2.2.1. Mụi trường nuụi cấy
Mụi trường Winogradsky được sử dụng để phõn lập vi sinh vật trong quỏ trỡnh nitrate húa.
Mụi trường Winogradsky 1 Mụi trườngWinogradsky 2 (NH4 )2SO4 2 g NaNO2 1 g MgSO4 0,5 g MgSO4 0,5 g NaCl 2 g NaCl 0.3 g K2HPO4 1 g K2HPO4 1 g CaCO3 0,001 g NaCO3 1 g FeSO4 0,4 g FeSO4 0,03 g Thạch 15 g Thạch 15 g Nước cất 1 lớt Nước cất 1 lớt
Mụi trường acetate mineral medium (AMM) được sử dụng để phõn lập vi sinh vật cú khả năng xử lý photpho:
Ngụ Thị Kim Toỏn 24 K19 – Sinh học thực nghiệm Na2HPO4: 28,73 mg NH4Cl: 57,27 mg MgSO4: 131,82 mg K2SO4: 26,74 mg CaCl2. 2H2O: 17,2 mg HEPES: 12 g Dung dịch khoỏng: 2 ml Thạch: 15 g Nước cất: 1 lit Dung dịch khoỏng gồm: EDTA: 50 g FeSO4. 7H2O: 5 g CuSO4. 5H2O: 1,6 g MnCl2. 4H2O: 5 g (NH4)6Mo7O24. 4H2O: 1,1 g H3BO3: 50 mg KI: 10 mg CoCl2. 6H2O: 50 mg Nước cất: 1 lit
Mụi trường Luria Betani (LB) (g/l)
Peptone 10 g
Cao nấm men 5 g
NaCl 10 g
Nước cất 1 lit
Cỏc mụi trường được khử trựng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 20 phỳt. Cỏc húa chất khỏc đều đạt độ tinh khiết cho nghiờn cứu.
2.2.2. Mỏy múc thiết bị
Nồi khử trựng (ALP–Nhật). Mỏy lắc (Satorius–Đức).
Ngụ Thị Kim Toỏn 25 K19 – Sinh học thực nghiệm
Box cấy vi sinh vật (Aura vertical–í). Mỏy đo mật độ quang học (Bionate–Anh). Mỏy đo pH (Horiba–Nhật Bản).
Cõn Kern (Satorius–Đức). Cõn phõn tớch (Presica, í) Tủ ấm (Memmert–Đức).
Mỏy ly tõm sigma 3K30 (Sartorius–Đức). Tủ sấy (Memmert–Đức).
Mỏy khuấy từ (IKA–Đức).
Kớnh hiển vi điện tử quột JSM–5421LV (Nhật Bản).
2.3. Phương phỏp nghiờn cứu
2.3.1. Phương phỏp phõn lập vi khuẩn
Dựng cỏc đĩa petri cú chứa mụi trường Winogradsky và mụi trường AMM đó khử trựng. Pha loóng cỏc mẫu ở cỏc nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 và 10-5. Dựng pipet lấy 100 àl dịch mẫu đó pha loóng cho lờn mặt thạch. Dựng que cấy gạt đó vụ trựng gạt đều trờn mặt thạch cho đến khi nào mặt thạch khụ thỡ dừng lại. Cỏc mẫu đó cấy gạt cho vào tủ ấm ở 37oC trong thời gian từ 3 đến 5 ngày.
2.3.2. Phương phỏp đỏnh giỏ khả năng hỡnh thành biofilm
Nguyờn tắc: trong điều kiện dinh dưỡng thớch hợp và mụi trường nuụi cấy tĩnh cỏc chủng vi sinh vật hỡnh thành biofilm trờn bề mặt giỏ thể. Phỏt hiện, quan sỏt biofilm bằng cỏch nhuộm với tớm kết tinh – là chất cú khả năng bắt màu với tế bào. Tiến hành thớ nghiệm theo phương phỏp của O’Toole và cộng sự [46], [47]. Cỏc chủng vi khuẩn được lắc kớch hoạt trong bỡnh tam giỏc chứa mụi trường LB trong 24 giờ ở 37oC sao cho mật độ tế bào tại bước súng 620 nm (OD620) ở vào khoảng 0,2 đến 0,3. Hỳt 100 àl dịch nuụi cấy vi khuẩn bổ sung vào 700 àl LB lỏng trong cỏc ống eppendorf đó khử trựng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC.
