallismortis_AB021198
Bacillus nematotocita_AY820954
Bacillus velezensisBacillus siamensis_AY603658 _GQ281299
Bacillus amyloliquefaciens_NR041455
Bacillus methylotrophicus_EU194897 6866 62 81 59 71 100 100 100 99 68 89 0.01
Ngụ Thị Kim Toỏn 54 K19 – Sinh học thực nghiệm
KẾT LUẬN
1. Đó phõn lập và được 65 chủng vi sinh vật trờn mụi trường Winogradsky và 21 chủng trờn mụi trường AMM từ cỏc mẫu nước thải ở Thanh Húa và Hà Nội.
2. Đó tuyển chọn được 4 chủng vi sinh vật cú khả năng hỡnh thành màng sinh học và cú khả năng xử lý nitơ và photpho tốt nhất là cỏc chủng cú ký hiệu B11.11, B21.10, B23.2 và A4.2. Cỏc chủng cú khả năng hỡnh thành màng sinh học ở nhiệt độ trong khoảng từ 37 đến 50oC, pH từ 7 đến 8.
3. Đó phõn loại và xỏc định được 3 chủng cú khả năng xử lý nitơ tốt nhất, trong đú, chủng B11.11 cú khả năng chuyển húa 85.21% NH4+ sau 20 ngày nuụi cấy, chủng B21.10 chuyển húa 97,28% và B23.2 chuyển húa 97,14% lượng NO2- sau 20 ngày nuụi cấy.
4. Đó phõn loại và xỏc định được chủng A4.2 cú khả năng xử lý photpho tốt nhất, sau 10 ngày, hàm lượng photpho trong mụi trường giảm đi 39.32% tương ứng với mụi trường cú hàm lượng photpho là 18 mg/l.
5. Dựa trờn trỡnh tự gen 16S rARN, đặc điểm khuẩn lạc, tế bào, cỏc đặc điểm sinh lý, sinh húa, chủng B11.11 và A4.2 được xỏc định gần với loài Bacillus licheniformis, chủng B21.10 được xỏc định gần với loài Bacillus amyloliquefaciens,
chủng B23.2 xỏc định gần với loài Pseudomonas pseudoalcaligenes.
KIẾN NGHỊ
1. Thay đổi hàm lượng nitơ và photpho phự hợp với nghiờn cứu. Kiểm tra khả năng chuyển húa cỏc chất trong mụi trường và sự hỡnh thành màng sinh học khi thay đổi hàm lượng.
2. Nghiờn cứu, tối ưu húa điều kiện chuyển húa cỏc hợp chất nitơ và photpho, nghiờn cứu và lựa chọn giỏ thể, chất mang phự hợp cho sự hỡnh thành màng sinh học của cỏc chủng nghiờn cứu.
Ngụ Thị Kim Toỏn 55 K19 – Sinh học thực nghiệm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Kiểu Hữu Ảnh (2006), Giỏo trỡnh vi sinh vật học, phần 1, NXB Đại học
Quốc Gia Hà Nội
2. Bộ Tài Nguyờn và Mụi trường (2010), Bỏo cỏo mụi trường Quốc gia 2010, Hà Nội.
3. Lờ Văn Cỏt (2007), Xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ và photpho, NXB
Khoa học tự nhiờn và Cụng nghệ.
4. Lương Đức Phẩm (2003), Cụng nghệ xử lý nước thải bằng biện phỏp sinh học, NXB Giỏo dục.
5. Nguyễn Hoài Hương (2009), Giỏo trỡnh thực hành vi sinh ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia TPHCM.
6. Nguyễn Văn Phước (2007), Xử lý nước thải sinh hoạt và cụng nghiệp bằng
phương phỏp sinh học, NXB Xõy dựng.
Tiếng Anh
7. Anderson I.C., Poth M., Homstead J., and Burdige D. (1993), “A comparison of NO and N2O production by the autotrophic nitrifier Nitrosomonas europaea and the heterotrophic nitrifier Alcaligenes faecalis”, Applied and Environmental Microbiology, 59 (11), pp. 3525-3533.
8. Annachhatre A.P. and Bhamidimarri S.M.R. (1992), “Microbial attachment and growth in fixed-film reactors: Process startup considerations”,
Biotechnology Advances, 10 (1), pp. 69-91.
9. APHA (2001), Standard Methods for the Examination of Water and Wastewate., 20th edition, American Public Health Association, Washington,
DC.
10. Asgari M.J., Safavi K., and Mortazaeinezahad F. (2011), “Landfill biogas production process”, International Conference on Food Engineering and Biotechnology, 9, pp. 208-212
Ngụ Thị Kim Toỏn 56 K19 – Sinh học thực nghiệm
11. Bao L.-L., Li D., Li X.K., Huang R.X., Zhang J., Yang L., and Xia G.Q. (2007), “Phosphorus accumulation by bacteria isolated from a continuous- flow two-sludge system”, Journal of Environmental Sciences, 19 (4), pp.
391-395.
12. Bernet N., Dangcong P., Delgenốs J., and Moletta R. (2001), “Nitrification at low oxygen concentration in biofilm reactor”, Journal of Environmental Engineering, 127 (3), pp. 266-271.
13. Boelee N.C., Temmink H., Janssen M., Buisman C.J.N., and Wijffels R.H. (2011), “Nitrogen and phosphorus removal from municipal wastewater effluent using microalgal biofilms”, Water Research, 45 (18), pp. 5925-5933. 14. Boyd C.E. and Tucker C.S. (1998), Pond Aquaculture Water Quality
Management, Kluwer Acad. Publ.
15. Broda E. (1977), “Two kinds of lithotrophs missing in nature”, Zeitschrift fỹr
allgemeine Mikrobiologie, 17 (6), pp. 491-493.
16. Cheung K.C., Chu L.M., and Wong M.H. (1997), “Ammonia stripping as a pretreatment for landfill leachate”, Water, Air, and Soil Pollution, 94 (1-2),
pp. 209-221.
17. Cong L.T.N., Huyen H.T., and Minh N.N. (2012), “Phenol degradation of biofilm formed by mixing - marine bacteria”, VNU. Journal of Science, 28
(2S), pp. 75-81.
18. Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., and Lappin- Scott H.M. (1995), “Microbial biofilms”, Annual Review of Microbiology, 49, pp. 711-745.
19. Czaczyk K. and Myszka K. (2007), “Biosynthesis of extracellular polymeric substances (EPS) and its role in microbial biofilm formation”, Polish Journal
of Environmental Studies, 16 (6), pp. 799-806.
20. Di Bonaventura G., Stepanovic S., Picciani C., Pompilio A., and Piccolomini R. (2007), “Effect of environmental factors on biofilm formation by clinical
Ngụ Thị Kim Toỏn 57 K19 – Sinh học thực nghiệm Stenotrophomonas maltophilia isolates”, Folia Microbiologica., 52 (1), pp.
86-90.
21. Donlan R.M. (2002), “Biofilms: microbial life on surfaces”, Emerging Infectious Diseases Journal, 8 (9), pp. 881-890.
22. Federation W.E. (1998), Biological and chemical systems for nutrient removal, Water Environment Federation, Alexandria, VA.
23. Flemming H.-C. (1993), “Biofilms and Environmental Protection”, Water Science & Technology, 27 (7-8), pp. 1-10.
24. Giaouris E., Chorianopoulos N., and Nychas G.J.E. (2005), “Effect of temperature, pH, and water activity on biofilm formation by Salmonella enterica enteritidis PT4 on stainless steel surfaces as indicated by the bead vortexing method and conductance measurements”, Journal of Food Protection, 68 (10), pp. 2149-2154.
25. Gilbert P., Das J., and Foley I. (1997), “Biofilm susceptibility to antimicrobials”, Advances in Dental Research, 11 (1), pp. 160-167.
26. Hang T.T. and Huy N.Q. (2011), “Isolate biofilm forming Bacillus strains
from contamination site in trade villages in Viet Nam”, VNU. Journal of Science, 27 (2S), pp. 157-162.
27. Henze M., Harremoes P., Jansen J.C., and Arvin E. (2001), Wastewater Treatment: Biological and Chemical Processes, Springer.
28. Heydorn A., Nielsen A.T., Hentzer M., Sternberg C., Givskov M., Ersboll B.K., and Molin S. (2000), “Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT”, Microbiology (Reading, England), 146
(10), pp. 2395-2407.
29. Ho K.L., Pometto A.L., and Hinz P.N. (1997), “Optimization of L-(+)-lactic acid production by ring and disc plastic composite supports through repeated-batch biofilm fermentation”, Applied and Environmental Microbiology, 63 (7), pp. 2533-2542.
