Với cỏc chủng vi sinh vật phõn lập trờn mụi trường Winogradsky 2, chỳng tụi cũng tiến hành cỏc thớ nghiệm tương tự. Khả năng chuyển húa nitrite được đỏnh giỏ thụng qua hàm lượng NO2- giảm theo thời gian nghiờn cứu. 3 chủng B21.1, B21.10, B23.2 được nuụi lắc trong mụi trường Winogradsky 2.
Hỡnh 3.6. Khả năng chuyển húa nitrite của cỏc chủng nghiờn cứu
Với hàm lượng nitrite trong mẫu ban đầu là 80 mg/l. Kết quả hỡnh 3.6 cho thấy cả ba chủng nghiờn cứu đều cú khả năng chuyển húa nitrite, sau 5 ngày, nồng độ NO2- trong dịch nuụi lắc của chủng B21.10 giảm đi 75.23% so với mẫu ban đầu, tương ứng, hai chủng B23.2 và B21.1 là 69.07% và 7.26%. Chủng B21.1 cú khả năng chuyển húa NO2- nhưng khả năng chuyển húa chậm hơn, sau 20 ngày hàm lượng NO2- trong dung dịch giảm đi 75% so với mẫu ban đầu trong khi hai chủng B21.10 và B23.2 đó chuyển húa gần như hoàn toàn lượng NO2- cú trong mẫu lắc.
Ngụ Thị Kim Toỏn 40 K19 – Sinh học thực nghiệm
Kết quả, sau 20 ngày hai chủng B21.10 và B23.2 đó chuyển húa được trờn 97% lượng NO2- cú trong mẫu. Từ kết quả này, chỳng tụi đó lựa chọn ra hai chủng B21.10 và B23.2 cho cỏc thớ nghiệm nghiờn cứu tiếp theo.
3. 2. Nghiờn cứu cỏc chủng vi sinh vật cú khả năng xử lý photpho.
3.2.1. Phõn lập chủng vi sinh vật cú khả năng xử lý photpho và cú khả năng hỡnh thành màng sinh học.
3.2.1.1. Phõn lập cỏc chủng vi sinh vật cú khả năng xử lý photpho
Mẫu nước thải từ bể biogas và nước thải khu xử lý rỏc thải khi phõn lập trờn mụi trường AMM thu được cỏc khuẩn lạc chủ yếu màu trắng đục, hơi vàng, khuẩn lạc trũn (Hỡnh 3.7). Dựa vào kớch thước, màu sắc và hỡnh dạng, chỳng tụi đó thu được 21 chủng với ký hiệu như bảng 3.3.
Hỡnh 3.7. Một số khuẩn lạc phõn lập trờn mụi trường AMM: mẫu khu vực biogas (A) và khu tập trung rỏc thải (B)
Kết quả phõn lập ở bảng 3.3 cho thấy, cõc chủng phõn lập ở tầng giữa bể biogas cao hơn so với tầng đỏy, trong khu vực tập trung rỏc thải cao hơn so với bờn ngoài khu vực.
Ngụ Thị Kim Toỏn 41 K19 – Sinh học thực nghiệm
Bảng 3.3. Địa điểm và số lượng cỏc chủng vi sinh vật cú khả năng tớch lũy photpho Địa điểm thu mẫu Mẫu thu được Ký hiệu
Nước thải từ bể biogas 13 chủng
Từ A1.1 dến A1.8 Từ A2.1 đến A2.2 Từ A3.1 đến A3.3 Nước thải từ khu tập trung
rỏc thải 8 chủng
Từ A4.1 đến A4.3 Từ A5.1 đến A5.5
3.2.1.2.Khả năng hỡnh thành màng sinh học của cỏc chủng phõn lập
Tiến hành cỏc thớ nghiệm tương tự về xỏc định khả năng hỡnh thành màng sinh học của cỏc chủng phõn lập từ mụi trường AMM. Kết quả trờn hỡnh cho thấy, chủng A4.2, A5.1, A5.2, A5.3 là bốn chủng cú khả năng hỡnh thành màng sinh học tốt nhất (Hỡnh 3.8). Do vậy chỳng tụi đó lựa chọn 4 chủng này cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
Hỡnh 3.8. Khả năng hỡnh thàng màng sinh học của cỏc chủng vi sinh vật cú khả năng tớch lũy photpho
Ngụ Thị Kim Toỏn 42 K19 – Sinh học thực nghiệm
3.2.2. Khả năng xử lý photpho của cỏc chủng nghiờn cứu.
Đỏnh giỏ khả năng giảm hàm lượng photpho, chỳng tụi đỏnh giỏ thụng qua hàm lượng photphate tớch lũy trong vi sinh vật. Chỳng tụi tiến hành nuụi cấy lắc cỏc chủng nghiờn cứu trong mụi trường AMM trong thời gian 10 ngày ở cỏc điều kiện tối ưu về pH và nhiệt độ. Để đỏnh giỏ khả năng tớch lũy photpho của vi sinh vật, chỳng tụi phõn tớch, đỏnh giỏ thụng qua hàm lượng photphate cũn lại trong mụi trường.
