Khả năng chuyển húa nitrite (NO2-) thành nitrate (NO3-) của cỏc chủng được đỏnh giỏ thụng qua sự giảm nồng độ nitrite trong mụi trường nuụi cấy.
Nguyờn tắc:
Phản ứng giữa nitrite và hỗn hợp sulfanylamide với naphtylendiamine tạo phức màu hồng ở pH 2. So màu ở bước súng 540 nm [9].
Chuẩn bị thuốc thử:
Dung dịch sunfanylamide: cõn 0,6 g NH2C6H4SO2NH2 hũa tan trong 50 ml nước cất núng, làm lạnh, thờm 40 ml HCl đặc và định mức đến 100 ml.
Dung dịch naphtylendiamine dihydrochloride: cõn 0.1 g C10H7NHCH2NH2.2HCl hũa tan trong 100 ml nước cất, đựng trong chai màu nõu, bảo quản 4oC.
Lập đường chuẩn:
Chuẩn bị cỏc ống thớ nghiệm.
Hũa tan 1,23 g NaNO2 trong 1000 ml nước cất. Dung dịch gốc cú nồng độ N- NO2 là 250 mg/l.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn cú nồng độ 1 mg/l bằng cỏch pha loóng dd gốc. Lập cỏc nồng độ khỏc nhau từ 0; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 mg/l.
Lấy 10 ml mỗi nồng độ vào cỏc ống nghiệm khỏc nhau. Thờm 0,2 ml NH2C6H4SO2NH2.
Trộn đều và giữ yờn trong 5 phỳt. Thờm 0,2 ml C10H7NHCH2NH2.2HCl. Trộn đều và giữ yờn trong 10 phỳt. So màu ở bước súng 540 nm.
Ngụ Thị Kim Toỏn 31 K19 – Sinh học thực nghiệm
2.3.8. Phương phỏp đỏnh giỏ khả năng xử lý photpho
Khả năng tớch lũy photpho của cỏc chủng được đỏnh giỏ thụng qua sự giảm nồng độ của PO4- trong mụi trường nuụi cấy theo thời gian.
Chuẩnbịthuốcthử:
Chuẩn bị dung dịch (NH4)6Mo6
Hũa tan 7,27 g amonium molydat (NH4)6Mo7O2.4H2O (sấy ở 105oC trong 3 giờ) vào 150 ml nước cất.
Hũa tan 0,0945 g Kaly antimon tactrat (C8H8O12K2.Sb2O2.H2O) trong 50ml nước cất.
96 ml H2SO4 đặc vào bỡnh chứa 600 ml nước cất sau đú làm lạnh đến nhiệt độ phũng.
Trộn cỏc dung dịch trờn với nhau
Thờm vào 10 g amonium amidosulfat (NH4OSO2NH2) vào hỗn hợp dung dịch trờn
Định mức đến 1000 ml
Chuẩn bị dung dịch C6H8O6: Hũa tan 1.8 g C6H8O6 trong 25 ml nước, sử dụng trong vũng 2 tuần.
Lập đường chuẩn
Chuẩn bị dóy cỏc dung dịch gồm 5 điểm vào 5 ống nghiệm cú chia vạch Dung dịch gốc 100 mg/l: hũa tan 0,4394g KH2PO4 trong 100 ml nước cất. Dung dịch chuẩn: pha loóng dung dịch gốc 20 lần ta được dung dịch chuẩn 5 mg/l. Lấy dung dịch chuẩn theo tỷ lệ nồng độ sau:
Nồng độ (mg/l) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Vdd chuẩn (ml) 0 2 4 6 8 10
Sau khi tiến hành lấy dung dịch chuẩn và lấy mẫu vào ống nghiệm định mức tới 40 ml
Thờm 1 ml dung dịch C6H8O6 Thờm 5 ml dung dịch (NH4)6Mo6 Định mức tới 50 ml
Ngụ Thị Kim Toỏn 32 K19 – Sinh học thực nghiệm
Điều nhiệt trong khoảng từ 30 đến 40oC trong thời gian từ 10 đến 20 phỳt Đo mẫu tại bước súng 710 nm
2.3.8.1. Phương phỏp phõn tớch photpho tổng
Nguyờn tắc: Amonium molydat và kali antimon tatrat phản ứng với PO43- trong mụi trường axit trung bỡnh tạo thành axit photpho molipdic cú màu xanh đậm đo màu ở bước súng 710 nm trờn mỏy quang phổ UV – VIS [9].
