Đối tƣợng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là mẫu mô của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng đƣợc lấy tại vị trí khối u và vị trí lân cận khối u (cách khối u khoảng 5-10 cm). Mẫu mô sử dụng trong nghiên cứu này gồm 61 mẫu do Khoa Tế bào – Giải phẫu bệnh, bệnh viện K Tam Hiệp – Hà Nội và Khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức – Hà Nội cung cấp trong thời gian từ tháng 8 năm 2010 đến tháng 6 năm 2012. Mẫu sử dụng đã đƣợc thống kê ở bảng 3. Mẫu mô đƣợc đựng trong ống eppendorf, vận chuyển từ bệnh viện về trong nitơ lỏng và bảo quản trong tủ lạnh sâu âm 80C cho tới khi tiến hành những nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 3. Thống kê mẫu sử dụng

Bệnh viện cung cấp mẫu Số mẫu Ung thƣ đại tràng Ung thƣ trực tràng Ung thƣ giƣ̃a đại và trực tràng K2 Tam Hiệp 31 12 17 2 Việt Đức 30 18 12 0 2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu đƣợc liệt kê trong bảng 4.

Bảng 4. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong nghiên cƣ́u

Hóa chất Hãng cung cấp Mục đích

QIA amp DNA minikit QIAGEN (Đức) Tách ADN tổng

số

QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN (Đức) Tinh sạch ADN

27

SDS, Acrylamide, Bis-Acrylamide Pharmacia (Thụy Điển)

Các cặp mồi 10398, 3243 IDT (Mỹ)

PCR

Master Mix 2X NEB (Mỹ)

Enzyme Fastdigest® HaeIII Enzyme Fastdigest®DdeI

Fermentas (Đức) RFLP

Các hóa chất khác nhƣ: acid boric, Tris – base, EDTA, kali phosphate, ethanol, natri carbonat, bạc nitrat… đƣợc sử dụng đều có độ sạch phân tích.

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị và máy móc của phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Cộng nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đƣợc sƣ̉ du ̣ng trong nghiên cƣ́u đƣợc thống kê trong bảng 5.

Bảng 5. Các thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cƣ́u

STT Tên thiết bị Hãng sản xuất

1 Máy PCR (GeneAmp PCR system 9700) Applied BioSciences (Mỹ)

2 Nguồn điện di PowerPac™ HC Bio–rad (Mỹ)

3 Bể điện di Mini–Sub Cell GT, MiniProtean 3 cell Bio–rad (Mỹ)

3 Máy ly tâm lạnh 5417R Eppendorf (Đức)

4 Tủ lạnh – 20C và – 80C Nuaire (Mỹ)

5 Bể ổn nhiệt ED5 Julabo (Đức)

6 Tủ an toàn sinh học Nuaire (Mỹ)

28

Ngoài ra, còn các thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu nhƣ cân phân tích, cân kỹ thuật, máy vortex, máy minispin, lò vi sóng…

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để tiến hành phân tích đột biến A3243G và A10398G, chúng tôi thực hiện phƣơng pháp PCR-RFLP. Trƣớc hết ADN tổng số đƣợc tách chiết từ mô u và mô lân cận u. Tiếp đó, đoạn ADN chứa đột biến đƣợc nhân lên bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sự có mặt của đoạn gen chứa đột biến này đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di. Bƣớc tiếp theo chúng tôi thực hiện cắt đoạn gen này bằng enzym giới hạn thích hợp để nhận biết đột biến qua phổ băng điện di. Để khẳng định kết quả, đoạn gen chứa đột biến đƣợc tinh sạch và đƣợc gửi đi giải trình tự.

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô

Mẫu mô đại trực tràng bao gồm mẫu mô u và mẫu mô lân cận khối u của cùng một bệnh nhân đƣợc lấy ra từ tủ 80C, rã đông và rửa bằng đệm Kali phosphate 100mM, pH 8,0. Sau khi rửa, hai mẫu mô đƣợc cân với lƣợng tƣơng đƣơng 0,03–0,05g/mẫu và cho vào hai ống eppendorf riêng biệt.