Hỡnh 3.9. Khả năng xử lý photpho của cỏc chủng nghiờn cứu trong mụi trường với hàm lượng photpho 6mg/l
Kết quả hỡnh 3.9 cho thấy, với hàm lượng photpho trong dung dịch AMM ban đầu là 6mg/l, cỏc chủng vi sinh vật đều cú khả năng tớch lũy photpho, sau 10 ngày, lượng photpho trong dung dịch nuụi lắc gần như khụng cũn được phỏt hiện. Cỏc chủng A5.1, A5.2 và A5.3 sau 5 ngày đó khụng cũn phỏt hiện thấy photphate cú trong dung dịch nuụi cấy, tương ứng với chủng A4.2 là 7 ngày.
Từ kết quả như vậy, chỳng tụi đó tiến hành tăng hàm lượng photphate trong mụi trường nuụi cấy lờn 18mg/l (Hỡnh 3.10). Kết quả phõn tớch cho thấy, sau 5 ngày, hàm lượng photphate trong dịch nuụi của 2 chủng A4.2 và A5.1 giảm đi cao nhất trong khoảng 25%. Hàm lượng photphate tiếp tục giảm sau 5, 7 và 10 ngày.
Ngụ Thị Kim Toỏn 43 K19 – Sinh học thực nghiệm
Sau 10 ngày, chủng A4.2 cú hàm lượng photphate giảm đi lớn nhất, lượng photphate giảm đi là 39,32% so với dịch mẫu ban đầu. Cỏc chủng A5.1, A5.2 và A5.3 hàm lượng photphate giảm đi trong dịch mẫu lần lượt là 34,88%, 21,78% và 17,95%. Từ cỏc kết quả này, chỳng tụi đó lựa chọn chủng A4.2 cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo. Đõy là những kết quả bước đầu cho nghiờn cứu, ứng dụng màng biofilm vào xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ, photpho từ cỏc chủng vi sinh vật phõn lập tại Việt Nam.
Hỡnh 3.10. Khả năng xử lý photpho của cỏc chủng nghiờn cứu trong mụi trường hàm lượng photpho18mg/l
3. 3. Cỏc đặc điểm hỡnh thỏi, sinh lý, sinh húa của cỏc chủng nghiờn cứu
3.3.1. Khả năng tạo hỡnh thành màng sinh học trờn một số giỏ thể
Bốn chủng cú khả năng chuyển húa hợp chất chứa nitơ và photpho tốt nhất là B11.11, B21.10, B23.2 và A4.2 được chỳng tụi xỏc định khả năng tạo biofilm trờn một số giỏ thể, chất mang.
Để xỏc định khả năng hỡnh thành màng sinh học trờn giỏ thể nhựa (ống eppendorf) chỳng tụi dựa vào phương phỏp nhuộm tớm kết tinh.
Kết quả nhuộm tớm kết tinh trờn ống eppendorf cho thấy cả 4 chủng đều tạo biofilm tốt trờn giỏ thể nhựa, trong đú chủng B11.11 cú khả năng tạo biofilm tốt
Ngụ Thị Kim Toỏn 44 K19 – Sinh học thực nghiệm
nhất. Điều này cho thấy cỏc chủng này ngoài khả năng tạo biofilm trong mụi trường dịch thể thỡ cũng cú thể tạo biofilm trờn cỏc giỏ thể khỏc nhau (Hỡnh 3.11, 3.12). Kết quả nảy tương tự như kết quả nghiờn cứu của Nguyễn Quang Huy và cộng sự trước đõy về cỏc chủng vi sinh vật tạo màng phõn lập tại cỏc khu vực ụ nhiễm làng nghề hay rỉ rỏc [26], [32] .
Hỡnh 3.11. Khả năng hỡnh thành biofilm trờn giỏ thể nhựa ống eppendorf.