Xử lý mẫu:
Lấy 10 ml mẫu vào bỡnh cú nỳt 100 ml
Thờm 5 ml K2S2O8 (4 g K2S2O8 trong 100 ml nước) Thờm 1 ml H2SO4 30%
Đun ở 120oC trong 30 phỳt
Sau đú chuyển toàn bộ mẫu đó đun vào trong bỡnh định mức tới 50 ml bằng nước cất. Lấy 10 ml mẫu này cho vào bỡnh định mức 50 ml
Thờm 5 ml dung dịch (NH4)6Mo6 vào ống và chuẩn về 40 ml Thờm 1 ml dung dịch C6H8O6
Định mức tới 50 ml bằng nước cất.
Điều nhiệt trong khoảng từ 30 đến 40oC trong thời gian từ 10 đến 20 phỳt Đo mẫu tại bước súng 710 nm
Mẫu đối chứng được làm tương tự để đối chiếu lại kết quả. Tớnh toỏn kết quả
C= Cđo 50/10 50/10 (mg/l)
Trong đú: C: nồng độ dung dịch mẫu thực (mg/l)
Cđo: nồng độ dung dịch mẫu đo từ ống nghiệm (mg/l).
2.3.8.2. Phương phỏp phõn tớch hàm lượng Ortho photphate (PO43-)
Lấy 10 ml mẫu cho vào bỡnh định mức 50 ml
Thờm 5 ml dung dịch (NH4)6Mo6 vào ống và chuẩn về 40 ml Thờm 1 ml dung dịch C6H8O6
Định mức tới 50 ml bằng nước cất.
Ngụ Thị Kim Toỏn 33 K19 – Sinh học thực nghiệm
Đo tại bước súng 710 nm
Mẫu đối chứng được làm tương tự để đối chiếu lại kết quả. C= Cđo 50/10 (mg/l)
Trong đú: C: nồng độ dung dịch mẫu thực (mg/l)
Cđo: nồng độ dung dịch mẫu đo từ ống nghiệm (mg/l).
2.3.9. Phương phỏp phõn loại vi sinh vật dựa trờn gen 16S rRNA
Cỏc chủng vi sinh vật cú khả năng xử lý nitơ và photpho được phõn tớch trỡnh tự gen 16S rRNA để xỏc định cõy phõn loại.
Trỡnh tự gen đoạn 16S rRNA được đọc trờn mỏy đọc trỡnh tự tự động ABI PRISM 3100 Avant (Hoa Kỳ) tại Viện Vi sinh vật và Cụng nghệ sinh học.
Kết quả phõn tớch trỡnh tự 16S rRNA được so sỏnh với trỡnh tự đoạn gen tương tưng của cỏc loài trong ngõn hàng gen quốc tế bằng phương phỏp Clustal X.
Cõy phỏt sinh chủng loại được xõy dựng dựa trờn phần mềm njplot.
2.3.10.Phương phỏp thống kờ sinh học
Cỏc kết quả thu được được xử lý bằng thụng kờ sinh học thụng qua cỏc phần mềm Excel, Microsoft Word để đảm bảo độ tin cậy.
Ngụ Thị Kim Toỏn 34 K19 – Sinh học thực nghiệm
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3. 1. Nghiờn cứu cỏc chủng vi sinh vật cú khả năng chuyển húa nitơ.
3.1.1.Phõn lập chủng vi sinh vật cú khả năng chuyển húa nitơ và cú khả năng hỡnh thành màng sinh học hỡnh thành màng sinh học
3.1.1.1. Phõn lập cỏc chủng vi sinh vật cú khả năng chuyển húa nitơ
Cỏc mẫu sau khi đưa về phũng thớ nghiệm, chỳng tụi tiến hành phõn tớch hàm lượng nitơ và photpho ban đầu cú trong cỏc mẫu. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.1. Hàm lượng thành phần nitơ và photpho trong mẫu phõn tớch.
Mẫu
Hàm lượng cỏc hợp chất nitơ trong mẫu phõn lập (mg/l) Hàm lượng photpho tổng (mg/l) Nitơ tổng NH4+ NO2- 1 140,74 ± 2,1 71,58 ± 1,43 5,31 ± 0,032 16,97 ± 1,02 2 111,93 ± 1,68 78,42 ± 2,35 1,44 ± 0,009 18,76 ± 1,13 3 83,12 ± 1,25 68,26 ± 1,36 1,01 ± 0,006 46,05 ± 2,76 4 71,60 ± 0,71 65,14 ± 1,30 2,59 ± 0,016 10,68 ± 0,64 5 100,41 ±1,50 75,10 ± 1,50 7,33 ± 0,044 31,33 ± 1,88
Kết quả phõn tớch mẫu ban đầu cho thấy, cỏc mẫu ban đầu đều cú hàm lượng nitơ và photpho cao hơn nhiều so với mức trung bỡnh và quy định cho phộp đối với nước thải (Bảng 3.1).