Sau 24 giờ cỏc dịch nuụi cấy được loại bỏ khỏi cỏc ống eppendorf. Đỏnh giỏ mật độ tế bào sống trụi nổi trong mụi trường bằng phương phỏp so màu ở bước súng 620 nm dịch nuụi cấy vi khuẩn.
Ngụ Thị Kim Toỏn 26 K19 – Sinh học thực nghiệm
Quan sỏt khả năng hỡnh thành biofilm: Mỗi ống eppendorf được rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trựng. Bổ sung vào mỗi ống eppendorf 1 ml dung dịch tớm kết tinh 1% và giữ trong 25 phỳt ở nhiệt độ phũng. Loại bỏ dung dịch nhuộm và quan sỏt sự bắt màu của cỏc tế bào bỏm trờn trờn thành ống với tớm kết tinh.
Đỏnh giỏ mật độ tế bào trong biofilm: Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trựng cỏc tinh thể tớm bỏm trờn thành eppenodorf đươc hũa tan trong 1 ml etanol 70%. Mật độ tế bào trong biofilm được xỏc định bằng cỏch đo độ hấp thụ tại bước súng 570 nm.
2.3.3. Quan sỏt cấu trỳc biofilm bằng chụp ảnh trờn kớnh hiển vi điện tử quột (SEM) (SEM)
Chuẩn bị mẫu biofilm nổi: bổ sung dịch nuụi cấy lắc vi khuẩn vào bỡnh tam giỏc chứa 20 ml mụi trường LB. Nuụi cấy tĩnh 24 giờ ở 37oC.
Gắn mẫu biofilm lờn lamen, hơ nhẹ trờn ngọn lửa đốn cồn để cố định mẫu. Rửa nhẹ bằng nước cất khử trựng.
Gắn mẫu lờn đế. Mạ phủ mẫu bằng vàng trờn mỏy JFC–1200 trong 5 phỳt ở 30 mA.
Soi và chụp ảnh trờn kớnh hiển vi quột điện tử JSM–5421LV (Nhật Bản) tại phũng chụp Hiển vi điện tử quột – Trung Tõm Khoa Học Vật Liệu – Trường Đại học Khoa học Tự Nhiờn.
2.3.4. Ảnh hưởng của cỏc điều kiện mụi trường nuụi cấy lờn sự hỡnh thành màng sinh học
Vi sinh vật cú khả năng hỡnh thành màng sinh học tốt ở những điều kiện khỏc nhau. Nhiệt độ, pH khụng thớch hợp sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phỏt triển của vi sinh vật và khả năng tạo màng sinh học của chỳng.
2.3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ mụi trường nuụi cấy
Đỏnh giỏ khả năng hỡnh thành màng sinh học của cỏc chủng vi khuẩn trong mụi trường LB lỏng, nuụi cấy ở cỏc nhiệt độ: 25oC, 30oC, 37oC, 45oC, 50oC, 55oC. Sau 1 ngày nuụi cấy, tiến hành quan sỏt, đỏnh giỏ khả năng tạo biofilm của chủng vi khuẩn nghiờn cứu.
Ngụ Thị Kim Toỏn 27 K19 – Sinh học thực nghiệm
2.3.4.2. Ảnh hưởng của pH mụi trường nuụi cấy
Đỏnh giỏ khả năng hỡnh thành màng sinh học của cỏc chủng vi khuẩn trong mụi trường LB lỏng, nuụi cấy ở cỏc pH: 4, 5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 9. Sau 1 ngày nuụi cấy, tiến hành quan sỏt, đỏnh giỏ khả năng hỡnh thành màng sinh học của chủng vi khuẩn nghiờn cứu.
2.3.5. Phương phỏp nhuộm Gram.
Nguyờn tắc: Dựa vào sự khỏc biệt giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Vi khuẩn Gram (+) cú peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm thấu ngăn cản sự thất thoỏt của tớm kết tinh. Ban đầu vi khuẩn được nhuộm bằng tớm kết tinh sau đú được xử lý bằng iụt để tăng độ giữ màu. Sau đú được tẩy màu bằng cồn làm co cỏc lỗ của lớp peptidoglican dày lại. Do vậy phức chất tớm kết tinh và iot được giữ lại, vi khuẩn cú màu tớm. Peptidoglican ở vi khuẩn Gram (-) rất mỏng, ớt liờn kết chộo và cú lỗ lớn. Sự xử lý bằng cồn cú thể loại lipit khỏi thành Gram (-) đủ để làm tăng hơn kớch thước của lỗ. Do vậy, ở bước rửa bằng cồn đó loại bỏ phức chất màu tớm của tớm kết tinh-iụt. Khi nhuộm lại bằng safain thỡ vi khuẩn cú màu hồng [1].