Bằng phương phỏp quan sỏt màng biofilm nổi, chỳng tụi nhận thấy cỏc chủng khỏc nhau thỡ khả năng hỡnh thành màng sinh học khỏc nhau trong mụi trường lỏng, chủng B21.10 và A4.2 màng sinh học trải đều khắp bề mặt của mụi trường lỏng, trong khi đú, màng sinh học của hai chủng B11.11, B23.2 khụng tập trung toàn bộ trờn bề mặt mụi trường (Hỡnh 3.12).
Hỡnh 3.12. Màng biofilm nổi của chủng B11.11, B21.10, B23.2, A4.2.
Ngụ Thị Kim Toỏn 45 K19 – Sinh học thực nghiệm
3.3.2. Đặc điểm hỡnh thỏi của cỏc chủng nghiờn cứu
Để bước đầu nghiờn cứu, phõn loại cỏc chủng cú khả năng xử lý nước thải giàu nitơ, photpho, chỳng tụi tiến hành nhuộm Gram và quan sỏt dưới kớnh hiển vi quang học cú độ phúng đại 1000 lần.
Hỡnh 3.13. Ảnh nhuộm Gram cỏc chủng nghiờn cứu ở độ phúng đại 1000 lần.
Quan sỏt dưới kớnh hiển vi quang học ở độ phúng đại 1000 lần, chỳng tụi thấy, cỏc chủng nghiờn cứu đều cú hỡnh que, xếp thành chuỗi (Hỡnh 3.13).
Chỳng tụi cũng tiến hành quan sỏt hỡnh thỏi màng sinh học và tế bào vi khuẩn qua kớnh hiển vi điện tử quột JSM – 5421LV ở độ phúng đại 10000 lần.
Hỡnh 3.14. Cấu trỳc hiển vi màng biofilm của chủng nghiờn cứu ở độ phúng đại
10000 lần
Khi quan sỏt dưới kớnh hiển vi điện tử quột ở độ phúng đại 10000 lần, nhận thấy cỏc tế bào cú hỡnh dạng khỏc biệt nhau rất rừ và màng sinh học tạo thành cũng cú sự khỏc biệt. Chủng B11.11 cú màng sinh học dày, lớp EPS ngoại bào bao xung quanh tế bào, khi thu nhận thỡ nhận thấy lớp màng khỏ nhầy, rất dai, lớp màng khụng đồng đều trờn bề mặt, màu vàng nhạt. Chủng B21.10 lớp màng sinh học
Ngụ Thị Kim Toỏn 46 K19 – Sinh học thực nghiệm
tương đối đồng nhất, khụng gian ba chiều phức tạp, nhiều lớp cuộn vào nhau, khi thu nhận thỡ biofilm dễ bị cắt nhỏ hơn của chủng B11.11, cú màu trắng đục. Chủng B23.2, màng sinh học hỡnh thành lớp rất mỏng, trong suốt, sần sựi. Chủng A4.2 cỏc tế bào xếp sớt nhau, hỡnh trực khuẩn, khi thu nhận biofilm dễ bị phõn mảnh, đứt gẫy, màu trắng đục (Hỡnh 3.14).
3.3.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố mụi trường lờn sự hỡnh thành màng sinh học học
Quỏ trỡnh hỡnh thành màng sinh học trải qua nhiều giai đoạn và chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố mụi trường. Trong đú nhiệt độ và pH là hai yếu tố ảnh hưởng đến sự phỏt triển của vi sinh vật lớn nhất.
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng trong sự phỏt triển của vi sinh vật, sự hỡnh thành màng sinh học, yếu tố nhiệt độ đúng một vai trũ khụng thể thiếu trong sự hỡnh thành màng. Khi tiến hành nghiờn cứu màng sinh học ở cỏc điều kiện nhiệt độ khỏc nhau của vi khuẩn Salmonella enteritidis, Giaouris và cộng sự đó chỉ ra khả năng hỡnh thành màng sinh học tốt nhất của vi khuẩn này khỏ thấp, chỉ là 20oC [24]. Trong nghiờn cứu của Di Bonaventura cựng cộng sự, vi khuẩn
Stenotrophomonas maltophilia cú khả năng tạo màng sinh học tốt nhất ở 32oC [20]. Những nghiờn cứu này cho thấy mỗi chủng vi sinh vật cú khả năng tạo màng sinh học tốt nhất ở cỏc nhiệt độ khỏc nhau.
Ngụ Thị Kim Toỏn 47 K19 – Sinh học thực nghiệm
Kết quả thử khả năng hỡnh thành màng sinh học ở cỏc điều kiện nhiệt độ khỏc nhau (Hỡnh 3.15) cho thấy, hai chủng B11.11 và B21.10 cú khả năng hỡnh thành màng sinh học tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ là 37oC, chủng B23.2 cú khả năng hỡnh thành màng sinh học tốt trong dải nhiệt độ khỏ rộng từ 37 đến 50oC, điều kiện nhiệt độ tốt nhất cho sự hỡnh thành màng sinh học của chủng A4.2 là 50oC.
Khi nghiờn cứu cỏc điều kiện cho vi sinh vật phỏt triển thỡ một trong những yếu tố được quan tõm là giỏ trị pH. Ở cỏc pH khỏc nhau, mức độ sinh trưởng của vi sinh vật cũng rất khỏc nhau và điều này cú thể ảnh hưởng đến sự phỏt triển của vi sinh vật và hỡnh thành màng sinh học của bản thõn chỳng. Vi sinh vật chỉ cú thể phỏt triển trongmột khoảng pH nhất định, khi pH mụi trường nằm ngoài khoảng cho phộp, vi sinh vật sẽ phỏt triển yếu đi hoặc cú thể bị ức chế hoàn toàn. Cỏc chủng vi sinh vật khỏc nhau cú khoảng pH phỏt triển khỏc nhau do đú ảnh hưởng tới khả năng tạo màng sinh học.
Hỡnh 3.16. Ảnh hưởng của pH mụi trường lờn khả năng hỡnh thành màng sinh học
Kết quả thử khả năng tạo màng của cỏc chủng nghiờn cứu cho thấy, hầu hết cỏc chủng đều cú khả năng tạo màng sinh học tốt ở điều kiện pH kiềm khoảng 7,5, chủng A4.2 cú khả năng tạo màng tốt ở pH 7, chủng B21.10 cú khả năng tạo màng sinh học tốt ở pH 8 (Hỡnh 3.16). Theo nghiờn cứu của Wulff và cộng sự [65] đối với sự phỏt triển và hỡnh thành màng sinh học của vi khuẩn Xylella fastidiosa nhận thấy
Ngụ Thị Kim Toỏn 48 K19 – Sinh học thực nghiệm
rằng sự hỡnh thành màng sinh học chịu ảnh hưởng lớn của giỏ trị pH, với vi khuẩn này, khả năng hỡnh thành màng sinh học tốt nhất ở pH 6.8, và bị ức chế hỡnh thành màng ở pH dưới 6.6. Kết quả này phự hợp với nghiờn cứu, cỏc chủng phõn lập từ nước thải bể biogas và khu tập trung xử lý rỏc thải thường phỏt triển tốt ở pH trong khoảng từ 7 đến 8.5 [10].
3.3.4. Khả năng chuyển húa một số chất trong bộ kit APi
Để nghiờn cứu một số tớnh chất về mặt sinh húa, chỳng tụi đó sử dụng kit thử APi. Cỏc chất trong bộ kit dựng để kiểm tra khả năng sử dụng cỏc vi sinh vật là cỏc nguồn cacbon khỏc nhau (D-glucose, L-arabinose, D- mannose, D- mannitol, N- acetyl- glucosamine…), urea, L-tryptophan, L-arginine, gelatine…Kết quả được trỡnh bày ở bảng 3.4:
Bảng 3.4. Một số đặc điểm sinh hoỏ của cỏc chủng theo kit APi (BioMộrieus)
Ký hiệu chất kiểm tra
Cỏc chất chuyển húa
Cỏc chủng vi sinh vật nghiờn cứu B11.11 B21.10 B23.2 A4.2
NO3 KNO3 + + + +
TRP L- tryptophan - - - -
ADH L- arginine + - + +
URE Urea - - + -
ESC Esculin ferric citrate + + + +
GEL Gelatine + + - + PNPG 4-nitrophenyl β D – galactopyranoside + + + + GLU D- glucose + + + + ARA L- arabinose - + - + MNE D- mannose + + + +
Ngụ Thị Kim Toỏn 49 K19 – Sinh học thực nghiệm
Chỳ thớch (-): phản ứng õm tớnh, (+) phản ứng dương tớnh
Với kớ hiệu dấu (-) biểu thị cho phản ứng õm tớnh, dấu (+) biểu thị cho phản ứng dương tớnh với sự chuyển húa cỏc hợp chất hữu cơ. Kết quả cho thấy, cỏc chủng B11.11, B21.1, B23.2 và A4.2 cú thể sử dụng nhiều cơ chất khỏc nhau, đặc biệt chủng A4.2 và B23.2 cú khả năng sử dụng hầu hết cỏc loại đường, chủng B11.11 khụng cú khả năng sử dụng L – arabinose, chủng B21.10 khụng sử dụng được L – arabinose, N – acetyl – glucosamine và D – mantose (Bảng 3.4). Khi tiến hành phõn tớch trờn phần mềm của BioMộrieus, chủng B23.2 cú khả năng thuộc chi
Pseudomonas.