Từ những mẫu thu được, chỳng tụi đó phõn lập được 65 chủng vi sinh vật cú khả năng phỏt triển trờn mụi trường Winogradsky. Trong đú, 41 chủng cú khả năng phỏt triển trờn mụi trường Winogradsky 1, 24 chủng cú khả năng phỏt triển trờn mụi trường Winogradsky 2. Kết quả phõn lập ở bảng 3.2 cho thấy trờn hai mụi trường Winogradsky phõn lập được cỏc chủng từ nước thải bể biogas nhiều hơn so với cỏc mẫu lấy ở khu tập trung rỏc thải. Số lượng cỏc chủng thu được ở tầng giữa bể biogas đang sử dụng và đó khụng sử dụng nhiều hơn ở tầng đỏy bể biogas đó ngưng sử dụng. Kết quả này cũng phự hợp với nhiều nghiờn cứu cho rằng cỏc chủng vi khuẩn cú khả năng chuyển húa NH4+ và NO2- là những vi khuẩn hiếu khớ [69], [71].
Ngụ Thị Kim Toỏn 35 K19 – Sinh học thực nghiệm
Bảng 3.2. Địa điểm và số lượng cỏc chủng vi sinh vật cú khả năng chuyển húa nitơ
Địa điểm lấy mẫu
Số chủng phõn lập Ký hiệu chủng Mụi trường W1 Mụi trường W2 Nước thải bể biogas Tầng giữa bể biogas đó ngưng sử dụng 11 15 Từ B11.1 đến B11.11 Từ B21.1 đến B21.15 Tầng đỏy bể biogas đó ngưng sử dụng 4 0 Từ B12.1 đến B12.4 Tầng giữa bể biogas đang sử dụng 13 9 Từ B13.1 đến B13.13 Từ B23.1 đến B23.9 Nước thải khu tập trung rỏc thải Ngoài bói rỏc 5 0 VP1.1, VP1.4, VP1.5, VP1.8, VP1.9, Trong bói rỏc 8 0 VP2.2, VP2.3, VP2.4, VP2.5, VP2.7, VP2.9, VP2.10, VP2.11 Cỏc chủng phõn lập trờn mụi trường Winogradsky 1 (Hỡnh 3.1A) cú đặc điểm chủ yếu là khuẩn lạc tế bào trũn hay cú hỡnh tia, cú màu trắng đục hay vàng. Cỏc chủng phõn lập trờn mụi trường Winogradsky 2 khuẩn lạc chủ yếu giống trờn mụi trường Winogradsky 1, cú hỡnh tia hay trũn, màu trắng đục (Hỡnh 3.1B).
Hỡnh 3.1. Hỡnh ảnh cỏc khuẩn lạc phõn lập trờn mụi trường Winogradsky 1(A) và Winogradsky 2 (B)
Ngụ Thị Kim Toỏn 36 K19 – Sinh học thực nghiệm
3.1.1.2. Khả năng hỡnh thành màng sinh học của cỏc chủng phõn lập
Bằng phương phỏp nhuộm với tớm kết tinh bước đầu đó chỳng tụi đỏnh giỏ được khả năng hỡnh thành màng sinh học của 28 chủng vi khuẩn phõn lập trờn mụi trường Winograky 1 từ mẫu nước thải ở bể biogas. Kết quả cho thấy hầu hết cỏc vi khuẩn phõn lập được đều cú khả năng hỡnh thành biofilm, trong đú cỏc chủng B11.8, B11.11 và B13.1 cú khả năng hỡnh thành màng sinh học tốt nhất với số OD đo ở bước súng 570 nm lần lượt tương ứng là 1,824; 2,775 và 2,235 (Hỡnh 3.2).
Hỡnh 3.2. Khả năng hỡnh thành màng sinh học của cỏc chủng trờn mụi trường Winogradsky 1 được phõn lập từ cỏc mẫu nước thải thu từ bể biogas
Khi tiến hành đỏnh giỏ 13 mẫu thu được ở khu tập trung rỏc thải Vạn Phỳc bằng phương phỏp tương tự, chỳng tụi thu được hai chủng VP1.1 và VP2.11 là hai chủng cú chỉ số OD đo ở bước súng 570 nm cao hơn cỏc chủng cũn lại với số đọc tưng ứng là 4,65 và 3,24 (Hỡnh 3.3).
