Sử dụng kỹ thuật RFLP, chúng tôi đã xác định đƣợc đột biến A10398G ở một số cặp mẫu. Để khẳng định kết quả, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR sau tinh sạch đƣợc lấy ra kiểm tra sự hiện diện của băng ADN. Theo tính toán, lƣợng ADN tinh sạch thu đƣợc nằm trong khoảng 200-400 Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp.
Giếng 3, 5: sản phẩm PCR từ mẫu mang alen G ở vị trí 10398.
Giếng 7: sản phẩm PCR từ mẫu mang alen A ở vị trí 10398.
Giếng 2, 4: sản phẩm sau cắt bằng DdeI từ mẫu mang alen G ở vị trí 10398.
Giếng 6: sản phẩm sau cắt bằng DdeI từ mẫu mang alen A ở vị trí 10398.
43
ng/µl. Lƣợng ADN này đủ sạch và có đủ lƣợng để đem giải trình tự. Sử dụng phần mềm Sequence Scanner để ph ân tích kết quả giải trình tƣ̣ và sƣ̉ du ̣ng chƣơng trình BLAST để so sánh trình t ự thu đƣơ ̣c v ới trình tự ADN chuẩn của ty thể đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen NCBI (NC_012920), chúng tôi đã xác định đƣợc đi ểm đột biến trên hệ gen ty thể.
Với đoạn gen 10398, chúng tôi đã gửi đi giải trình tự 4 mẫu (gồm hai mẫu không đột biến và hai mẫu đột biến) (xem phụ lục 2). Kết quả giải trình tự mẫu không mang đột biến đƣợc biểu diễn trên hình 12.
Hình 12. Kết quả giải trình tự mẫu không mang đột biến A10398G
So sánh trình tự thu đƣợc với trình tự ADN chuẩn của ty thể đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ trên hình 13.
44
Hình 13. Kết quả so sánh trình tự mẫu không mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty thể
Từ kết quả ở hình 13 cho thấy alen A xuất hiện ở vị trí 10398 tại mẫu không mang đột biến (alen A đƣợc bôi xanh). Điều này cho thấy không có đột biến xuất hiện. Kết quả này hoàn toàn phù hơ ̣p với kết quả phân tích RFLP.
Kết qủa giải trình tự mẫu mang đột biến A10398G đƣợc biểu diễn ở hình 14.
45
So sánh trình tự thu đƣợc với trình tự ADN chuẩn của ty thể đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ trên hình 15.
Hình 15. Kết quả so sánh trình tự mẫu mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty thể
Kết quả từ hình 15 cho thấy alen G xuất hiện ở vị trí 10398 tại mẫu mang đột biến (alen G đƣợc bôi xanh). Điều này cho thấy có xuất hiện đột biến A→G. Kết quả này hoàn toàn phù hơ ̣p với kết quả phân tích RFLP. Nhƣ vậy bằng kỹ thuật giải trình tự, chúng tôi đã xác định đƣợc điểm đột biến trên hệ gen ty thể tại vị trí 10398.
Kết quả giải trì nh tƣ̣ còn cho thấy có 2 dạng biến thể khác là T 10370C và C10400T. Dựa vào các dữ liệu đã đƣợc công bố trên Mitomap (ngân hàng dữ liệu genome ty thể) thấy rằng hai dạng biến thể này không liên quan tới đột biến gây bệnh, mà chỉ là đa hình trong các nhóm đơn bội. Đa hình C10400T thuộc siêu nhóm đơn bội M [62], còn biến thể T10370C thuộc dạng biến thể thƣờng, không gây bệnh [50].
46
3.2.4. Phân tích mối liên quan giƣ̃a đa hình A 10398G với các đă ̣c điểm bê ̣nh học lâm sàng của bệnh nhân ung thƣ đ ại trực tràng
Kết quả phân tích PCR–RFLP của 122 mẫu ADN tổng số của 61 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng (trong đó có 61 mẫu ADN tổng số của mô u và 61 mẫu ADN tổng số của mô lân câ ̣n u ) đã cho thấy có xuất hiện đột biến ADN ty thể ở vị trí 10398. Tiến hành phân tích mối liên quan giữa đột biến điểm A10398G của ADN ty thể của 61 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng vớ i các đă ̣c điểm lâm sàng khác, chúng tôi thu đƣợc kết quả trong bảng 12.