Phương phỏp tiến hành:
Tạo vết bụi bằng cỏch nhỏ một giọt nước lờn lam kớnh sạch, đốt núng que cấy trờn ngọn lửa đốn cồn, dựng que cấy lấy khuẩn lạc trờn đĩa thạch hoặc trong ống giống, đưa vào giọt nước, cố định vết bụi bằng cỏch hơ khụ trờn ngọn lửa đốn cồn.
Cho một giọt tớm kết tinh bao phủ hoàn toàn vết bụi, nhuộm trong thời gian 1 phỳt. Sau đú rửa bằng nước cất và thấm khụ.
Nhuộm với lưugụn (chứa KI và I2) tương tự như với tớm kết tinh. Rửa bằng cồn trong 30 giõy. Thấm khụ.
Nhuộm safain trong 2 phỳt. Rửa bằng nước cất, thấm khụ. Soi trờn kớnh hiển vi quang học cú độ phúng đại 100 lần. Quan sỏt kết quả và đưa ra kết luận.
Ngụ Thị Kim Toỏn 28 K19 – Sinh học thực nghiệm
2.3.6. Phương phỏp sử dụng kit APi
Để kiểm tra khả năng đồng húa cỏc hợp chất hữu cơ điển hỡnh của cỏc chủng vi khuẩn, chỳng tụi đó tiến hành thử với Kit thử APi 20NE của hóng BioMộrieus.
Húa chất và thuốc thử cần thiết được cung cấp cựng với bộ kit.
Kết quả được ghi lại và phõn loại với phần mềm của hóng BioMộrieus .
2.3.7. Phương phỏp đỏnh giỏ khả năng chuyển húa cỏc hợp chất nitơ
Mỗi chủng được nuụi lắc ở 37°C trong cỏc khoảng thời gian từ 0, 5, 10, 15, 20 ngày. Mụi trường nuụi lắc là dung dịch mụi trường Winogradsky cú bổ sung 1% pepton [34].
2.3.7.1. Phương phỏp phõn tớch nitơ tổng số
Nguyờn tắc của việc phõn tớch nitơ tổng số là chuyển toàn bộ nitơ ở cả dạng vụ cơ và hữu cơ về dạng nitrate nhờ chất oxi húa mạnh sau đú tiến hành so màu ở bước súng 220 nm [9].
Phương phỏp làm như sau: Xử lý mẫu
Lấy 50 ml mẫu vào bỡnh chịu nhiệt 100 ml
Thờm 10 ml dd A (dd A : 4 g NaOH + 3 g K2S2O8)/100ml nước cất. Nỳt chặt và đun trong nồi khử trựng ở 120°C trong 30 phỳt.
Sau đú lấy 30 ml mẫu vào bỡnh định mức 50 ml, lọc loại bỏ vẩn đục. Thờm 6,5 ml HCl (HCl:H2O = 1:15 về thể tớch).
Lắc và định mức tới 50 ml bằng nước khử ion. Lập đường chuẩn
Chuẩn bị đường chuẩn gồm 4 điểm bằng bỡnh định mức 50ml
Dung dịch gốc 100 mg/l: hũa tan 0,722 g KNO3 bằng nước cất, sau đú định mức lờn 1000 ml, đựng trong chai màu nõu, bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch chuẩn 10 mg/l bằng cỏch pha loóng dung dịch gốc ra 10 lần Cỏch tiến hành: lấy thể tớch dung dịch chuẩn theo tỷ lệ vào 4 bỡnh định mức, thờm vào mỗi bỡnh 0,5 ml dung dịch HCl, định mức tới 50 ml bằng nước cất, lắc đều. Sau đú đo ở bước súng 220 nm
Ngụ Thị Kim Toỏn 29 K19 – Sinh học thực nghiệm
Với mẫu sau khi thực hiện bước xử lý mẫu xong cũng tiến hành tương tự như bước lập đường chuẩn
Tớnh toỏn kết quả
mgN- T = mgN- T đo 2
Chỳ ý: giới hạn của phộp đo là < 3 mg/l, nếu hàm lượng nitơ trong mẫu nằm quỏ giới hạn thỡ phải pha loóng mẫu .