Từ những kết quả thu được như trờn, chỳng tụi đó tuyển chọn được 5 chủng cú khả năng hỡnh thành màng sinh học tốt nhất và cú khả năng phỏt triển trờn mụi trường Winogradsky 1 là : VP1.1, VP2.11, B11.8, B11.11, B13.1.
Ngụ Thị Kim Toỏn 37 K19 – Sinh học thực nghiệm
Hỡnh 3.3. Khả năng hỡnh thành màng sinh học của cỏc chủng trờn mụi trường Winogradsky 1 được phõn lập từ cỏc mẫu nước thải khu tập trung rỏc thải
Hỡnh 3.4. Khả năng tạo hỡnh thành màng sinh học của cỏc chủng trờn mụi trường Winogradsky 2 được phõn lập ở bể biogas
Đối với cỏc chủng phõn lập được trờn mụi trường Winogradsky 2, chỳng tụi cũng tiến hành cỏc thớ nghiệm tương tự để đỏnh giỏ khả năng hỡnh thành biofilm. Kết quả cho thấy, trong 24 chủng thu được, 3 chủng B21.1, B21.10 và B23.2 cú khả
Ngụ Thị Kim Toỏn 38 K19 – Sinh học thực nghiệm
năng tạo màng biofilm tốt nhất. Chỳng tụi lựa chọn 3 chủng này cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo để phõn tớch khả năng chuyển húa NO2- (Hỡnh 3.4).
3.1.2.Khả năng chuyển húa nitơ
8 chủng vi sinh vật cú khả năng hỡnh thành màng sinh học tốt nhất được chỳng tụi chọn để thử hoạt tớnh chuyển húa cỏc hợp chất nitơ. Trong đú 5 chủng B11.8, B11.11, B13.1, VP1.1 và VP2.11 được thử khả năng chuyển húa amoni, 3 chủng B21.1, B21.10 và B23.2 được thử khả năng chuyển húa nitrite.
3.1.2.1.Khả năng chuyển húa amoni
Khả năng chuyển húa amoni được đỏnh giỏ thụng qua hàm lượng NH4+ trong mẫu nghiờn cứu theo thời gian. Chủng vi sinh vật nào cú khả năng chuyển húa amoni thỡ hàm lượng NH4+ sẽ giảm đi trong quỏ trỡnh nghiờn cứu. 5 chủng B11.8, B11.11, B13.1, VP1.1 và VP2.11 được nuụi lắc trong mụi trường Winogradsky 1, sau mỗi khoảng thời gian nghiờn cứu, lấy mẫu phõn tớch.
Hỡnh 3.5. Khả năng chuyển húa amoni của cỏc chủng nghiờn cứu.
Với hàm lượng amoni trong mẫu ban đẫu là 450 mg/l. Kết quả (Hỡnh 3.5) cho thấy, sau 5 ngày, bốn chủng B11.8, B13.1, VP1.1 và VP2.11 nồng độ NH4+
giảm đi khụng nhiều, trong khi đú, với chủng B11.11, nồng độ NH4+ giảm 58,93% so với mẫu ban đầu. Nồng độ NH4+ tiếp tục giảm đi, sau 10, 15 ngày, hàm lượng trong mẫu của chủng B11.8 giảm đi 12,2%, B13.1 giảm đi 28,53%, VP1.1 giảm đi
Ngụ Thị Kim Toỏn 39 K19 – Sinh học thực nghiệm
14,44% và VP2.11 giảm đi 10,52%. Sau 20 ngày, chủng B11.11 hàm lượng NH4+
cú trong mẫu đó giảm đi 85,21%. Trong khi đú, 4 chủng cũn lại hàm lượng NH4+
trong dung dịch chỉ giảm đi vào khoảng từ 20-50% so với mẫu ban đầu. Từ kết quả trờn cho thấy chủng B11.11 cú khả năng chuyển húa amoni tốt nhất. Do vậy, chỳng tụi đó lựa chọn chủng B11.11 cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo của mỡnh.
3.1.2.2.Khả năng chuyển húa nitrite
Với cỏc chủng vi sinh vật phõn lập trờn mụi trường Winogradsky 2, chỳng tụi cũng tiến hành cỏc thớ nghiệm tương tự. Khả năng chuyển húa nitrite được đỏnh giỏ thụng qua hàm lượng NO2- giảm theo thời gian nghiờn cứu. 3 chủng B21.1, B21.10, B23.2 được nuụi lắc trong mụi trường Winogradsky 2.
