Tình hình nghiên cứu ở trong nƣớc

Cho đến nay các nghiên cứu về đột biến ADN ty thể ở ngƣời Việt Nam vẫn chƣa nhiều, số liệu còn hạn chế và chƣa có tính hệ thống.

Phan Văn Chi và cs (2004) khi nghiên cứu giải mã genome ty thể các tộc ngƣời Việt Nam đã tìm thấy một số biến đổi của ADN ty thể ở ngƣời Việt Nam thuộc vùng D-loop, các gen ND1, ND2, ND5, ND6, cytochrome b, rRNA 12S, rRNA

16S, COXI, COXII, COXIII, ATP6, ATP8. Ngoài ra, trong nghiên cứu này đã tìm

thấy đột biến A3243G ở bệnh nhân mắc bệnh MELAS (2/34 bệnh nhân mang đột biến) [2].

Chu Văn Mẫn và cs (2009) đã sử dụng phƣơng pháp PCR-RFLP kết hợp giải trình tự ADN và đã xác định thấy đột biến A3243G có mặt ở bệnh nhân và mẹ bệnh nhân trong một gia đình có ngƣời mắc hội chứng MELAS [4].

Phạm Hùng Vân và cs (2010) đã sử dụng phƣơng pháp giải trình tự trực tiếp ADN ty thể tách chiết từ máu bệnh nhân mang bệnh LEBER, và đã xác định thấy 9/12 ca có đột biến ADN ty thể, 7 trong số 9 ca này mang đột biến G11778A là đột biến nặng và thƣờng gặp nhất, 2 ca còn lại mang đột biến T14484C [8].

25

Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Hữu Nghĩa đã sử dụng phƣơng pháp giải trình tự tách dòng, và đã xác định thấy nhiều đột biến (tại 14 vị trí) trên vùng D-Loop ở một ngƣời lao động thƣờng xuyên tiếp xúc với bức xạ ion hóa [5].

Liên quan đến xác định đột biến ADN ty thể ở bệnh nhân ung thƣ ngƣời Việt Nam, kết quả thu đƣợc còn rất ít. Cho đến nay, chúng tôi chỉ tìm thấy 1 nghiên cứu trên đối tƣợng bệnh nhân ung thƣ vú [1]. Nghiên cứu đƣợc thực hiện với số mẫu hạn chế (2 bệnh nhân). Kết quả phân tích đã cho thấy có đột biến điểm và đột biến mất đoạn 280 bp trong vùng D-loop của bệnh nhân ung thƣ vú ngƣời Việt Nam.

Nhƣ vậy, nhƣ đã tổng quan ở trên, các nghiên cứu điều tra trên thế giới đã cho thấy đột biến ADN ty thể liên quan chặt chẽ với nhiều loại bệnh, nhất là bệnh ty thể và bệnh ung thƣ. Đối với bệnh ung thƣ đại trực tràng, để đạt đƣợc hiệu quả điều trị tốt thì bệnh nhân cần đƣợc chẩn đoán càng sớm, càng tốt. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu những biến đổi của các gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng với mục đích tìm ra mối liên quan giữa những biến đổi này với các đặc điểm lâm sàng của bệnh, từ đó giúp cho việc việc chẩn đoán sớm và theo dõi sau điều trị của bệnh ung thƣ đại trực tràng đƣợc tốt hơn.

26

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. NGUYÊN LIỆU

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là mẫu mô của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng đƣợc lấy tại vị trí khối u và vị trí lân cận khối u (cách khối u khoảng 5-10 cm). Mẫu mô sử dụng trong nghiên cứu này gồm 61 mẫu do Khoa Tế bào – Giải phẫu bệnh, bệnh viện K Tam Hiệp – Hà Nội và Khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức – Hà Nội cung cấp trong thời gian từ tháng 8 năm 2010 đến tháng 6 năm 2012. Mẫu sử dụng đã đƣợc thống kê ở bảng 3. Mẫu mô đƣợc đựng trong ống eppendorf, vận chuyển từ bệnh viện về trong nitơ lỏng và bảo quản trong tủ lạnh sâu âm 80C cho tới khi tiến hành những nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 3. Thống kê mẫu sử dụng

Bệnh viện cung cấp mẫu Số mẫu Ung thƣ đại tràng Ung thƣ trực tràng Ung thƣ giƣ̃a đại và trực tràng K2 Tam Hiệp 31 12 17 2 Việt Đức 30 18 12 0 2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu đƣợc liệt kê trong bảng 4.

Bảng 4. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong nghiên cƣ́u

Hóa chất Hãng cung cấp Mục đích

QIA amp DNA minikit QIAGEN (Đức) Tách ADN tổng

số

QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN (Đức) Tinh sạch ADN

27

SDS, Acrylamide, Bis-Acrylamide Pharmacia (Thụy Điển)

Các cặp mồi 10398, 3243 IDT (Mỹ)

PCR

Master Mix 2X NEB (Mỹ)

Enzyme Fastdigest® HaeIII Enzyme Fastdigest®DdeI

Fermentas (Đức) RFLP

Các hóa chất khác nhƣ: acid boric, Tris – base, EDTA, kali phosphate, ethanol, natri carbonat, bạc nitrat… đƣợc sử dụng đều có độ sạch phân tích.

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị và máy móc của phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Cộng nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đƣợc sƣ̉ du ̣ng trong nghiên cƣ́u đƣợc thống kê trong bảng 5.

Bảng 5. Các thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cƣ́u

STT Tên thiết bị Hãng sản xuất

1 Máy PCR (GeneAmp PCR system 9700) Applied BioSciences (Mỹ)

2 Nguồn điện di PowerPac™ HC Bio–rad (Mỹ)

3 Bể điện di Mini–Sub Cell GT, MiniProtean 3 cell Bio–rad (Mỹ)

3 Máy ly tâm lạnh 5417R Eppendorf (Đức)

4 Tủ lạnh – 20C và – 80C Nuaire (Mỹ)

5 Bể ổn nhiệt ED5 Julabo (Đức)

6 Tủ an toàn sinh học Nuaire (Mỹ)

28

Ngoài ra, còn các thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu nhƣ cân phân tích, cân kỹ thuật, máy vortex, máy minispin, lò vi sóng…

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để tiến hành phân tích đột biến A3243G và A10398G, chúng tôi thực hiện phƣơng pháp PCR-RFLP. Trƣớc hết ADN tổng số đƣợc tách chiết từ mô u và mô lân cận u. Tiếp đó, đoạn ADN chứa đột biến đƣợc nhân lên bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sự có mặt của đoạn gen chứa đột biến này đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di. Bƣớc tiếp theo chúng tôi thực hiện cắt đoạn gen này bằng enzym giới hạn thích hợp để nhận biết đột biến qua phổ băng điện di. Để khẳng định kết quả, đoạn gen chứa đột biến đƣợc tinh sạch và đƣợc gửi đi giải trình tự.

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô

Mẫu mô đại trực tràng bao gồm mẫu mô u và mẫu mô lân cận khối u của cùng một bệnh nhân đƣợc lấy ra từ tủ 80C, rã đông và rửa bằng đệm Kali phosphate 100mM, pH 8,0. Sau khi rửa, hai mẫu mô đƣợc cân với lƣợng tƣơng đƣơng 0,03–0,05g/mẫu và cho vào hai ống eppendorf riêng biệt.

Tiến hành tách chiết ADN tổng số sử dụng kit tách chiết ADN từ mô- QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.

 Bổ sung vào mỗi ống epp: 180 µl buffer ATL và 20 µl proteinase K, vortex và ủ ở 56ºC trong khoảng 3h để mô đƣợc thủy phân hoàn toàn.

 Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.

 Thêm 200 µl buffer AL vào mẫu, vortex trong 15s, và ủ ở 70ºC trong 10 phút. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.

 Thêm 200 µl ethanol (96–100%) vào mẫu, vortex trong 15s. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.

 Cho toàn bộ hỗn hợp vào cột QIAamp Spin Column. Đóng nắp, ly tâm 8000 rpm trong 1 phút. Đặt cột vào ống epp sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.

 Bổ sung lên cột 500 µl buffer AW1. Đóng nắp, ly tâm ở 8000 rpm trong 1 phút. Đặt cột vào ống epp sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.

29

 Bổ sung lên cột 500 µl buffer AW2. Đóng nắp, ly tâm ở tốc độ tối đa 14.000 rpm trong 3 phút. Có thể lặp lại bƣớc này thêm 1 phút nếu chƣa hết dịch trên cột.

 Thu mẫu trên cột: Đặt cột vào ống 1.5 ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch. Thêm 200 µl buffer AE hoặc nƣớc sạch. Đặt ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 8000 rpm) trong 1 phút. Lặp lại bƣớc trên 2 lần.

 Làm khô dịch thu đƣợc bằng máy Speed vac trong 2h.

 Hòa tan ADN trong 50µl buffer AE , bảo quản ở –20ºC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

 Kiểm tra quá trình tách chiết ADN tổng số bằng điện di trên gel agarose 0,8–1%.

2.2.2. Khuếch đại đoa ̣n gen 10398 và đoạn gen 3243 ADN ty thể bằng PCR

Kỹ thuật PCR hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp là kỹ thuật cho phép nhân bản invitro các đoạn ADN (gen) lên hàng triệu lần so với ban đầu (1012–1013

bản sao). Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là phối hợp khả năng lai đặc hiệu của ADN và khả năng tổng hợp ADN invitro của ADN polymerase. Phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại của 3 bƣớc cơ bản: biến tính (Denaturing), gắn mồi (Annealing) và tổng hợp (Extending).

Các cặp mồi đƣợc chúng tôi thiết kế bằng chƣơng trình Primer premier 5. Trình tự các cặp mồi đƣợc trình bày ở bảng 6.

Bảng 6. Các cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR

Tên mồi Trình tự mồi Kích thƣớc sản

phẩm (bp) 10398 f 5’-CCTGCCACTAATAGTTATGTC-3’ 246 r 5’-GATATGAGGTGTGAGCGATA-3’ 3243 f 5’-CTGTACGAAAGGACAAGAGA-3’ 218 r 5’-ACAATGAGGAGTAGGAGGTT-3’

30

PCR đƣơ ̣c thƣ̣c hiê ̣n với các thành phần của phản ứng nhƣ trong bảng 7.

Bảng 7. Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 12,5 l Thành phần Thể tích (l) Nồng độ cuối cùng Master Mix 2x 6,25 1X Primer F 10µM 0,25 0,2 M Primer R 10µM 0,25 0,2 M ADN khuôn 2 Nƣớc 3,75

Chu trình nhiệt đối với cặp mồi 10398 nhƣ sau:

31

2.2.3. Phân tích RFLP

Phƣơng pháp RFLP sử dụng các enzyme giới hạn thích hợp phân cắt sản phẩm PCR để nhận biết đột biến qua phổ băng điện di.

+ Vớ i đoa ̣n gen 10398 ADN ty thể: sƣ̉ du ̣ng enzyme FastDigest® DdeI. Enzyme

này có vị trí nhận biết trên ADN nhƣ sau: 5’…C/TNAG…3’ 3’…GANT/C…5’

Phân tích vi ̣ trí nhâ ̣n biết các enzyme giới ha ̣n trên đoa ̣n gen 246 bp và nhâ ̣n thấy trong trƣờng hợp 10398A thì enzyme DdeI sẽ cắt đoa ̣n gen ở một vị trí và tạo thành các đoa ̣n oligonucleotide có kích thƣớc 50 bp và 196 bp.

Trong trƣờng hợp 10398 G thì enzyme DdeI sẽ cắt đoa ̣n gen ở 2 vị trí và kết quả cắt enzyme thu đƣợc các đoạn oligonucleotide có kích thƣớc 38 bp, 50 bp và 158 bp.

+ Vớ i đoa ̣n gen 3243 ADN ty thể: sƣ̉ du ̣ng enzym e cắt FastDigest® HaeIII nhận biết vi ̣ trí cắt trên ADN ta ̣i trình tƣ̣:

5’…GG/CC…3’ 3’…CC/GG…5’

Đoa ̣n gen 3243 đƣơ ̣c nhân lên có kích thƣớc 218 bp. Trong trƣờng hợp không đột biến (3243A) thì HaeIII cắt đoa ̣n gen này ta ̣i hai vi ̣ trí , dẫn tới sản phẩm thu đƣơ ̣c là các đoa ̣n có kích thƣớc 22 bp, 27 bp và 169 bp.

Trong trƣờng hợp có đột biến 3243G thì vi ̣ trí này sẽ trở thành vi ̣ trí cắt của

HaeIII. Kết quả là sau khi cắt bằng enzyme HaeIII sẽ xuất hiê ̣n các đoa ̣n có kích thƣớc 22 bp, 27 bp, 72 bp và 97 bp.

32

Sản phẩm PCR đƣợc tiến hành phản ứng cắt với enzyme thích hợp theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất . Thành phần phản ứng cắt sử dụng HaeIII và DdeI

đƣơ ̣c mô tả trong bảng 8.

Bảng 8. Thành phần phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt giới hạn HaeIII và DdeI

Thành phần Thể tích

10X FastDigest® buffer 2µl Sản phẩm PCR (~0.2 µg) 10µl

FastDigest® enzyme 1µl

Nƣớc Bổ sung đến đủ 30 µl

Thành phần phản ứng s au khi đƣơ ̣c trô ̣n đều thì tiến hành ủ ở 37 0

C theo đúng khuyến cáo của nhà sản xuất. Hỗn hợp đƣợc trộn đều, ly tâm nhẹ, ủ 7–10 phút trong bể ổn nhiệt ở 370C. Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm cắt enzyme trên gel polyacrylamide 8% và nhuộm bạc để quan sát kết quả.

2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn

Điện di là kỹ thuật đƣợc dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đại phân tử đặc biệt nhƣ protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thƣớc/khối lƣợng, điện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện đƣợc đặt trong một điện trƣờng, chúng sẽ dịch chuyển hƣớng đến cực dƣơng (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng. Các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của chúng và vì thế chỉ dịch chuyển hƣớng tới cực dƣơng. Tốc độ di chuyển của các phân tử này phụ thuộc chủ yếu vào kích thƣớc phân tử acid nucleic, nhờ đó mà những đoạn ADN hay ARN khác nhau có khả năng phân biệt với nhau trên gel điện di. Gel điện di thƣờng sử dụng là agarose và polyacrylamide. Tùy vào

33

kích thƣớc đoạn ADN muốn phân tách ngƣời ta sẽ sử dụng chúng ở những nồng độ khác nhau.

2.2.4.1. Điện di gel agarose

Điện di gel agarose đƣợc thực hiện với chất nền là agarose. Nồng độ agarose dùng trong điện di nằm trong khoảng 0,5 – 2,5%. Giới hạn phân tách của gel đƣợc trình bày ở bảng 9.

Bảng 9. Dải nồng độ gel agarose dùng trong phân tách acid nucleic [6] Nồng độ gel (%w/v) Dãy kích thƣớc tách hiệu quả (kb)

0,5 2–25 0,7 0,8–10 1,2 0,4–5 1,5 0,2–3 2,0 0,1–2 2,5 0,05–1,5

Việc hiển thị các băng ADN trong gel agarose sau quá trình chạy điện di đƣợc thực hiện bằng cách nhuộm gel ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) (ủ gel trong dung dịch nhuộm chứa 200–300 ng EtBr/ml khoảng 30 phút) và có thể phát hiện dƣới ánh sáng tử ngoại (UV).

Chuẩn bị gel agarose 1,3% để kiểm tra sản phẩm PCR

 Cân 1,3 gam agarose dạng bột (Invitrogen), bổ sung 100ml đệm chạy TBE 1X pH 8,3 (Tris–base 0,09M; acid boric 0,09M; EDTA 4mM)

 Làm nóng chảy gel bằng cách đun trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hết (khoảng vài phút).

34

 Làm nguội gel đến khoảng 50–55C, đổ agarose vào khuôn điện di đã cài lƣợc để tạo giếng.

 Để gel đông ở nhiệt độ phòng (20–30 phút).

 Sản phẩm PCR đƣợc trộn với loading dye (glycerol 30% v/v, bromphenol blue dạng vết) và nạp lên giếng điện di. Điện di với dòng điện 110 V trong khoảng 30 phút.

 Bản gel sau điện di đƣợc nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia tử ngoại (UV).

2.2.4.2. Điện di gel polyacrylamide

Điện di trên gel polyacrylamide. Gel polyacrylamide đƣợc tổng hợp ngay trƣớc khi dùng ở nhiệt độ phòng gồm 2 thành phần chính là acrylamide và bis– acrylamide. Quá trình tổng hợp nhờ xúc tác của Ammonim persulfate (APS) và TEMED. Khi trùng hợp từ hai thành phần chính trên sẽ hình thành một polymer dạng mạng lƣới. Tùy theo nồng độ của các chất thành phần mà gel tạo thành sẽ có hệ thống lỗ nhỏ, vừa hay lớn. Tƣơng tự, tùy hàm lƣợng của bis–acrylamide mà gel có mức độ liên kết chéo cao hay thấp. Hiệu quả của sự phân tách ADN trong gel phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide (bảng 10), kích thƣớc và điện tích của ADN.

Bảng 10. Khả năng phân tách của gel polyacrylamide đối với acid nucleic [6] Nồng độ gel (%w/v) Giới hạn phân tách với ADN (bp)

5 80500

8 60400

12 50300

15 40200

35

Chuẩn bị bản gel polyacylamide 8% dùng để đi ện di kiểm tra sản phẩm PCR đƣợc cắt bằng enzyme HaeIII và DdeI (bảng 11).

Bảng 11.Các thành phần cần sử dụng cho 1 bản gel dày 0,75 mm, kích thƣớc 7cm

Thành phần Thể tích

Monoacrylamide 30% 1,33 ml

TBE 1X 3,67 ml

APS 10% 37,5 l

TEMED 3 l

Kỹ thuật nhuộm bạc: Bản gel polyacrylamide sau khi điện di đƣợc nhuộm bạc theo phƣơng pháp của Bassam (1991) [13], bao gồm các bƣớc sau:

 Cố định bản gel bằng dung dịch acid acetic 7,5% trong 30 phút.

 Rửa bằng nƣớc cất ba lần, mỗi lần cách nhau 5 phút.

 Nhuộm bằng dung dịch bạc nitrat (1,5g/l AgNO3; 0,056% formaldehyde) trong 30 – 40 phút, tránh ánh sáng.

 Rửa nƣớc khoảng 30 giây–1 phút.

 Hiện băng bằng dung dịch developer (30g/l Na2CO3, 0,056% formaldehyde, 400 µg/l natri thiosulfate Na2S2O3) trong 3–5 phút.

 Dừng phản ứng bằng dung dịch acid acetic lạnh 7,5% trong 1–3 phút.

 Bảo quản gel bằng nƣớc cất.

 Quan sát kết quả dƣới ánh sáng trắng.

2.2.5. Tinh sạch ADN

Đoạn gen chứa đột biến A10398G đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR và đƣợc tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction Kit của hãng QIAGEN (Đức). Quy trình tinh sạch đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất nhƣ sau:

36

- Đoạn gen chứa đột biến A10398G sau khi đƣợc khuếch đại bằng PCR, đƣợc điện di trên gel agarose 1%.

- Cắt các mảnh gel agarose chứa ADN, cho các mảnh này vào ống sạch - Bổ sung 3 thể tích đệm QG cho một thể tích gel (100mg ≈ 100µl). - Ủ ở 50o