Tiến hành tách chiết ADN tổng số sử dụng kit tách chiết ADN từ mô- QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.

 Bổ sung vào mỗi ống epp: 180 µl buffer ATL và 20 µl proteinase K, vortex và ủ ở 56ºC trong khoảng 3h để mô đƣợc thủy phân hoàn toàn.

 Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.

 Thêm 200 µl buffer AL vào mẫu, vortex trong 15s, và ủ ở 70ºC trong 10 phút. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.

 Thêm 200 µl ethanol (96–100%) vào mẫu, vortex trong 15s. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.

 Cho toàn bộ hỗn hợp vào cột QIAamp Spin Column. Đóng nắp, ly tâm 8000 rpm trong 1 phút. Đặt cột vào ống epp sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.

 Bổ sung lên cột 500 µl buffer AW1. Đóng nắp, ly tâm ở 8000 rpm trong 1 phút. Đặt cột vào ống epp sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.

29

 Bổ sung lên cột 500 µl buffer AW2. Đóng nắp, ly tâm ở tốc độ tối đa 14.000 rpm trong 3 phút. Có thể lặp lại bƣớc này thêm 1 phút nếu chƣa hết dịch trên cột.

 Thu mẫu trên cột: Đặt cột vào ống 1.5 ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch. Thêm 200 µl buffer AE hoặc nƣớc sạch. Đặt ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 8000 rpm) trong 1 phút. Lặp lại bƣớc trên 2 lần.

 Làm khô dịch thu đƣợc bằng máy Speed vac trong 2h.

 Hòa tan ADN trong 50µl buffer AE , bảo quản ở –20ºC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

 Kiểm tra quá trình tách chiết ADN tổng số bằng điện di trên gel agarose 0,8–1%.

2.2.2. Khuếch đại đoa ̣n gen 10398 và đoạn gen 3243 ADN ty thể bằng PCR

Kỹ thuật PCR hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp là kỹ thuật cho phép nhân bản invitro các đoạn ADN (gen) lên hàng triệu lần so với ban đầu (1012–1013

bản sao). Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là phối hợp khả năng lai đặc hiệu của ADN và khả năng tổng hợp ADN invitro của ADN polymerase. Phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại của 3 bƣớc cơ bản: biến tính (Denaturing), gắn mồi (Annealing) và tổng hợp (Extending).

Các cặp mồi đƣợc chúng tôi thiết kế bằng chƣơng trình Primer premier 5. Trình tự các cặp mồi đƣợc trình bày ở bảng 6.

Bảng 6. Các cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR

Tên mồi Trình tự mồi Kích thƣớc sản

phẩm (bp) 10398 f 5’-CCTGCCACTAATAGTTATGTC-3’ 246 r 5’-GATATGAGGTGTGAGCGATA-3’ 3243 f 5’-CTGTACGAAAGGACAAGAGA-3’ 218 r 5’-ACAATGAGGAGTAGGAGGTT-3’

30

PCR đƣơ ̣c thƣ̣c hiê ̣n với các thành phần của phản ứng nhƣ trong bảng 7.

Bảng 7. Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 12,5 l Thành phần Thể tích (l) Nồng độ cuối cùng Master Mix 2x 6,25 1X Primer F 10µM 0,25 0,2 M Primer R 10µM 0,25 0,2 M ADN khuôn 2 Nƣớc 3,75

Chu trình nhiệt đối với cặp mồi 10398 nhƣ sau:

31

2.2.3. Phân tích RFLP

Phƣơng pháp RFLP sử dụng các enzyme giới hạn thích hợp phân cắt sản phẩm PCR để nhận biết đột biến qua phổ băng điện di.