Hỡnh 3.6. Khả năng chuyển húa nitrite của cỏc chủng nghiờn cứu
Với hàm lượng nitrite trong mẫu ban đầu là 80 mg/l. Kết quả hỡnh 3.6 cho thấy cả ba chủng nghiờn cứu đều cú khả năng chuyển húa nitrite, sau 5 ngày, nồng độ NO2- trong dịch nuụi lắc của chủng B21.10 giảm đi 75.23% so với mẫu ban đầu, tương ứng, hai chủng B23.2 và B21.1 là 69.07% và 7.26%. Chủng B21.1 cú khả năng chuyển húa NO2- nhưng khả năng chuyển húa chậm hơn, sau 20 ngày hàm lượng NO2- trong dung dịch giảm đi 75% so với mẫu ban đầu trong khi hai chủng B21.10 và B23.2 đó chuyển húa gần như hoàn toàn lượng NO2- cú trong mẫu lắc.
Ngụ Thị Kim Toỏn 40 K19 – Sinh học thực nghiệm
Kết quả, sau 20 ngày hai chủng B21.10 và B23.2 đó chuyển húa được trờn 97% lượng NO2- cú trong mẫu. Từ kết quả này, chỳng tụi đó lựa chọn ra hai chủng B21.10 và B23.2 cho cỏc thớ nghiệm nghiờn cứu tiếp theo.
3. 2. Nghiờn cứu cỏc chủng vi sinh vật cú khả năng xử lý photpho.
3.2.1. Phõn lập chủng vi sinh vật cú khả năng xử lý photpho và cú khả năng hỡnh thành màng sinh học.
3.2.1.1. Phõn lập cỏc chủng vi sinh vật cú khả năng xử lý photpho
Mẫu nước thải từ bể biogas và nước thải khu xử lý rỏc thải khi phõn lập trờn mụi trường AMM thu được cỏc khuẩn lạc chủ yếu màu trắng đục, hơi vàng, khuẩn lạc trũn (Hỡnh 3.7). Dựa vào kớch thước, màu sắc và hỡnh dạng, chỳng tụi đó thu được 21 chủng với ký hiệu như bảng 3.3.
Hỡnh 3.7. Một số khuẩn lạc phõn lập trờn mụi trường AMM: mẫu khu vực biogas (A) và khu tập trung rỏc thải (B)
Kết quả phõn lập ở bảng 3.3 cho thấy, cõc chủng phõn lập ở tầng giữa bể biogas cao hơn so với tầng đỏy, trong khu vực tập trung rỏc thải cao hơn so với bờn ngoài khu vực.
Ngụ Thị Kim Toỏn 41 K19 – Sinh học thực nghiệm
Bảng 3.3. Địa điểm và số lượng cỏc chủng vi sinh vật cú khả năng tớch lũy photpho Địa điểm thu mẫu Mẫu thu được Ký hiệu
Nước thải từ bể biogas 13 chủng
Từ A1.1 dến A1.8 Từ A2.1 đến A2.2 Từ A3.1 đến A3.3 Nước thải từ khu tập trung
rỏc thải 8 chủng
Từ A4.1 đến A4.3 Từ A5.1 đến A5.5
3.2.1.2.Khả năng hỡnh thành màng sinh học của cỏc chủng phõn lập
Tiến hành cỏc thớ nghiệm tương tự về xỏc định khả năng hỡnh thành màng sinh học của cỏc chủng phõn lập từ mụi trường AMM. Kết quả trờn hỡnh cho thấy, chủng A4.2, A5.1, A5.2, A5.3 là bốn chủng cú khả năng hỡnh thành màng sinh học tốt nhất (Hỡnh 3.8). Do vậy chỳng tụi đó lựa chọn 4 chủng này cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
Hỡnh 3.8. Khả năng hỡnh thàng màng sinh học của cỏc chủng vi sinh vật cú khả năng tớch lũy photpho
Ngụ Thị Kim Toỏn 42 K19 – Sinh học thực nghiệm
3.2.2. Khả năng xử lý photpho của cỏc chủng nghiờn cứu.
Đỏnh giỏ khả năng giảm hàm lượng photpho, chỳng tụi đỏnh giỏ thụng qua hàm lượng photphate tớch lũy trong vi sinh vật. Chỳng tụi tiến hành nuụi cấy lắc cỏc chủng nghiờn cứu trong mụi trường AMM trong thời gian 10 ngày ở cỏc điều kiện