Với khả năng sử dụng cỏc loại đường khỏc nhau, cỏc chủng vi sinh vật này cú khả năng sử dụng nhiều nguồn cacbon thay thế khỏc nhau, việc thay thế nguồn cacbon từ vật liệu cú chi phớ và giỏ thành cao sang cú chi phớ phự hợp sẽ giỳp cho quỏ trỡnh đưa sản phẩm vào ứng dụng rộng rói hơn. Cỏc chủng nghiờn cứu xử lý nước thải cú chứa nitơ đều cú khả năng khử NO3- cho thấy phự hợp với nghiờn cứu, chủng A4.2 là chủng cú khả năng xử lý photpho, tuy nhiờn, kết quả trờn bảng cho thấy, chủng này cũng cú khả năng khử NO3-, theo nghiờn cứu của Jorgensen và Pauli cho rằng cỏc chủng cú khả năng tớch lũy photphate cũng cú khả năng chuyển húa nitơ [33].
MAN D- mannitol + + + +
NAG N- acetyl- glucosamine + + - +
MAL D- mantose + + - +
GNT Potassium gluconate - - + +
CAP Axit capric - - + -
ADI Axit Adipic - - - -
MLT Axit Malic + - + +
CIT Trisodium Citrate - - + +
Ngụ Thị Kim Toỏn 50 K19 – Sinh học thực nghiệm
3.3.5. Trỡnh tự 16S rRNA và cõy phỏt sinh chủng loại
Chỳng tụi tiếp tục tiến hành giải trỡnh tự gen mó húa 16S rARN. Kết quả giải trỡnh tự gen 16S rARN được so sỏnh với cỏc trỡnh tự gen 16S rARN trong ngõn hàng gen quốc tế dựa vào phần mềm Clustal X. Trờn cơ sở đú, chỳng tụi xõy dựng cõy chủng loại phỏt sinh dựa vào phần mềm njplot
Trỡnh tự gen mó húa 16S rARN của chủng B11.11 tương đồng 99,9 % (1399/1400 bp) với đoạn gen 16S rARN của vi khuẩn Bacillus licheniformis_X68416; tương đồng 99,6 % (1394/1400 bp) với đoạn gen 16S rARN
của vi khuẩn Bacillus sonorensis_AF302118; tương đồng 99,4 % (1391/1400 bp) với đoạn 16S rARN của vi khuẩn Bacillus aerius_AJ831843 (Hỡnh 3.17). Theo
nghiờn cứu của Kim và cộng sự, cựng với hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis và
Bacillus cereus, Bacillus licheniformis là một trong cỏc chủng thuộc chi Bacillus cú
khả năng nitrate húa và khử nitrate trong điều kiện hiếu khớ, và lượng amoni đó chuyển sang khớ N2 là 33% sau 4 giờ nuụi cấy [34].
Hỡnh 3.17. Sơ đồ cõy phỏt sinh chủng loại của chủng B11.11
Staphylococcus aureus_X68417
Bacillus aerophilus_AJ831844
Bacillus stratosphericus_AJ831841
Bacillus altitudinis_AJ831842 99
Bacillus pumilus_AY876289
Bacillus safensis_AF234854
99 100
Bacillus aerius_AJ831843
Bacillus licheniformis_X68416
B11.11
100
Bacillus sonorensis_AF302118 63
Bacillus atrophaeus_AB021181
Bacillus siamensis_GQ281299
Bacillus amyloliquefaciens_AB255669
Bacillus methylotrophicus_EU194897 57
Bacillus vallismortis_AB021198
Bacillus mojavensis_AB021191
Bacillus subtilis_AB042061
Bacillus subtilis subsp spizizenii_AF 54 78 88 52 81 100 97 100 99 0.01
Ngụ Thị Kim Toỏn 51 K19 – Sinh học thực nghiệm
Hỡnh 3.18. Sơ đồ cõy phỏt sinh chủng loại của chủng B21.10
Kết quả giải trỡnh tự gen 16S rARN của chủng B21.10 tương đồng 99,8%