Ngụ Thị Kim Toỏn 58 K19 – Sinh học thực nghiệm
30. Hoilijoki T.H., Kettunen R.H., and Rintala J.A. (2000), “Nitrification of anaerobically pretreated municipal landfill leachate at low temperature”,
Water Research, 34 (5), pp. 1435-1446.
31. Hunik J.H., Van Den Hoogen M.P., De Boer W., Smit M., and Tramper J. (1993), “Quantitative determination of the spatial distribution of
Nitrosomonas europaea and Nitrobacter agilis cells immobilized in kappa-
carrageenan gel beads by a specific Ffuorescent-antibody labelling technique”, Applied and Environmental Microbiology, 59 (6), pp. 1951-
1954.
32. Huy N.Q., Lien N.T.P., and Hang T.T. (2011), “Characterization of biofilm- forming bacteria isolated from soil in Viet Nam”, VNU. Journal of Science, 27 (2S), pp. 187-193.
33. Jứrgensen K.S. and Pauli A.S.L. (1995), “Polyphosphate accumulation among denitrifying bacteria in activated sludge”, Anaerobe, 1 (3), pp. 161-
168.
34. Kim J.K., Park K.J., Cho K.S., Nam S.-W., Park T.-J., and Bajpai R. (2005), “Aerobic nitrification–denitrification by heterotrophic Bacillus strains”, Bioresource Technology, 96 (17), pp. 1897-1906.
35. Kokare C.R.C., Khopade A.N., and Mahadik K. (2009), “Biofilm : importance and applications”, Indian Journal of Biotechnology, 18, pp. 159- 168.
36. Lacko N., Drysdale G.D., and Bux F. (2003), “Anoxic phosphorus removal by denitrifying heterotrophic bacteria”, Water science and technology : a journal of the International Association on Water Pollution Research, 47
(11), pp. 17-22.
37. Lazarova V. and Manem J. (1995), “Biofilm characterization and activity analysis in water and wastewater treatment”, Water Research, 29 (10), pp.
Ngụ Thị Kim Toỏn 59 K19 – Sinh học thực nghiệm
38. Li X.Z., Zhao Q.L., and Hao X.D. (1999), “Ammonium removal from landfill leachate by chemical precipitation”, Waste Management, 19 (6), pp.
409-415.
39. Lopez D., Vlamakis H., and Kolter R. (2010), “Biofilms”, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2 (7), pp. a000398.
40. Monroe D. (2007), “Looking for chinks in the armor of bacterial biofilms”,
PLoS Biology, 5 (11).
41. Mulder A. (2003), “The quest for sustainable nitrogen removal technologies”, Water science and technology : a journal of the International Association on Water Pollution Research, 48 (1), pp. 67-75.
42. Mulder A., Van De Graaf A.A., Robertson L.A., and Kuenen J.G. (1995), “Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized bed reactor”, FEMS Microbiology Ecology, 16 (3), pp. 177-183.
43. Nadell C.D., Xavier J.B., Levin S.A., and Foster K.R. (2008), “The evolution of quorum sensing in bacterial biofilms”, PLoS biology, 6 (1), pp. e14. 44. O'toole G., Kaplan H.B., and Kolter R. (2000), “Biofilm formation as
microbial development”, Annual Review of Microbiology, 54, pp. 49-79. 45. O'toole G.A., Gibbs K.A., Hager P.W., Phibbs P.V., Jr., and Kolter R.
(2000), “The global carbon metabolism regulator Crc is a component of a signal transduction pathway required for biofilm development by
Pseudomonas aeruginosa”, Journal of Bacteriology, 182 (2), pp. 425-431.
46. O'toole G.A. and Kolter R. (1998), “Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development”, Molecular Microbiology, 30 (2), pp. 295-304.
47. O'toole G.A. and Kolter R. (1998), “Initiation of biofilm formation in
Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent
signalling pathways: a genetic analysis”, Molecular Microbiology, 28 (3),
Ngụ Thị Kim Toỏn 60 K19 – Sinh học thực nghiệm
48. Ozturk I., Altinbas M., Koyuncu I., Arikan O., and Gomec-Yangin C. (2003), “Advanced physico-chemical treatment experiences on young municipal landfill leachates”, Waste Management, 23 (5), pp. 441-446. 49. Pressley T.A., Bishop D.F., and Roan S.G. (1972), “Ammonia-nitrogen
removal by breakpoint chlorination”, Environmental Science & Technology, 6 (7), pp. 622-628.
