Mẫu mô đại trực tràng bao gồm mẫu mô u và mẫu mô lân cận khối u của cùng một bệnh nhân đƣợc lấy ra từ tủ 80C, rã đông và rửa bằng đệm Kali phosphate 100mM, pH 8,0. Sau khi rửa, hai mẫu mô đƣợc cân với lƣợng tƣơng đƣơng 0,03–0,05g/mẫu và cho vào hai ống eppendorf riêng biệt.
Tiến hành tách chiết ADN tổng số sử dụng kit tách chiết ADN từ mô- QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.
Bổ sung vào mỗi ống epp: 180 µl buffer ATL và 20 µl proteinase K, vortex và ủ ở 56ºC trong khoảng 3h để mô đƣợc thủy phân hoàn toàn.
Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.
Thêm 200 µl buffer AL vào mẫu, vortex trong 15s, và ủ ở 70ºC trong 10 phút. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.
Thêm 200 µl ethanol (96–100%) vào mẫu, vortex trong 15s. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.
Cho toàn bộ hỗn hợp vào cột QIAamp Spin Column. Đóng nắp, ly tâm 8000 rpm trong 1 phút. Đặt cột vào ống epp sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.
Bổ sung lên cột 500 µl buffer AW1. Đóng nắp, ly tâm ở 8000 rpm trong 1 phút. Đặt cột vào ống epp sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.
29
Bổ sung lên cột 500 µl buffer AW2. Đóng nắp, ly tâm ở tốc độ tối đa 14.000 rpm trong 3 phút. Có thể lặp lại bƣớc này thêm 1 phút nếu chƣa hết dịch trên cột.
Thu mẫu trên cột: Đặt cột vào ống 1.5 ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch. Thêm 200 µl buffer AE hoặc nƣớc sạch. Đặt ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 8000 rpm) trong 1 phút. Lặp lại bƣớc trên 2 lần.
Làm khô dịch thu đƣợc bằng máy Speed vac trong 2h.
Hòa tan ADN trong 50µl buffer AE , bảo quản ở –20ºC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Kiểm tra quá trình tách chiết ADN tổng số bằng điện di trên gel agarose 0,8–1%.
2.2.2. Khuếch đại đoa ̣n gen 10398 và đoạn gen 3243 ADN ty thể bằng PCR
Kỹ thuật PCR hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp là kỹ thuật cho phép nhân bản invitro các đoạn ADN (gen) lên hàng triệu lần so với ban đầu (1012–1013
bản sao). Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là phối hợp khả năng lai đặc hiệu của ADN và khả năng tổng hợp ADN invitro của ADN polymerase. Phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại của 3 bƣớc cơ bản: biến tính (Denaturing), gắn mồi (Annealing) và tổng hợp (Extending).
Các cặp mồi đƣợc chúng tôi thiết kế bằng chƣơng trình Primer premier 5. Trình tự các cặp mồi đƣợc trình bày ở bảng 6.
Bảng 6. Các cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR
Tên mồi Trình tự mồi Kích thƣớc sản
phẩm (bp) 10398 f 5’-CCTGCCACTAATAGTTATGTC-3’ 246 r 5’-GATATGAGGTGTGAGCGATA-3’ 3243 f 5’-CTGTACGAAAGGACAAGAGA-3’ 218 r 5’-ACAATGAGGAGTAGGAGGTT-3’
30
PCR đƣơ ̣c thƣ̣c hiê ̣n với các thành phần của phản ứng nhƣ trong bảng 7.
Bảng 7. Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 12,5 l Thành phần Thể tích (l) Nồng độ cuối cùng Master Mix 2x 6,25 1X Primer F 10µM 0,25 0,2 M Primer R 10µM 0,25 0,2 M ADN khuôn 2 Nƣớc 3,75
Chu trình nhiệt đối với cặp mồi 10398 nhƣ sau:
31
2.2.3. Phân tích RFLP
Phƣơng pháp RFLP sử dụng các enzyme giới hạn thích hợp phân cắt sản phẩm PCR để nhận biết đột biến qua phổ băng điện di.
