Màng sinh học tỏc động đến rất nhiều lĩnh vực trong cuộc sống hàng ngày. Do vậy nhiều nghiờn cứu hiện nay về màng sinh học cú ý nghĩa thực tiễn quan trong và ngày càng thu hỳt sự quan tõm của nhiều nhà khoa học. Một số ứng dụng cụ thể của màng sinh học núi riờng và cỏc chủng vi sinh vật tạo màng sinh học núi chung là xử lý ụ nhiễm.
Trong cụng nghiệp lờn men tại cỏc bể lờn men là nơi giữ lại sinh khối vi sinh vật. Thụng thường cỏc tế bào ở dạng tự do khú cú khả năng được giữ lại trong cỏc bồn lờn men sau mỗi mẻ xử lý. Khi đú để tiếp tục một qui trỡnh mới lại phải bổ sung thờm một lượng sinh khối nhất định và đợi thời gian để vi sinh vật cú thể sinh trưởng, phỏt triển tới một nồng độ nhất định mới. Qui trỡnh này gõy tốn kộm ở khõu nguyờn liệu đầu vào cũng như mất thời gian vận hành. Ngược lại khi đó được bỏm giữ trờn bề mặt giỏ thể bằng mạng lưới biofilm sinh khối vi sinh vật cú thể được giữ lại một cỏch cú hiệu quả sau mỗi mẻ xử lý. Những giỏ thể chất mang cú sẵn mạng lưới biofilm cú thể được tỏi sử dụng ở những lần xử lý tiếp theo mà khụng phải bổ sung thờm vi sinh vật cũng như đợi thời gian phỏt triển [29].
Dầu thụ và cỏc sản phẩm từ dầu được loại bỏ bởi cỏc vi khuẩn phõn hủy hydrocarbon. Cỏc vi khuẩn được sử dụng cú thể được thả trực tiếp xuống vựng dầu tràn hoặc cú thể thả ở vựng ven bờ mà dầu tràn bị súng đỏnh vào. Lý do chớnh ở đõy là biofilm giỳp tăng hiệu quả lọc nước và làm tăng độ kết dớnh của vi sinh vật với bề mặt giỏ thể nơi cú dầu tràn. Trong nghiờn cứu của Radwan và cộng sự, khi sử dụng cỏc vi khuẩn thuộc chi Acinetobacter và dựng một lớp phủ làm giỏ thể cho vi khuẩn là tảo, kết quả đó làm giảm được 64-98% n-octadecane và khoảng 38-56% phenanthrene từ mụi trường cú chứa 0,03% của hydrocarbon sau 2 tuần [50]. Trong nghiờn cứu của Lờ Thị Nhi Cụng cựng cộng sự, đó phõn lập từ biển nhúm vi khuẩn
Ngụ Thị Kim Toỏn 21 K19 – Sinh học thực nghiệm
tạo biofilm và cú hoạt tớnh chuyển húa cỏc chất hydrocacbon thơm đa vũng như napthalene, anthracene, pyren [17].
Một trong những ứng dụng của màng sinh học đang được quan tõm liờn quan đến việc làm sạch nguồn nước thải, nguồn nước ngầm bằng cụng nghệ sinh học. Ứng dụng này bắt nguồn từ thực tế là bản thõn vi sinh vật cú khả năng phõn hủy cỏc chất hữu cơ trong mụi trường tự nhiờn thành cỏc chất vụ cơ đơn giản, ớt độc. Đó cú nhiều phương phỏp xử lý nước thải bao gồm những giai đoạn xử lý mà trong đú nước thải được lọc qua cỏc biofilm nhằm mục đớch tỏch và đồng húa cỏc hợp chất hữu cơ cú hại. Một lượng sinh khối lớn cỏc vi sinh vật trong mạng lưới biofilm làm tăng sự hợp tỏc trong quỏ trỡnh trao đổi chất, giỳp cho quỏ trỡnh loại bỏ cỏc chất gõy ụ nhiễm trong nước diễn ra hiệu quả hơn so với dạng sống tự do. Quỏ trỡnh phõn hủy cỏc chất cũng tỏ ra hiệu quả hơn khi thường sản phẩm của chủng này lại là cơ chất cho một chủng khỏc trong mạng lưới biofilm, vớ dụ trong một mạng lưới biofilm xử lý nước thải cú chứa hợp chất nitơ, ion NH4+ được nhúm Nitrosomonas,
Nitrobacter chuyển húa thành ion NO3-, rồi tiếp tục được cỏc nhúm vi khuẩn yếm khớ khỏc sử dụng để cuối cựng tạo thành N2 đi vào khớ quyển [37].
Một số nghiờn cứu về vi khuẩn anammox cú khả năng xử lý nitơ trong nước thải, đó chỉ ra rằng trong hệ thống cỏc lớp siờu mỏng của lớp màng biofilm của chủng vi khuẩn Planctomycetes cú sự phõn bố oxy theo lớp. Cỏc lớp phớa trờn là những lớp giàu oxy trong khi cỏc lớp ở phớa dưới cựng nằm trong trạng thỏi kị khớ. Sự phõn chia theo lớp màng sinh học sẽ tạo điều kiện thuận lợi trong quỏ trỡnh ứng dụng xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ vỡ giai đoạn nitrate húa là giai đoạn hiếu khớ, giai đoạn khử nitrate là giai đoạn kị khớ [52].
Những nghiờn cứu về biofilm trong xử lý nước thải cú chứa cỏc hợp chất nitơ và photpho của Boelee và cộng sự, cỏc nhà nghiờn cứu đó sử dụng màng sinh học của vi tảo để thực hiện nghiờn cứu này. Kết quả cho thấy, màng sinh học được thiết kế dựa vào cỏc vi tảo đó xử lý được nitơ là 1.0 g/m2/ngày và photpho là 0.13 g/m2/ngày [13].
Ngụ Thị Kim Toỏn 22 K19 – Sinh học thực nghiệm
Wellander và cộng sự khi sử dụng một vật liệu bỏm sinh khối, thả nổi trong hệ thống xử lý làm giỏ thể cho cỏc vi sinh vật cú khả năng nitrate húa, đó loại bỏ được đến 90% lượng nitơ tổng số [64]. Hoilijoki và cộng sự đó nghiờn cứu khả năng nitrate húa của vi sinh vật thuộc nhúm nitrate húa. Kết quả cho thấy, quỏ trỡnh nitrate húa chỉ xử lý được 61% amoni khi khụng cú vật liệu bỏm cho vi sinh vật, và quỏ trỡnh nitrate húa xảy ra hoàn toàn khi cú vật liệu bỏm cho vi sinh vật trong bể phản ứng bựn hoạt tớnh [30]. Kết quả này cho thấy, quỏ trỡnh xử lý nước thải sử dụng màng sinh học sẽ tăng hiệu quả xử lý khi cú mặt vật liệu bỏm cho vi sinh vật.
Bernet và cộng sự đó nghiờn cứu ứng dụng khả năng chuyển húa nitơ và tạo màng sinh học của vi sinh vật. Mẫu ban đầu cú hàm lượng NH4+ là 250 mg/l, sau 2 ngày, hàm lượng NH4+ giảm xuống chỉ cũn 5 mg/l, hiệu quả của quỏ trỡnh xử lý lờn đến 98% [12].
Kết quả nghiờn cứu ứng dụng vi sinh vật cú khả năng tạo màng sinh học trong xử lý ụ nhiễm nước thải đặc biệt là nước thải giàu nitơ và photpho hiện nay chưa nhiều. Cỏc cụng trỡnh cụng bố liờn quan đến lĩnh vực ứng dụng nghiờn cứu này chưa nhiều, cũn thiếu cả về số lượng lẫn chất lượng. Tại Việt Nam tỡnh hỡnh ụ nhiễm nước thải ngày một gia tăng do đú việc cấp thiết là tỡm một phương phỏp xử lý hiệu quả là cần thiết. Vỡ vậy, để phự hợp với mục đớch nghiờn cứu và ứng dụng xử lý ụ nhiễm tại Việt Nam, chỳng tụi đó tiến hành thực hiện đề tài phõn lập nghiờn cứu cỏc chủng vi sinh vật cú khả năng tạo màng sinh học và cú khả năng xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ, photpho với mục tiờu:
Phõn lập cỏc chủng cú hoạt tớnh tạo biofilm mạnh đồng thời cú khả năng xử lý nitơ và photpho
Bước đầu nghiờn cứu tối ưu cỏc điều kiện cho sự sinh trưởng phỏt triển của cỏc chủng vi sinh vật này để cú thể ỏp dụng trong cụng nghệ xử lý nước thải giàu nitơ và photpho
Ngụ Thị Kim Toỏn 23 K19 – Sinh học thực nghiệm
CHƯƠNG 2: NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. Nguyờn liệu
Cỏc mẫu nước thải từ bể Biogas tại Vĩnh Yờn – Vĩnh Lộc – Thanh Húa với vị trớ thu mẫu và được ký hiệu là cỏc mẫu số 1,2, 3:
Nước thải lấy từ tầng giữa bể biogas đó ngưng sử dụng: mẫu số 1 Nước thải lấy từ tầng đỏy bể biogas đó ngưng sử dụng: mẫu số 2 Nước thải trực tiếp chảy ra từ bể biogas đang sử dụng: mẫu số 3
Mẫu nước thải rỉ rỏc ở khu tập trung xử lý rỏc thải Vạn Phỳc – Hà Đụng – Hà Nội với hai vị trớ thu mẫu là trong và ngoài khu tập trung xử lý rỏc thải được ký hiệu là mẫu số 4 và số 5.