Bảng 12. Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng
Đặc điểm Số lƣợng Phân bố A10398G A G Giới tính Nam 30 50,0 (15) 50,0 (15) Nữ 31 41,9 (13) 58,1 (18) Tuổi ≥ 50 46 47,8 (22) 52,2 (24) < 50 15 40 (6) 60 (9) Vị trí ung thƣ Đại tràng 30 56,7 (17) 43,3 (13) Trực tràng 29 37,9 (11) 62,1 (18) Giữa đại và trực tràng 2 0 (0) 100 (2) Hạch 0 3 66,7 33,3
47 (2) (1) 13 15 60 (9) 40 (6) >3 27 37 (10) 63 (17) Kích thƣớc u <5cm 28 35,7 (10) 64,3 (18) 5cm 22 59 (13) 41 (9) Phân loại TNM Giai đoạn I T1-2N0M0 16 37,5 (6) 62,5 (10) Giai đoạn II T3-4N0M0 20 60 (12) 40 (8)
Giai đoạn III N1-2M0 T bất kỳ 21 42,9 (9) 57,1 (12) Giai đoạn IV M1 T, N bất kỳ 3 0 (0) 100 (3) Mức độ biệt hóa Cao 5 60 (3) 40 (2) Vừa 20 52,4 (11) 47,6 (9) Kém 2 0 (0) 100 (2)
48
- Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo vị trí mô
Nhằm đánh giá mối liên hệ giữa đa hình A10398G của ADN ty thể với vị trí của mô đại trực tràng, chúng tôi đã khảo sát sự phân bố đa hình A10398G của ADN ty thểtheo mẫu mô u và mẫu mô lân cận u. Kết quả trình bày ở hình 16.
Hình 16. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí mô
Kết quả từ hình 16 cho thấy tần xuất alen A và G giữa mô u và mô lân cận u không có sự khác biệt, trong đó tần suất xuất hiện của alen A là 46% (28/61), alen G là 54% (33/61). Tần suất này phù hợp với nghiên cứu của Juo và cs (2010) trên đối tƣợng là ngƣời Trung Quốc mắc các bệnh thuộc hội chứng chuyển hóa với các biểu hiện nhƣ đƣờng máu cao, rối loạn lipid, tăng huyết áp và béo phì, với tần suất của alen G là 57,1% trên các mẫu bệnh, và 52,7% trên các mẫu đối chứng [34]. Tần suất alen ở vị trí 10398 mang tính đa hình cao, khác nhau giữa các nhóm tộc ngƣời phân bố ở các khu vực địa lý khác nhau, cụ thể là tần suất alen G ở nhóm ngƣời Mỹ gốc Phi là 87% [18], Bắc Ấn Độ là 57,3% [26], ngƣời Mỹ gốc Âu là 32,1% [12]. Nhƣ vậy tần suất alen đƣợc xác định trong nghiên cứu này phù hợp với các nghiên cứu đƣợc tiến hành trên đối tƣợng là ngƣời châu Á.
49
- Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo giới tính
Ung thƣ đại trực tràng đƣợc coi là một trong những bệnh ung thƣ phổ biến nhất ở nam giới bởi một trong những nguyên nhân gây ung thƣ đại trực tràng là thói quen sử dụng bia rƣợu, hút thuốc lá thƣờng xuyên. Điều này có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực tràng, gây viêm loét đại tràng. Để tìm hiểu mối liên quan giữa đa hình A10398G với giới tính của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng, chúng tôi đã tiến hành phân tích thống kê và kết quả đƣợc đƣa ra ở hình 17.
Hình 17. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giới tính
Kết quả từ hình 17 cho thấy tần suất xuất hiện của alen A ở nam giới là 50%, ở nữ là 41,9%. Tần suất xuất hiện của alen G ở nữ giới lại cao hơn ở nam giới (58,1% và 50%). Bằng phép kiểm định χ2 chúng tôi nhận thấy sự khác biệt về tần suất alen giữa hai giới không mang ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa α= 0,05 (χ2 = 0,399 < χ21(0,05) = 3,84).
- Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo tuổi
Ung thƣ đại trực tràng thƣờng tâ ̣p trung ở đô ̣ tuổi trung niên. Do đó chúng tôi đã tiến hành phân tích mối liên quan giƣ̃a đa hình A 10398G vớ i đô ̣ tuổi của các bê ̣nh nhân ung thu đại trực tràng. Kết quả phân tích đƣơ ̣c trình bày trong hình 18.
50
Hình 18. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo tuổi
Số liệu từ hình 18 cho thấy các bệnh nhân mắc bệnh ung thƣ đại trực tràng phần lớn là hơn 50 tuổi (46/61 bệnh nhân). Tần suất xuất hiện alen G cao hơn alen A ở cả hai nhóm tuổi (nhóm <50 tuổi 10398 G chiếm 60%, nhóm >50 tuổi là 52,2%). Tuy vậy sự khác biệt về tần suất alen giữa hai nhóm không có ý nghĩa thống kê (χ2 = 0,278 < χ21(0,05) = 3,84, p>0,05).
- Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo vị trí khối u
Ung thƣ có thể diễn ra ở đại tràng, trực tràng hay đoạn nối giữa đại tràng và trực tràng (ung thƣ đại trực tràng). Kết quả khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo vị trí khối u đƣợc biểu diễn ở hình 19.
51
Hình 19. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí khối u.
Số liệu từ hình 19 cho thấy vị trí khối u tập trung chủ yếu ở trực tràng và đại tràng, một phần nhỏ ở vùng giữa đại và trực tràng (2/61 bệnh nhân). Alen G xuất hiện với tần suất cao nhất ở ung thƣ ở vùng giữa đại và trực tràng (100%), tiếp đó là ung thƣ trực tràng (62,1%), cuối cùng là ung thƣ đại tràng (43,33%). Alen A không xuất hiện ở vùng giữa đại và trực tràng. Có sự khác nhau giữa tần suất các alen với vị trí khối u, tuy vậy sự khác nhau này không mang ý nghĩa thống kê (χ2 = 3,838 < χ2
2(0,05) = 5,991, p>0,05).
- Khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo kích thƣớc u
Kích thƣớc khối u đƣợc biết đến nhƣ là một trong những yếu tố giúp tiên lƣợng bệnh ung thƣ đại trực tràng, đặc biệt có ý nghĩa chẩn đoán trong ung thƣ đại tràng. Nó có liên quan đến quá trình tiến triển và khả năng sống sót trong ung thƣ đại tràng [39]. Do đó chúng tôi đã tiến hành phân tích mối liên quan giƣ̃a đa hình A10398G vớ i kích thƣ ớc khối u. Kết quả phân tích thống kê đƣơ ̣c trình bày trong hình 20.
52
Hình 20. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo kích thƣớc u
Kết quả từ hình 20 cho thấy tần suất xuất hiện alen A trong nhóm có kích thƣớc u ≥ 5cm là 59%, alen G là 41%. Trong nhóm có kích thƣớc u < 5cm tần suất của alen G lại gần gấp đôi alen A (64,3% và 35,7%). Sự khác biệt giữa phân bố đa hình với kích thƣớc u không mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 2,71 < χ21(0,05) = 3,84, p>0,05.
- Khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo số hạch lympho
Số lƣợng hạch lympho là một trong những yếu tố quan trọng giúp phân loại giai đoạn bệnh và có ý nghĩa trong việc tiên lƣợng khả năng sống sót của bệnh nhân. Do đó chúng tôi đã tiến hành khảo sát đa hình A10398G theo số hạch lympho để tìm hiểu mối liên quan giữa chúng. Kết quả phân tích đƣợc biểu diễn trong hình 21.
53
Hình 21. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo số hạch.
Kết quả từ hình 21 cho thấy số hạch tăng lên thì tần suất xuất hiện alen G cũng tăng lên và đạt nhiều nhất ở nhóm có số hạch >3 (63%). Tần số alen A lớn nhất ở nhóm không xuất hiện hạch (66,67%). Nhƣ vậy ngƣời mang alen G có nguy cơ mắc bệnh ung thƣ đại trực tràng với mức độ nguy hiểm cao hơn ngƣời mang alen A. Sự khác biệt giữa tần suất alen và số hạch không mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 2,559 < χ22(0,05) = 5,991, p>0,05.
- Khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo giai đoạn phát triển khối u
Trong nghiên cứu này các giai đoạn phát triển khối u đƣợc phân loại theo hệ thống TNM, với 4 giai đoạn. Việc phân loại giai đoạn phát triển của bệnh có ý nghĩa rất lớn trong việc tiên lƣợng bệnh và lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát, tìm hiểu mối liên quan giữa đa hình A10398G với các giai đoạn phát triển khối u. Kết quả phân tích đƣợc biểu diễn ở hình 22.
54
Hình 22. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giai đoạn TNM
Số liệu ở hình 22 cho thấy tần suất alen A cao nhất ở giai đoạn II, đạt tới 60%. Ở giai đoạn IV không có bệnh nhân nào mang alen A. Giai đoạn I là giai đoạn bệnh còn ở mức nhẹ, ung thƣ đã bắt đầu lây lan, nhƣng vẫn còn trong lớp lót bên trong đại trực tràng, chƣa lan đến các cơ quan khác. Ở giai đoạn I này alen G có tần suất đạt 62,5%. Tiếp đó tần suất alen G có sự giảm ở giai đoạn II (40%) và tăng trở lại ở giai đoạn III (57,14%). Alen G có tần suất xuất hiện lớn nhất ở giai đoạn IV (100%). Đây là giai đoạn nặng nhất của bệnh với sự di căn của khối u tới các cơ quan xa (phổi, gan) thông qua hệ bạch huyết. Khả năng sống sót của bệnh nhân sau 5 năm ở giai đoạn này chỉ đạt từ 0-7%. Điều này lại một lần nữa khẳng định cho giả thuyết alen G làm tăng nguy cơ đối với bệnh ung thƣ đại trực tràng. Sự khác biệt giữa phân bố đa hình A10398G với các giai đoạn phát triển ung thƣ TNM không mang ý nghĩa thống kê với χ2
= 4,675 < χ23(0,05) = 7,814, p>0,05.
- Khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo mức độ biệt hóa
Mức độ biệt hóa là một khái niệm dùng để chỉ mức độ giống các tế bào bình thƣờng cùng một loại mô của các tế bào u. Mức độ ác tính của ung thƣ có liên quan trực tiếp đến nguồn gốc của tế bào biệt hóa. Thông thƣờng, những khối u có tính biệt hóa cao, tế bào ung thƣ thƣờng phát triển chậm, mức độ ác tính thấp, di căn
55
chậm. Mặt khác những khối u có tính biệt hóa thấp thì độ ác tính lại cao, di căn nhanh. Kết quả của việc khảo sát đa hình A10398G ADN ty thể theo mức độ biệt hóa đƣợc biểu diễn trong hình 23.
Hình 23. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo mức độ biệt hóa
Kết quả từ hình 23 cho thấy tần suất alen G tăng dần với sự giảm của mức độ biệt hóa, đồng nghĩa với việc tăng dần của độ ác tính và tốc độ di căn của khối u. Đối với alen A thì ngƣợc lại, đạt cao nhất ở mức đô độ biệt hóa cao (60%), thấp nhất ở mức biệt hóa kém (0%). Kết quả này cũng phù hợp với giả thuyết alen G làm tăng mức độ nguy hiểm với bệnh ung thƣ đại trực tràng. Sự khác biệt giữa tần suất alen và mức độ biệt hóa không mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 2,366 < χ22(0,05) = 5,991, p>0,05.
Nhƣ vậy qua việc khảo sát sự phân bố đa hình A10398G theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng, chúng ta thấy đƣợc một số đặc điểm sau:
- Tần suất xuất hiện của alen A ở mô u và mô lân cận u là 46%, của alen G là 54%. Không có sự khác biệt về tần suất alen giữa mô u và mô lân cận u. Sự phân bố đa hình này phù hợp với các nghiên cứu về đa hình A10398G trên đối tƣợng ngƣời châu Á (khu vực miền Bắc Ấn Độ: 57,3%, Trung Quốc 57,1%).
56
- Alen A và G phân bố trên cả nam và nữ. Tần suất alen G ở nam là 50%, ở nữ là 58,1%. Ở nhóm có độ tuổi ≥ 50, tần suất alen G là 52,2%, ở nhóm <50 tuổi, tần suất alen G là 60%. Alen G xuất hiện nhiều ở ung thƣ trực tràng và ung thƣ giữa đại và trực tràng. Với nhóm có khối u kích thƣớc nhỏ hơn 5cm, alen G chiếm 64,3%. - Khảo sát mối liên quan giữa đa hình A10398G với các đặc điểm nhƣ số hạch lympho, giai đoạn phát triển khối u, mức độ biệt hóa cho thấy tần suất alen G tăng dần với sự tăng của số hạch, sự tăng của giai đoạn phát triển bệnh và sự giảm của mức độ biệt hóa. Điều này cho thấy alen G có mối liên quan với nguy cơ mắc bệnh