+ Vớ i đoa ̣n gen 10398 ADN ty thể: sƣ̉ du ̣ng enzyme FastDigest® DdeI. Enzyme

này có vị trí nhận biết trên ADN nhƣ sau: 5’…C/TNAG…3’ 3’…GANT/C…5’

Phân tích vi ̣ trí nhâ ̣n biết các enzyme giới ha ̣n trên đoa ̣n gen 246 bp và nhâ ̣n thấy trong trƣờng hợp 10398A thì enzyme DdeI sẽ cắt đoa ̣n gen ở một vị trí và tạo thành các đoa ̣n oligonucleotide có kích thƣớc 50 bp và 196 bp.

Trong trƣờng hợp 10398 G thì enzyme DdeI sẽ cắt đoa ̣n gen ở 2 vị trí và kết quả cắt enzyme thu đƣợc các đoạn oligonucleotide có kích thƣớc 38 bp, 50 bp và 158 bp.

+ Vớ i đoa ̣n gen 3243 ADN ty thể: sƣ̉ du ̣ng enzym e cắt FastDigest® HaeIII nhận biết vi ̣ trí cắt trên ADN ta ̣i trình tƣ̣:

5’…GG/CC…3’ 3’…CC/GG…5’

Đoa ̣n gen 3243 đƣơ ̣c nhân lên có kích thƣớc 218 bp. Trong trƣờng hợp không đột biến (3243A) thì HaeIII cắt đoa ̣n gen này ta ̣i hai vi ̣ trí , dẫn tới sản phẩm thu đƣơ ̣c là các đoa ̣n có kích thƣớc 22 bp, 27 bp và 169 bp.

Trong trƣờng hợp có đột biến 3243G thì vi ̣ trí này sẽ trở thành vi ̣ trí cắt của

HaeIII. Kết quả là sau khi cắt bằng enzyme HaeIII sẽ xuất hiê ̣n các đoa ̣n có kích thƣớc 22 bp, 27 bp, 72 bp và 97 bp.

32

Sản phẩm PCR đƣợc tiến hành phản ứng cắt với enzyme thích hợp theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất . Thành phần phản ứng cắt sử dụng HaeIII và DdeI

đƣơ ̣c mô tả trong bảng 8.

Bảng 8. Thành phần phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt giới hạn HaeIII và DdeI

Thành phần Thể tích

10X FastDigest® buffer 2µl Sản phẩm PCR (~0.2 µg) 10µl

FastDigest® enzyme 1µl

Nƣớc Bổ sung đến đủ 30 µl

Thành phần phản ứng s au khi đƣơ ̣c trô ̣n đều thì tiến hành ủ ở 37 0

C theo đúng khuyến cáo của nhà sản xuất. Hỗn hợp đƣợc trộn đều, ly tâm nhẹ, ủ 7–10 phút trong bể ổn nhiệt ở 370C. Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm cắt enzyme trên gel polyacrylamide 8% và nhuộm bạc để quan sát kết quả.

2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn

Điện di là kỹ thuật đƣợc dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đại phân tử đặc biệt nhƣ protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thƣớc/khối lƣợng, điện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện đƣợc đặt trong một điện trƣờng, chúng sẽ dịch chuyển hƣớng đến cực dƣơng (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng. Các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của chúng và vì thế chỉ dịch chuyển hƣớng tới cực dƣơng. Tốc độ di chuyển của các phân tử này phụ thuộc chủ yếu vào kích thƣớc phân tử acid nucleic, nhờ đó mà những đoạn ADN hay ARN khác nhau có khả năng phân biệt với nhau trên gel điện di. Gel điện di thƣờng sử dụng là agarose và polyacrylamide. Tùy vào

33

kích thƣớc đoạn ADN muốn phân tách ngƣời ta sẽ sử dụng chúng ở những nồng độ khác nhau.