Cỏc mẫu sau khi lấy được chuyển về Phũng thớ nghiệm Trọng điểm cụng nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiờn phõn tớch.
2.2. Húa chất, thiết bị 2.2.1. Mụi trường nuụi cấy 2.2.1. Mụi trường nuụi cấy
Mụi trường Winogradsky được sử dụng để phõn lập vi sinh vật trong quỏ trỡnh nitrate húa.
Mụi trường Winogradsky 1 Mụi trườngWinogradsky 2 (NH4 )2SO4 2 g NaNO2 1 g MgSO4 0,5 g MgSO4 0,5 g NaCl 2 g NaCl 0.3 g K2HPO4 1 g K2HPO4 1 g CaCO3 0,001 g NaCO3 1 g FeSO4 0,4 g FeSO4 0,03 g Thạch 15 g Thạch 15 g Nước cất 1 lớt Nước cất 1 lớt
Mụi trường acetate mineral medium (AMM) được sử dụng để phõn lập vi sinh vật cú khả năng xử lý photpho:
Ngụ Thị Kim Toỏn 24 K19 – Sinh học thực nghiệm Na2HPO4: 28,73 mg NH4Cl: 57,27 mg MgSO4: 131,82 mg K2SO4: 26,74 mg CaCl2. 2H2O: 17,2 mg HEPES: 12 g Dung dịch khoỏng: 2 ml Thạch: 15 g Nước cất: 1 lit Dung dịch khoỏng gồm: EDTA: 50 g FeSO4. 7H2O: 5 g CuSO4. 5H2O: 1,6 g MnCl2. 4H2O: 5 g (NH4)6Mo7O24. 4H2O: 1,1 g H3BO3: 50 mg KI: 10 mg CoCl2. 6H2O: 50 mg Nước cất: 1 lit
Mụi trường Luria Betani (LB) (g/l)
Peptone 10 g
Cao nấm men 5 g
NaCl 10 g
Nước cất 1 lit (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cỏc mụi trường được khử trựng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 20 phỳt. Cỏc húa chất khỏc đều đạt độ tinh khiết cho nghiờn cứu.
2.2.2. Mỏy múc thiết bị
Nồi khử trựng (ALP–Nhật). Mỏy lắc (Satorius–Đức).
Ngụ Thị Kim Toỏn 25 K19 – Sinh học thực nghiệm
Box cấy vi sinh vật (Aura vertical–í). Mỏy đo mật độ quang học (Bionate–Anh). Mỏy đo pH (Horiba–Nhật Bản).
Cõn Kern (Satorius–Đức). Cõn phõn tớch (Presica, í) Tủ ấm (Memmert–Đức).
Mỏy ly tõm sigma 3K30 (Sartorius–Đức). Tủ sấy (Memmert–Đức).
Mỏy khuấy từ (IKA–Đức).
Kớnh hiển vi điện tử quột JSM–5421LV (Nhật Bản).
2.3. Phương phỏp nghiờn cứu
2.3.1. Phương phỏp phõn lập vi khuẩn
Dựng cỏc đĩa petri cú chứa mụi trường Winogradsky và mụi trường AMM đó khử trựng. Pha loóng cỏc mẫu ở cỏc nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 và 10-5. Dựng pipet lấy 100 àl dịch mẫu đó pha loóng cho lờn mặt thạch. Dựng que cấy gạt đó vụ trựng gạt đều trờn mặt thạch cho đến khi nào mặt thạch khụ thỡ dừng lại. Cỏc mẫu đó cấy gạt cho vào tủ ấm ở 37oC trong thời gian từ 3 đến 5 ngày.
2.3.2. Phương phỏp đỏnh giỏ khả năng hỡnh thành biofilm
Nguyờn tắc: trong điều kiện dinh dưỡng thớch hợp và mụi trường nuụi cấy tĩnh cỏc chủng vi sinh vật hỡnh thành biofilm trờn bề mặt giỏ thể. Phỏt hiện, quan sỏt biofilm bằng cỏch nhuộm với tớm kết tinh – là chất cú khả năng bắt màu với tế bào. Tiến hành thớ nghiệm theo phương phỏp của O’Toole và cộng sự [46], [47]. Cỏc chủng vi khuẩn được lắc kớch hoạt trong bỡnh tam giỏc chứa mụi trường LB trong 24 giờ ở 37oC sao cho mật độ tế bào tại bước súng 620 nm (OD620) ở vào khoảng 0,2 đến 0,3. Hỳt 100 àl dịch nuụi cấy vi khuẩn bổ sung vào 700 àl LB lỏng trong cỏc ống eppendorf đó khử trựng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC.
Sau 24 giờ cỏc dịch nuụi cấy được loại bỏ khỏi cỏc ống eppendorf. Đỏnh giỏ mật độ tế bào sống trụi nổi trong mụi trường bằng phương phỏp so màu ở bước súng 620 nm dịch nuụi cấy vi khuẩn.
Ngụ Thị Kim Toỏn 26 K19 – Sinh học thực nghiệm
Quan sỏt khả năng hỡnh thành biofilm: Mỗi ống eppendorf được rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trựng. Bổ sung vào mỗi ống eppendorf 1 ml dung dịch tớm kết tinh 1% và giữ trong 25 phỳt ở nhiệt độ phũng. Loại bỏ dung dịch nhuộm và quan sỏt sự bắt màu của cỏc tế bào bỏm trờn trờn thành ống với tớm kết tinh.
Đỏnh giỏ mật độ tế bào trong biofilm: Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trựng cỏc tinh thể tớm bỏm trờn thành eppenodorf đươc hũa tan trong 1 ml etanol 70%. Mật độ tế bào trong biofilm được xỏc định bằng cỏch đo độ hấp thụ tại bước súng 570 nm.
2.3.3. Quan sỏt cấu trỳc biofilm bằng chụp ảnh trờn kớnh hiển vi điện tử quột (SEM) (SEM)
Chuẩn bị mẫu biofilm nổi: bổ sung dịch nuụi cấy lắc vi khuẩn vào bỡnh tam giỏc chứa 20 ml mụi trường LB. Nuụi cấy tĩnh 24 giờ ở 37oC.
Gắn mẫu biofilm lờn lamen, hơ nhẹ trờn ngọn lửa đốn cồn để cố định mẫu. Rửa nhẹ bằng nước cất khử trựng.
Gắn mẫu lờn đế. Mạ phủ mẫu bằng vàng trờn mỏy JFC–1200 trong 5 phỳt ở 30 mA.
Soi và chụp ảnh trờn kớnh hiển vi quột điện tử JSM–5421LV (Nhật Bản) tại phũng chụp Hiển vi điện tử quột – Trung Tõm Khoa Học Vật Liệu – Trường Đại học Khoa học Tự Nhiờn.
2.3.4. Ảnh hưởng của cỏc điều kiện mụi trường nuụi cấy lờn sự hỡnh thành màng sinh học
Vi sinh vật cú khả năng hỡnh thành màng sinh học tốt ở những điều kiện khỏc nhau. Nhiệt độ, pH khụng thớch hợp sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phỏt triển của vi sinh vật và khả năng tạo màng sinh học của chỳng.
