Đoạn gen chứa đột biến A10398G đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR và đƣợc tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction Kit của hãng QIAGEN (Đức). Quy trình tinh sạch đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất nhƣ sau:
36
- Đoạn gen chứa đột biến A10398G sau khi đƣợc khuếch đại bằng PCR, đƣợc điện di trên gel agarose 1%.
- Cắt các mảnh gel agarose chứa ADN, cho các mảnh này vào ống sạch - Bổ sung 3 thể tích đệm QG cho một thể tích gel (100mg ≈ 100µl). - Ủ ở 50o
C trong 10 phút (hoặc cho đến khi miếng gel đã hòa tan hoàn toàn). Trong thời gian ủ, cứ 3 phút lại vortex ống.
- Sau khi gel đã hòa tan hoàn toàn, kiểm tra nếu màu sắc của hỗn hợp có màu vàng là đƣợc. Nếu hỗn hợp có màu cam hoặc tím thì thêm 10 µl Natri acetat 3M, pH 5,0 vào hỗn hợp và mix.
- Thêm một thể tích isopropanol vào mẫu và mix
- Đƣa mẫu lên cột, ly tâm 1 phút, tốc độ 13000 rpm, nhiệt độ phòng.
- Đổ bỏ phần dịch qua cột, thêm 0,5 ml đệm QG lên cột, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm trong 1 phút
- Để rửa, bổ sung 0,75 ml đệm PE lên cột, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm trong 1 phút
- Đổ bỏ phần dịch qua cột, ly tâm cột thêm một phút ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm.
- Để thôi ADN: thêm 50 µl đêm EB lên màng, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm trong 1 phút.
- Tiếp tục thêm 50 µl đêm EB lên màng, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm trong 1 phút.
- Speed vac ống đến thể tích 20 µl, điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8%.
ADN sau khi tinh sạch đƣợc gửi đi giải trình tự. 2.2.6. Tính toán thống kê
Xƣ̉ lý các số liê ̣u phân tích theo các phƣơng pháp thố ng kê thƣờng dùng . So sánh các đặc trƣng thống kê mẫu bằng phép ki ểm định 2 với mức ý nghĩa α = 0,05.
37
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN