Các đột biến ADN ty thể phần lớn ở dạng không đồng nhất (heteroplasmy), các đặc điểm lâm sàng của bệnh chỉ biểu hiện khi tỷ lệ không đồng nhất này đạt đến một mức độ nhất định tùy thuộc vào loại mô, tế bào. Bởi vậy để chẩn đoán đƣợc bệnh chính xác và kịp thời, ngƣời ta thƣờng sử dụng các kỹ thuật phân tích trực tiếp ADN ty thể.
Phương pháp PCR-RFLP
Phƣơng pháp cơ bản và đƣợc sử dụng phổ biến nhất để xác định đột biến điểm của ADN ty thể là PCR-RFLP. Đây là sự kết hợp kỹ thuật PCR với kỹ thuật xác định đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP). Đầu tiên, đoạn ADN ty thể có chứa đột biến đƣợc nhân lên bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc cắt bởi enzym giới hạn thích hợp. Cuối cùng, các đột biến sẽ đƣợc nhận biết qua phổ băng điện di. Phƣơng pháp PCR-RFLP giúp phát hiện đột biến thuận lợi, nhanh chóng và không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền.
Phương pháp giải trình tự
Để khẳng định chính xác đột biến, ngƣời ta phải xác định trình tự nucleotide đoạn ADN mang đột biến. Nguyên tắc của hầu hết các phƣơng pháp giải trình tự hiện nay đều dựa trên phƣơng pháp đƣợc Sanger và cộng sự công bố năm 1977, đƣợc gọi là phƣơng pháp dideoxyribonuleotide (gọi tắt là phƣơng pháp dideoxy). Theo phƣơng pháp này, một trình tự Sanger giới hạn đƣợc bắt đầu tại một vị trí cụ thể trên chuỗi ADN bằng cách sử dụng một oligonucleotide ngắn, có trình tự bổ sung với trình tự của mẫu tại vị trí đó. Các mồi oligonucleotide đƣợc kéo dài nhờ tác dụng của enzyme ADN polymerase. Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại deoxynucleotide A, T, G, C trong đó có một loại là di-deoxynucleotide để ngắt phản ứng kéo dài chuỗi. Các đoạn ngắn ADN mới đƣợc tổng hợp sau đó đƣợc điện di
23
trên gel polyacrylamide, hình ảnh thu đƣợc sẽ đƣợc dùng để phân tích trình tự ADN. Ngày nay, phƣơng pháp giải trình tự tự động đƣợc áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm trên thế giới nhƣng cơ bản vẫn áp dụng nguyên lý nhƣ trên. Ngƣời ta đã tiến hành cải tiến, sử dụng chất huỳnh quang, cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ nhạy rất cao. Ƣu điểm lớn nhất của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến nhƣ: loại đột biến, vị trí, hậu quả. Tuy nhiên nó có hạn chế là đòi hỏi sản phẩm khuếch đại ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt tiền. Ngoài ra, tỷ lệ không đồng nhất mà phƣơng pháp này có thể xác định đƣợc khoảng 25% trở lên.
Với mục tiêu phát hiện sớm bệnh ở giai đoạn đầu để điều trị, ngƣời ta sử dụng một số phƣơng pháp có khả năng phát hiện mức độ không đồng nhất của ADN ty thể ở một tỷ lệ rất thấp mà phƣơng pháp PCR-RFLP không phân tích đƣợc. Đó là phƣơng pháp PCR định lƣợng (Realtime PCR) và sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính (DHPLC).
Phương pháp Realtime PCR
Realtime PCR sử dụng phân tử phát huỳnh quang để ghi lại quá trình tăng lƣợng ADN đƣợc nhân lên trong phản ứng PCR tỷ lệ thuận với sự tăng tín hiệu huỳnh quang. PCR định lƣợng cho phép xác định số bản sao ADN ty thể ban đầu có trong mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao. Có hai loại phƣơng pháp phân tích hay đƣợc sử dụng:
- Phƣơng pháp sử dụng chất nhuộm màu gắn với ADN: Chất nhuộm này có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi ADN, làm cho sợi đôi ADN phát đƣợc ánh sáng huỳnh quang khi nhận đƣợc nguồn sáng kích thích.
- Phƣơng pháp sử dụng đầu dò oligonucleotide có gắn phân tử huỳnh quang. Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặp của đầu dò lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại, khi đó sẽ có sự phát huỳnh quang từ ống phản ứng khi nó nhận đƣợc nguồn sáng kích thích.
Phƣơng pháp PCR định lƣợng cho phép định lƣợng đột biến ADN ty thể với mức độ không đồng nhất thấp dƣới 1% [73].
24
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính (DHPLC)
Phƣơng pháp DHPLC sử dụng cột sắc ký kỵ nƣớc trên cơ sở sắc ký lỏng pha đảo để phân tách ADN dị sợi kép (heteroduplex) với đồng sợi kép (homoduplex) tại nhiệt độ tối ƣu. Các mạch ADN đƣợc phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác. Các phân tử dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thƣờng [43]. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phƣơng pháp này để sàng lọc toàn bộ genome ty thể, hoặc một vùng nhất định của ADN ty thể để xác định đột biến. Để định lƣợng mức độ không đồng nhất của ty thể, ngƣời ta đã xác định mối quan hệ giữa diện tích của đỉnh sắc ký có dị sợi kép và mức độ không đồng nhất của ty thể. Phƣơng pháp DHPLC cho phép định lƣợng đột biến ADN ty thể thấp tới 1% [43].