2.3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ mụi trường nuụi cấy
Đỏnh giỏ khả năng hỡnh thành màng sinh học của cỏc chủng vi khuẩn trong mụi trường LB lỏng, nuụi cấy ở cỏc nhiệt độ: 25oC, 30oC, 37oC, 45oC, 50oC, 55oC. Sau 1 ngày nuụi cấy, tiến hành quan sỏt, đỏnh giỏ khả năng tạo biofilm của chủng vi khuẩn nghiờn cứu.
Ngụ Thị Kim Toỏn 27 K19 – Sinh học thực nghiệm
2.3.4.2. Ảnh hưởng của pH mụi trường nuụi cấy
Đỏnh giỏ khả năng hỡnh thành màng sinh học của cỏc chủng vi khuẩn trong mụi trường LB lỏng, nuụi cấy ở cỏc pH: 4, 5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 9. Sau 1 ngày nuụi cấy, tiến hành quan sỏt, đỏnh giỏ khả năng hỡnh thành màng sinh học của chủng vi khuẩn nghiờn cứu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.5. Phương phỏp nhuộm Gram.
Nguyờn tắc: Dựa vào sự khỏc biệt giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Vi khuẩn Gram (+) cú peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm thấu ngăn cản sự thất thoỏt của tớm kết tinh. Ban đầu vi khuẩn được nhuộm bằng tớm kết tinh sau đú được xử lý bằng iụt để tăng độ giữ màu. Sau đú được tẩy màu bằng cồn làm co cỏc lỗ của lớp peptidoglican dày lại. Do vậy phức chất tớm kết tinh và iot được giữ lại, vi khuẩn cú màu tớm. Peptidoglican ở vi khuẩn Gram (-) rất mỏng, ớt liờn kết chộo và cú lỗ lớn. Sự xử lý bằng cồn cú thể loại lipit khỏi thành Gram (-) đủ để làm tăng hơn kớch thước của lỗ. Do vậy, ở bước rửa bằng cồn đó loại bỏ phức chất màu tớm của tớm kết tinh-iụt. Khi nhuộm lại bằng safain thỡ vi khuẩn cú màu hồng [1].
Phương phỏp tiến hành:
Tạo vết bụi bằng cỏch nhỏ một giọt nước lờn lam kớnh sạch, đốt núng que cấy trờn ngọn lửa đốn cồn, dựng que cấy lấy khuẩn lạc trờn đĩa thạch hoặc trong ống giống, đưa vào giọt nước, cố định vết bụi bằng cỏch hơ khụ trờn ngọn lửa đốn cồn.
Cho một giọt tớm kết tinh bao phủ hoàn toàn vết bụi, nhuộm trong thời gian 1 phỳt. Sau đú rửa bằng nước cất và thấm khụ.
Nhuộm với lưugụn (chứa KI và I2) tương tự như với tớm kết tinh. Rửa bằng cồn trong 30 giõy. Thấm khụ.
Nhuộm safain trong 2 phỳt. Rửa bằng nước cất, thấm khụ. Soi trờn kớnh hiển vi quang học cú độ phúng đại 100 lần. Quan sỏt kết quả và đưa ra kết luận.
Ngụ Thị Kim Toỏn 28 K19 – Sinh học thực nghiệm
2.3.6. Phương phỏp sử dụng kit APi
Để kiểm tra khả năng đồng húa cỏc hợp chất hữu cơ điển hỡnh của cỏc chủng vi khuẩn, chỳng tụi đó tiến hành thử với Kit thử APi 20NE của hóng BioMộrieus.
Húa chất và thuốc thử cần thiết được cung cấp cựng với bộ kit.
Kết quả được ghi lại và phõn loại với phần mềm của hóng BioMộrieus .
2.3.7. Phương phỏp đỏnh giỏ khả năng chuyển húa cỏc hợp chất nitơ
Mỗi chủng được nuụi lắc ở 37°C trong cỏc khoảng thời gian từ 0, 5, 10, 15, 20 ngày. Mụi trường nuụi lắc là dung dịch mụi trường Winogradsky cú bổ sung 1% pepton [34].
2.3.7.1. Phương phỏp phõn tớch nitơ tổng số
Nguyờn tắc của việc phõn tớch nitơ tổng số là chuyển toàn bộ nitơ ở cả dạng vụ cơ và hữu cơ về dạng nitrate nhờ chất oxi húa mạnh sau đú tiến hành so màu ở