2.2.4.1. Điện di gel agarose

Điện di gel agarose đƣợc thực hiện với chất nền là agarose. Nồng độ agarose dùng trong điện di nằm trong khoảng 0,5 – 2,5%. Giới hạn phân tách của gel đƣợc trình bày ở bảng 9.

Bảng 9. Dải nồng độ gel agarose dùng trong phân tách acid nucleic [6] Nồng độ gel (%w/v) Dãy kích thƣớc tách hiệu quả (kb)

0,5 2–25 0,7 0,8–10 1,2 0,4–5 1,5 0,2–3 2,0 0,1–2 2,5 0,05–1,5

Việc hiển thị các băng ADN trong gel agarose sau quá trình chạy điện di đƣợc thực hiện bằng cách nhuộm gel ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) (ủ gel trong dung dịch nhuộm chứa 200–300 ng EtBr/ml khoảng 30 phút) và có thể phát hiện dƣới ánh sáng tử ngoại (UV).

Chuẩn bị gel agarose 1,3% để kiểm tra sản phẩm PCR

 Cân 1,3 gam agarose dạng bột (Invitrogen), bổ sung 100ml đệm chạy TBE 1X pH 8,3 (Tris–base 0,09M; acid boric 0,09M; EDTA 4mM)

 Làm nóng chảy gel bằng cách đun trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hết (khoảng vài phút).

34

 Làm nguội gel đến khoảng 50–55C, đổ agarose vào khuôn điện di đã cài lƣợc để tạo giếng.

 Để gel đông ở nhiệt độ phòng (20–30 phút).

 Sản phẩm PCR đƣợc trộn với loading dye (glycerol 30% v/v, bromphenol blue dạng vết) và nạp lên giếng điện di. Điện di với dòng điện 110 V trong khoảng 30 phút.

 Bản gel sau điện di đƣợc nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia tử ngoại (UV).

2.2.4.2. Điện di gel polyacrylamide

Điện di trên gel polyacrylamide. Gel polyacrylamide đƣợc tổng hợp ngay trƣớc khi dùng ở nhiệt độ phòng gồm 2 thành phần chính là acrylamide và bis– acrylamide. Quá trình tổng hợp nhờ xúc tác của Ammonim persulfate (APS) và TEMED. Khi trùng hợp từ hai thành phần chính trên sẽ hình thành một polymer dạng mạng lƣới. Tùy theo nồng độ của các chất thành phần mà gel tạo thành sẽ có hệ thống lỗ nhỏ, vừa hay lớn. Tƣơng tự, tùy hàm lƣợng của bis–acrylamide mà gel có mức độ liên kết chéo cao hay thấp. Hiệu quả của sự phân tách ADN trong gel phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide (bảng 10), kích thƣớc và điện tích của ADN.

Bảng 10. Khả năng phân tách của gel polyacrylamide đối với acid nucleic [6] Nồng độ gel (%w/v) Giới hạn phân tách với ADN (bp)

5 80500

8 60400

12 50300

15 40200

35

Chuẩn bị bản gel polyacylamide 8% dùng để đi ện di kiểm tra sản phẩm PCR đƣợc cắt bằng enzyme HaeIII và DdeI (bảng 11).

Bảng 11.Các thành phần cần sử dụng cho 1 bản gel dày 0,75 mm, kích thƣớc 7cm

Thành phần Thể tích

Monoacrylamide 30% 1,33 ml

TBE 1X 3,67 ml

APS 10% 37,5 l

TEMED 3 l

Kỹ thuật nhuộm bạc: Bản gel polyacrylamide sau khi điện di đƣợc nhuộm bạc theo phƣơng pháp của Bassam (1991) [13], bao gồm các bƣớc sau:

 Cố định bản gel bằng dung dịch acid acetic 7,5% trong 30 phút.

 Rửa bằng nƣớc cất ba lần, mỗi lần cách nhau 5 phút.