50. Radwan S.S., Al-Hasan R.H., Salamah S., and Al-Dabbous S. (2002), “Bioremediation of oily sea water by bacteria immobilized in biofilms coating macroalgae”, International Biodeterioration & Biodegradation, 50 (1), pp. 55-59.
51. Rieger L., Koch G., Kỹhni M., Gujer W., and Siegrist H. (2001), “The eawag bio-p module for activated sludge model no. 3”, Water Research, 35 (16),
pp. 3887-3903.
52. Schmid M.C., Maas B., Dapena A., Pas-Schoonen K.V.D, Vossenberg J.V.D, Kartal B., Niftrik L.V, Schmidt I., Cirpus I., Kuenen J. G., Wagner M., Damstộ J.S.S., Kuypers M., Revsbech N. P, Mendez R., Jetten M. S., and Strous M. (2005), “Biomarkers for in situ detection of anaerobic ammonium- oxidizing (anammox) bacteria”, Applied and Environmental Microbiology,
71 (4), pp. 1677-1684.
53. Schmidt I. and Bock E. (1997), “Anaerobic ammonia oxidation with nitrogen dioxide by Nitrosomonas eutropha”, Archives of Microbiology, 167 (2-3),
pp. 106-111.
54. Schmidt I. and Bock E. (1998), “Anaerobic ammonia oxidation by cell-free extracts of Nitrosomonas eutropha”, Antonie Van Leeuwenhoek, 73 (3), pp.
271-278.
55. Sedlak R.I. (1991), Phosphorus and Nitrogen Removal From Municipal Wastewater: Principles and Practice, Lewis Publication.
56. Sedlak R.I. (1991), Phosphorus and Nitrogen Removal from Municipal Wastewater: Principles and Practice, 2nd Edition, CRC Press, English.
Ngụ Thị Kim Toỏn 61 K19 – Sinh học thực nghiệm
57. Sharma B. and Ahlert R.C. (1977), “ Nitrification and nitrogen removal”,
Water Research, 11, pp. 897-925.
58. Shoji T., Satoh H., and Mino T. (2003), “Quantitative estimation of the role of denitrifying phosphate accumulating organisms in nutrient removal”,
Water science and technology : a journal of the International Association on Water Pollution Research, 47 (11), pp. 23-29.
59. Sidat M, Bux F., and Kasan H. (1999), “Polyphosphate accumulation by bacteria isolated from activated sludge”, Water South Africa, 25 (2), pp. 175- 180.
60. Siegrist H., Rieger L., Koch G., Kuhni M., and Gujer W. (2002), “The eawag bio-P module for activated sludge model No. 3”, Water science and technology : a journal of the International Association on Water Pollution Research, 45 (6), pp. 61-76.
61. Streichan M., Golecki J.R., and Schửn G. (1990), “Polyphosphate- accumulating bacteria from sewage plants with different proceses for biological phosphorus removal”, FEMS Microbiology Letters, 73 (2), pp.
113-124.
62. Sutherland I. (2001), “Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework”, Microbiology (Reading, England), 147 (Pt 1), pp. 3-9.
63. Van Benthum W.A.J., Van Loosdrecht M.D.M., and Heijnen J.J. (1997), “Control of heterotrophic layer formation on nitrifying biofilms in a biofilm airlift suspension reactor”, Biotechnology and Bioengineering, 53 (4), pp.
397-405.
64. Welander U., Henrysson T., and Welander T. (1998), “Biological nitrogen removal from municipal landfill leachate in a pilot scale suspended carrier biofilm process”, Water Research, 32 (5), pp. 1564-1570.
65. Wulff N.A., Mariano A.G., Gaurivaud P., De Almeida Souza L.C., Virgilio A.C., and Monteiro P.B. (2008), “Influence of culture medium pH on
Ngụ Thị Kim Toỏn 62 K19 – Sinh học thực nghiệm
growth, aggregation, and biofilm formation of Xylella fastidiosa”, Current Microbiology, 57 (2), pp. 127-132.
66. Yangin C., Yilmaz S., Altinbas M., and Ozturk I. (2002), “A new process for