+ Vớ i đoa ̣n gen 10398 ADN ty thể: sƣ̉ du ̣ng enzyme FastDigest® DdeI. Enzyme
này có vị trí nhận biết trên ADN nhƣ sau: 5’…C/TNAG…3’ 3’…GANT/C…5’
Phân tích vi ̣ trí nhâ ̣n biết các enzyme giới ha ̣n trên đoa ̣n gen 246 bp và nhâ ̣n thấy trong trƣờng hợp 10398A thì enzyme DdeI sẽ cắt đoa ̣n gen ở một vị trí và tạo thành các đoa ̣n oligonucleotide có kích thƣớc 50 bp và 196 bp.
Trong trƣờng hợp 10398 G thì enzyme DdeI sẽ cắt đoa ̣n gen ở 2 vị trí và kết quả cắt enzyme thu đƣợc các đoạn oligonucleotide có kích thƣớc 38 bp, 50 bp và 158 bp.
+ Vớ i đoa ̣n gen 3243 ADN ty thể: sƣ̉ du ̣ng enzym e cắt FastDigest® HaeIII nhận biết vi ̣ trí cắt trên ADN ta ̣i trình tƣ̣:
5’…GG/CC…3’ 3’…CC/GG…5’
Đoa ̣n gen 3243 đƣơ ̣c nhân lên có kích thƣớc 218 bp. Trong trƣờng hợp không đột biến (3243A) thì HaeIII cắt đoa ̣n gen này ta ̣i hai vi ̣ trí , dẫn tới sản phẩm thu đƣơ ̣c là các đoa ̣n có kích thƣớc 22 bp, 27 bp và 169 bp.
Trong trƣờng hợp có đột biến 3243G thì vi ̣ trí này sẽ trở thành vi ̣ trí cắt của
HaeIII. Kết quả là sau khi cắt bằng enzyme HaeIII sẽ xuất hiê ̣n các đoa ̣n có kích thƣớc 22 bp, 27 bp, 72 bp và 97 bp.
32
Sản phẩm PCR đƣợc tiến hành phản ứng cắt với enzyme thích hợp theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất . Thành phần phản ứng cắt sử dụng HaeIII và DdeI
đƣơ ̣c mô tả trong bảng 8.
Bảng 8. Thành phần phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt giới hạn HaeIII và DdeI
Thành phần Thể tích
10X FastDigest® buffer 2µl Sản phẩm PCR (~0.2 µg) 10µl
FastDigest® enzyme 1µl
Nƣớc Bổ sung đến đủ 30 µl
Thành phần phản ứng s au khi đƣơ ̣c trô ̣n đều thì tiến hành ủ ở 37 0
C theo đúng khuyến cáo của nhà sản xuất. Hỗn hợp đƣợc trộn đều, ly tâm nhẹ, ủ 7–10 phút trong bể ổn nhiệt ở 370C. Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm cắt enzyme trên gel polyacrylamide 8% và nhuộm bạc để quan sát kết quả.
2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn
Điện di là kỹ thuật đƣợc dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đại phân tử đặc biệt nhƣ protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thƣớc/khối lƣợng, điện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện đƣợc đặt trong một điện trƣờng, chúng sẽ dịch chuyển hƣớng đến cực dƣơng (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng. Các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của chúng và vì thế chỉ dịch chuyển hƣớng tới cực dƣơng. Tốc độ di chuyển của các phân tử này phụ thuộc chủ yếu vào kích thƣớc phân tử acid nucleic, nhờ đó mà những đoạn ADN hay ARN khác nhau có khả năng phân biệt với nhau trên gel điện di. Gel điện di thƣờng sử dụng là agarose và polyacrylamide. Tùy vào
33
kích thƣớc đoạn ADN muốn phân tách ngƣời ta sẽ sử dụng chúng ở những nồng độ khác nhau.
2.2.4.1. Điện di gel agarose
Điện di gel agarose đƣợc thực hiện với chất nền là agarose. Nồng độ agarose dùng trong điện di nằm trong khoảng 0,5 – 2,5%. Giới hạn phân tách của gel đƣợc trình bày ở bảng 9.
Bảng 9. Dải nồng độ gel agarose dùng trong phân tách acid nucleic [6] Nồng độ gel (%w/v) Dãy kích thƣớc tách hiệu quả (kb)
0,5 2–25 0,7 0,8–10 1,2 0,4–5 1,5 0,2–3 2,0 0,1–2 2,5 0,05–1,5
Việc hiển thị các băng ADN trong gel agarose sau quá trình chạy điện di đƣợc thực hiện bằng cách nhuộm gel ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) (ủ gel trong dung dịch nhuộm chứa 200–300 ng EtBr/ml khoảng 30 phút) và có thể phát hiện dƣới ánh sáng tử ngoại (UV).
Chuẩn bị gel agarose 1,3% để kiểm tra sản phẩm PCR
Cân 1,3 gam agarose dạng bột (Invitrogen), bổ sung 100ml đệm chạy TBE 1X pH 8,3 (Tris–base 0,09M; acid boric 0,09M; EDTA 4mM)
Làm nóng chảy gel bằng cách đun trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hết (khoảng vài phút).
34
Làm nguội gel đến khoảng 50–55C, đổ agarose vào khuôn điện di đã cài lƣợc để tạo giếng.
Để gel đông ở nhiệt độ phòng (20–30 phút).
Sản phẩm PCR đƣợc trộn với loading dye (glycerol 30% v/v, bromphenol blue dạng vết) và nạp lên giếng điện di. Điện di với dòng điện 110 V trong khoảng 30 phút.
Bản gel sau điện di đƣợc nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia tử ngoại (UV).
2.2.4.2. Điện di gel polyacrylamide
Điện di trên gel polyacrylamide. Gel polyacrylamide đƣợc tổng hợp ngay trƣớc khi dùng ở nhiệt độ phòng gồm 2 thành phần chính là acrylamide và bis– acrylamide. Quá trình tổng hợp nhờ xúc tác của Ammonim persulfate (APS) và TEMED. Khi trùng hợp từ hai thành phần chính trên sẽ hình thành một polymer dạng mạng lƣới. Tùy theo nồng độ của các chất thành phần mà gel tạo thành sẽ có hệ thống lỗ nhỏ, vừa hay lớn. Tƣơng tự, tùy hàm lƣợng của bis–acrylamide mà gel có mức độ liên kết chéo cao hay thấp. Hiệu quả của sự phân tách ADN trong gel phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide (bảng 10), kích thƣớc và điện tích của ADN.
Bảng 10. Khả năng phân tách của gel polyacrylamide đối với acid nucleic [6] Nồng độ gel (%w/v) Giới hạn phân tách với ADN (bp)
5 80500
8 60400
12 50300
15 40200
35
Chuẩn bị bản gel polyacylamide 8% dùng để đi ện di kiểm tra sản phẩm PCR đƣợc cắt bằng enzyme HaeIII và DdeI (bảng 11).
Bảng 11.Các thành phần cần sử dụng cho 1 bản gel dày 0,75 mm, kích thƣớc 7cm
Thành phần Thể tích
Monoacrylamide 30% 1,33 ml
TBE 1X 3,67 ml
APS 10% 37,5 l
TEMED 3 l
Kỹ thuật nhuộm bạc: Bản gel polyacrylamide sau khi điện di đƣợc nhuộm bạc theo phƣơng pháp của Bassam (1991) [13], bao gồm các bƣớc sau:
Cố định bản gel bằng dung dịch acid acetic 7,5% trong 30 phút.
Rửa bằng nƣớc cất ba lần, mỗi lần cách nhau 5 phút.
Nhuộm bằng dung dịch bạc nitrat (1,5g/l AgNO3; 0,056% formaldehyde) trong 30 – 40 phút, tránh ánh sáng.
Rửa nƣớc khoảng 30 giây–1 phút.
Hiện băng bằng dung dịch developer (30g/l Na2CO3, 0,056% formaldehyde, 400 µg/l natri thiosulfate Na2S2O3) trong 3–5 phút.
Dừng phản ứng bằng dung dịch acid acetic lạnh 7,5% trong 1–3 phút.
Bảo quản gel bằng nƣớc cất.
Quan sát kết quả dƣới ánh sáng trắng.