 Nhuộm bằng dung dịch bạc nitrat (1,5g/l AgNO3; 0,056% formaldehyde) trong 30 – 40 phút, tránh ánh sáng.

 Rửa nƣớc khoảng 30 giây–1 phút.

 Hiện băng bằng dung dịch developer (30g/l Na2CO3, 0,056% formaldehyde, 400 µg/l natri thiosulfate Na2S2O3) trong 3–5 phút.

 Dừng phản ứng bằng dung dịch acid acetic lạnh 7,5% trong 1–3 phút.

 Bảo quản gel bằng nƣớc cất.

 Quan sát kết quả dƣới ánh sáng trắng.

2.2.5. Tinh sạch ADN

Đoạn gen chứa đột biến A10398G đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR và đƣợc tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction Kit của hãng QIAGEN (Đức). Quy trình tinh sạch đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất nhƣ sau:

36

- Đoạn gen chứa đột biến A10398G sau khi đƣợc khuếch đại bằng PCR, đƣợc điện di trên gel agarose 1%.

- Cắt các mảnh gel agarose chứa ADN, cho các mảnh này vào ống sạch - Bổ sung 3 thể tích đệm QG cho một thể tích gel (100mg ≈ 100µl). - Ủ ở 50o

C trong 10 phút (hoặc cho đến khi miếng gel đã hòa tan hoàn toàn). Trong thời gian ủ, cứ 3 phút lại vortex ống.

- Sau khi gel đã hòa tan hoàn toàn, kiểm tra nếu màu sắc của hỗn hợp có màu vàng là đƣợc. Nếu hỗn hợp có màu cam hoặc tím thì thêm 10 µl Natri acetat 3M, pH 5,0 vào hỗn hợp và mix.

- Thêm một thể tích isopropanol vào mẫu và mix

- Đƣa mẫu lên cột, ly tâm 1 phút, tốc độ 13000 rpm, nhiệt độ phòng.

- Đổ bỏ phần dịch qua cột, thêm 0,5 ml đệm QG lên cột, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm trong 1 phút

- Để rửa, bổ sung 0,75 ml đệm PE lên cột, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm trong 1 phút

- Đổ bỏ phần dịch qua cột, ly tâm cột thêm một phút ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm.

- Để thôi ADN: thêm 50 µl đêm EB lên màng, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm trong 1 phút.

- Tiếp tục thêm 50 µl đêm EB lên màng, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm trong 1 phút.

- Speed vac ống đến thể tích 20 µl, điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8%.

ADN sau khi tinh sạch đƣợc gửi đi giải trình tự. 2.2.6. Tính toán thống kê

Xƣ̉ lý các số liê ̣u phân tích theo các phƣơng pháp thố ng kê thƣờng dùng . So sánh các đặc trƣng thống kê mẫu bằng phép ki ểm định 2 với mức ý nghĩa α = 0,05.

37

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN ĐIỂM A3243G CỦA GEN tARN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP

3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô ung thƣ đại trực tràng

Sử dụng kit tách chiết ADN QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN (Đức), chúng tôi đã tách chiết đƣợc ADN từ 61 cặp mẫu mô (mẫu u và mẫu lân cận u) của 61 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Kết quả tách chiết ADN tổ ng số tƣ̀ các mẫu mô đƣợc minh họa trong hình 7.

Hình 7. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ mô

(điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide).

Giếng 1, 3, 5: ADN tổng số mẫu mô lân cận u Giếng 2, 4, 6: ADN tổng số mẫu mô u

Qua hình ảnh điện di trên ta thấy các băng ADN tổng số tƣơng đối sáng, gọn chứng tỏ hàm lƣợng ADN trong mẫu khá cao và sạch, đủ điều kiện để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

38

3.1.2. Kết quả nhân đoạn gen 3243 của ADN ty thể

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu 3243 với khuôn là ADN tổng số từ mô, đoạn gen chứa vị trí 3243 ADN ty thể đã đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium bromide, quan