1 .4.CHEMOKINE CXCL2 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƢ ĐẠI TRỰC
3.2.2.Kết quả xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên
phiên mã của gen CXCL12
Gen CXCL12 nằm ở cánh dài NST số 10 có kích thƣớc 21941bp. Vị trí khởi đầu phiên mã từ nucleotide 5001, khởi đầu dịch mã từ vị trí nucleotide 5093, sản phẩm mã hóa là chemokine CXCL12 [32]. Đảo CpG của gen thuộc đoạn trình tự xung quanh vị trí nucleotide 5001.
Để đảm bảo vùng promoter, vị trí khởi đầu phiên mã, dịch mã nằm trong vùng khảo sát, chúng tôi tiến hành phân tích trên một đoạn trình tự dài 3000 nu (từ nucleotide 3001 đến 6001). Sử dụng phần mềm MethPrimer (Li Lab , UCSF) và phần mềm cpgplot (EMBOSS) để dƣ̣ đoán các đảo CpG thuộc đoạn trình tự trên với
các tiêu chuẩn (kích thƣớc mỗi đảo ≥ 100 bp, tỷ lệ GC ≥ 50% và tỷ số CpG giữa giá trị quan sát trên giá trị mong đợi ≥ 0,6), chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau (hình 10 và 11):
Hình 10. Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm MethPrimer [37]
Sequence Name: Sequence Length: 3001 CpG island prediction results
(Criteria used: Island size > 100, GC Percent > 50.0, Obs/Exp > 0.6) 5 CpG island(s) were found in your sequence
Size (Start - End) Island 1 297 bp (137 - 433)
Island 2 161 bp (623 - 783) Island 3 225 bp (891 - 1115) Island 4 1346 bp (1174 - 2519) Island 5 341 bp (2526 - 2866)
Hình 11. Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm cpgplot (EMBOSS)[28]
CPGPLOT islands of unusual CG composition 3001-6001 from 1 to 3001 Observed/Expected ratio > 0.60 Percent C + Percent G > 50.00 Length > 100 Length 297 (137..433) Length 161 (623..7833) Length 225 (891..1115) Length 1346 (1174..2519) Length 341 (2526..2866)
Kết quả khảo sát từ nucleotide 3001 đến 6001, cả 2 phần mềm đều cho: Đoạn khảo sát chứa 5 đảo CpG có kích thƣớc khác nhau và kích thƣớc các đảo theo thứ tự so sánh giữa 2 phần mềm là hoàn toàn giống nhau. Đảo 4 có kích thƣớc lớn nhất (1346bp) từ vị trí 1174 đến 2519 đảo 2 có kích thƣớc nhỏ nhất (161bp).
Với đoạn trình tự khảo sát (từ nucleotide 3001 đến 6001) thì vị trí khởi đầu phiên mã là nucleotide số 5001 và vị trí khởi đầu dịch mã là nucleotide số 5093 (theo NCBI) cả hai vị trí trên đều thuộc đảo CpG số 4. Vì vâ ̣y, có thể vùng promoter của gen CXCL12 có trình tự nằm chủ yếu ở đảo này.
Tuy nhiên, khi tra cứu cơ sở dƣ̃ liê ̣u nucleotide trong NCBI , chúng tôi lại không tìm thấy trình tƣ̣ promoter của gen CXCL12. Vì vậy, để xác định đảo CpG tƣơng ƣ́ng với vùng promoter của gen , cần phải dƣ̣ đoán vùng promoter của gen
CXCL12.[31]
Sƣ̉ du ̣ng 2 chƣơng trình dƣ̣ đoán promoter của gen , kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Chƣơng trình Proscan (BIMAS) với tiêu chuẩn mặc định sẵn có , vùng promoter đƣơ ̣c xác đi ̣nh gồm 250 nucleotide (tƣ̀ vi ̣ trí nucleotide 4696 đến 4946 của gen CXCL12).[36]
- Chƣơng trình FirstEF với các tiêu chuẩn đã nêu , vùng promoter đƣợc xác đi ̣nh gồm 570 nucleotide (tƣ̀ vi ̣ trí nucleotide 4474 đến 5043 của gen CXCL 12). Xác xuất dự đoán có độ chính xác rất cao : P(promoter) = 1,0000; P(exon) = 1,0000 và P(donor) = 0,9999.
Chƣơng trình FirstEF cho kết quả dƣ̣ đoán vùng promoter và exon 1 của gen. Vị trí của exon 1 dƣ̣ đoán trùng gần nhƣ hoàn toàn với vi ̣ trí exon tƣơng ƣ́ng đã có trong trình tƣ̣ của gen CXCL12 (RefSeqGene -NG_016861.1). Vì vậy , kết quả dƣ̣ đoán này có đô ̣ tin câ ̣y cao.[27]
Kết quả dƣ̣ đoán vùng promoter của gen CXCL12 bằng chƣơng trình FirstEF cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Wendt và cs (2006) khi sử dụng phần mềm dƣ̣ đoán PromoterInspector . Các tác giả này đã xác định đƣợc 1 vùng promoter dài 659 bp (-491,+168) trong đó có 491 bp nằm phía trƣớc của vị trí khởi đầu phiên mã (vị trí +1). Điều đó chứng tỏ vùng promoter này nằm hoàn toàn trong đảo CpG số 4 đã phân tích ở trên [22].
Cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng đƣợc thiết kế đặc hiệu cho việc khuếch đại trình tự bị methyl hóa (cặp mồi methyl) và không bị methyl hóa (cặp mồi unmethyl).