2.3.7.2. Phương phỏp phõn tớch hàm lượng amoni (NH4+)
Khả năng chuyển húa amoni của cỏc chủng vi khuẩn được phõn tớch dựa trờn nồng độ amoni trong mụi trường theo cỏc khoảng thời gian nuụi.
Nguyờn tắc:
Phản ứng của NH4+ và hypochloride với sự cú mặt của xỳc tỏc phenol tạo thành hợp chất indophenol blue. So màu ở bước súng 640 nm [9].
Chuẩn bị thuốc thử:
Hypochloride: 15 g NaOH khan + 500 ml NaClO 0.1% sau đú định mức đến 1000ml bằng nước khử ion.
Dung dịch phenol- sodium nitroprusside: 5 g phenol (C6H5OH) + 0.025 g nitroprusside (Na2[Fe(CN)5.NO].2H2O), định mức đến 500 ml bằng nước khử ion.
Dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn được lấy từ NH4Cl tinh khiết sấy ở 105°C trong 3 giờ, đẻ nguội trong bỡnh hỳt ẩm. Cõn 3,819 g NH4Cl, hũa tan và định mức đến 1000 ml bằng nước khử ion. Dung dịch cú nồng độ N- NH4+ là 1 g/l. Chuẩn bị dung dịch cú nồng độ 1 mg/l bằng cỏch pha loóng dung dịch gốc.
Lập đường chuẩn: tương ứng với cỏc nồng độ 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 mg/l. Lấy 5 ml mẫu vào ống thủy tinh.
Thờm 3 ml thuốc thử phenol- sodium nitroprusside. Lắc trờn mỏy rung 30 giõy.
Thờm 3 ml hypochloride. Lắc trờn mỏy rung 30 giõy.
Ngụ Thị Kim Toỏn 30 K19 – Sinh học thực nghiệm
Điều nhiệt ở 37°C trong 25 phỳt. Đo ở bước súng 640 nm.
Với mẫu cũng làm cỏc bước tương tự như lập đường chuẩn.
2.3.7.3. Phương phỏp thử khả năng chuyển húa nitrite
Khả năng chuyển húa nitrite (NO2-) thành nitrate (NO3-) của cỏc chủng được đỏnh giỏ thụng qua sự giảm nồng độ nitrite trong mụi trường nuụi cấy.
Nguyờn tắc:
Phản ứng giữa nitrite và hỗn hợp sulfanylamide với naphtylendiamine tạo phức màu hồng ở pH 2. So màu ở bước súng 540 nm [9].
Chuẩn bị thuốc thử:
Dung dịch sunfanylamide: cõn 0,6 g NH2C6H4SO2NH2 hũa tan trong 50 ml nước cất núng, làm lạnh, thờm 40 ml HCl đặc và định mức đến 100 ml.
Dung dịch naphtylendiamine dihydrochloride: cõn 0.1 g C10H7NHCH2NH2.2HCl hũa tan trong 100 ml nước cất, đựng trong chai màu nõu, bảo quản 4oC.
Lập đường chuẩn:
Chuẩn bị cỏc ống thớ nghiệm.
Hũa tan 1,23 g NaNO2 trong 1000 ml nước cất. Dung dịch gốc cú nồng độ N- NO2 là 250 mg/l.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn cú nồng độ 1 mg/l bằng cỏch pha loóng dd gốc. Lập cỏc nồng độ khỏc nhau từ 0; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 mg/l.
Lấy 10 ml mỗi nồng độ vào cỏc ống nghiệm khỏc nhau. Thờm 0,2 ml NH2C6H4SO2NH2.
Trộn đều và giữ yờn trong 5 phỳt. Thờm 0,2 ml C10H7NHCH2NH2.2HCl. Trộn đều và giữ yờn trong 10 phỳt. So màu ở bước súng 540 nm.
Ngụ Thị Kim Toỏn 31 K19 – Sinh học thực nghiệm
2.3.8. Phương phỏp đỏnh giỏ khả năng xử lý photpho
Khả năng tớch lũy photpho của cỏc chủng được đỏnh giỏ thụng qua sự giảm nồng độ của PO4- trong mụi trường nuụi cấy theo thời gian.
Chuẩnbịthuốcthử:
Chuẩn bị dung dịch (NH4)6Mo6
Hũa tan 7,27 g amonium molydat (NH4)6Mo7O2.4H2O (sấy ở 105oC trong 3 giờ) vào 150 ml nước cất.
Hũa tan 0,0945 g Kaly antimon tactrat (C8H8O12K2.Sb2O2.H2O) trong 50ml nước cất.
96 ml H2SO4 đặc vào bỡnh chứa 600 ml nước cất sau đú làm lạnh đến nhiệt độ phũng.
Trộn cỏc dung dịch trờn với nhau
Thờm vào 10 g amonium amidosulfat (NH4OSO2NH2) vào hỗn hợp dung dịch trờn
Định mức đến 1000 ml
Chuẩn bị dung dịch C6H8O6: Hũa tan 1.8 g C6H8O6 trong 25 ml nước, sử dụng trong vũng 2 tuần.
Lập đường chuẩn
Chuẩn bị dóy cỏc dung dịch gồm 5 điểm vào 5 ống nghiệm cú chia vạch Dung dịch gốc 100 mg/l: hũa tan 0,4394g KH2PO4 trong 100 ml nước cất. Dung dịch chuẩn: pha loóng dung dịch gốc 20 lần ta được dung dịch chuẩn 5 mg/l. Lấy dung dịch chuẩn theo tỷ lệ nồng độ sau:
Nồng độ (mg/l) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Vdd chuẩn (ml) 0 2 4 6 8 10
Sau khi tiến hành lấy dung dịch chuẩn và lấy mẫu vào ống nghiệm định mức tới 40 ml
Thờm 1 ml dung dịch C6H8O6 Thờm 5 ml dung dịch (NH4)6Mo6 Định mức tới 50 ml
Ngụ Thị Kim Toỏn 32 K19 – Sinh học thực nghiệm
Điều nhiệt trong khoảng từ 30 đến 40oC trong thời gian từ 10 đến 20 phỳt Đo mẫu tại bước súng 710 nm
2.3.8.1. Phương phỏp phõn tớch photpho tổng
Nguyờn tắc: Amonium molydat và kali antimon tatrat phản ứng với PO43- trong mụi trường axit trung bỡnh tạo thành axit photpho molipdic cú màu xanh đậm đo màu ở bước súng 710 nm trờn mỏy quang phổ UV – VIS [9].
Xử lý mẫu:
Lấy 10 ml mẫu vào bỡnh cú nỳt 100 ml
Thờm 5 ml K2S2O8 (4 g K2S2O8 trong 100 ml nước) Thờm 1 ml H2SO4 30%
Đun ở 120oC trong 30 phỳt
Sau đú chuyển toàn bộ mẫu đó đun vào trong bỡnh định mức tới 50 ml bằng nước cất. Lấy 10 ml mẫu này cho vào bỡnh định mức 50 ml
Thờm 5 ml dung dịch (NH4)6Mo6 vào ống và chuẩn về 40 ml Thờm 1 ml dung dịch C6H8O6
Định mức tới 50 ml bằng nước cất.
Điều nhiệt trong khoảng từ 30 đến 40oC trong thời gian từ 10 đến 20 phỳt Đo mẫu tại bước súng 710 nm
Mẫu đối chứng được làm tương tự để đối chiếu lại kết quả. Tớnh toỏn kết quả
C= Cđo 50/10 50/10 (mg/l)
Trong đú: C: nồng độ dung dịch mẫu thực (mg/l)
Cđo: nồng độ dung dịch mẫu đo từ ống nghiệm (mg/l).
2.3.8.2. Phương phỏp phõn tớch hàm lượng Ortho photphate (PO43-)
Lấy 10 ml mẫu cho vào bỡnh định mức 50 ml
Thờm 5 ml dung dịch (NH4)6Mo6 vào ống và chuẩn về 40 ml Thờm 1 ml dung dịch C6H8O6
Định mức tới 50 ml bằng nước cất.
Ngụ Thị Kim Toỏn 33 K19 – Sinh học thực nghiệm
Đo tại bước súng 710 nm
Mẫu đối chứng được làm tương tự để đối chiếu lại kết quả. C= Cđo 50/10 (mg/l)
Trong đú: C: nồng độ dung dịch mẫu thực (mg/l)
Cđo: nồng độ dung dịch mẫu đo từ ống nghiệm (mg/l).
2.3.9. Phương phỏp phõn loại vi sinh vật dựa trờn gen 16S rRNA
Cỏc chủng vi sinh vật cú khả năng xử lý nitơ và photpho được phõn tớch trỡnh tự gen 16S rRNA để xỏc định cõy phõn loại.