1 .4.CHEMOKINE CXCL2 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƢ ĐẠI TRỰC
3.2.3.Khuyếch đại đoạn trình tự nằm trong đảo CpG thuộc vùng promoter
3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TÌNH TRẠNG METHYL HÓA GEN CXCL12
3.2.3.Khuyếch đại đoạn trình tự nằm trong đảo CpG thuộc vùng promoter
promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP
ADN tổng số sau khi đƣợc tách chiết đã đƣợc xử lý với sodium bisulfite . Tiếp theo, ADN đƣơ ̣c tinh sạch, sau đó khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi methyl và unmethyl đặc hiệu. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trên gel polyacrylamide và nhuộm bạc (hình 12 và 14).
Hình 12. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12
(điê ̣n di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)
M: Thang ADN chuẩn 100 bp.
Giếng 1,2, 3, 4 : Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi methyl (242 bp).
Kết quả trên hình 12 và 14 cho thấy, sản phẩm PCR có kích thƣớc tƣơng ứng với kích thƣớc mong đợi , dài 242bp (với cặp mồi methyl, và 241bp khi dùng cặp mồi unmethyl.
Nhƣ vậy, bằng kỹ thuật MSP, chúng tôi đã nhân thành công trình tự nằm trong vùng promoter của gen CXCL12.
3.2.4. Phân tích tích tình trạng methyl hóa vùng promoter của gen
CXCL12 ở bênh ung thƣ đại trực tràng
3.2.4.1. So sánh tỷ lệ methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 giữa mô bệnh và mô lân cận
Chúng tôi đã tiến hành phân tích MSP thành công trên 25 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng, trong đó có 20 mẫu khảo sát trên mô bệnh lấy tại vị trí ung thƣ của ngƣời bệnh và 16 mẫu trên mô lân cận cách 5cm so với vị trí ung thƣ, có 11/25 bệnh nhân đƣơ ̣c khảo sát thành công trên cả mô u và mô lân cận u với tỷ lệ nhƣ trên bảng 13, hình 13.
Bảng 13. Tỷ lệ methyl hóa và không methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 trên mô u và mô lân cận u
Mô của bệnh nhân Mô lân cận u Mô u Tính chung
U M U M U M Mô u và lân cận u (n=11) 72,7% (8) 27,3% (3) 63,63% (7) 63,63% (7) 90,91% (10) 81,81% (9) Mô lân cận u (n=5) 40% (3) 60% (3) - - 40% (2) 60% (3) Mô u (n=9) - - 0% (0) 100% (9) 0% (0) 100% (9) Tổng cộng (n=25) 62,5% (11) 37,5% (6) 43,75% (7) 80% (16) 48% (12) 84% (21)
Nhƣ vậy, qua thống kê bảng 13 ta thấy đối với riêng 11 bệnh nhân khảo sát thành công trên cả mô u và lân cận u thì tỷ lệ methyl hóa xảy ra tại vùng promoter của gen CXCL12 trên mô u là cao hơn hẳn (chiếm 63,63%) so với tỷ lệ đó trên mô lân cận u (chiếm 27,3). Trong khi đó, tỷ lệ unmethyl trên mô lân cận u lại cao (chiếm 72,7%), hơn so với tỷ lệ đó trên mô u (chiếm 63,63%). Tính chung trên cả mô u và lân cận u ở 11 bệnh nhân trên thì có 9 bệnh nhân (chiếm 81,81%) là bị methyl hóa trên một trong hai mô và chỉ có 2 bệnh nhân (chiếm 19,19%) là không bị methyl hóa trên mô nào.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Mô U Mô lân cận u
loại mô Tỷ l ẹ % U M
Hình 13. Tỷ lệ methyl và unmethyl khảo sát trên 2 loại mô u và lân cận u
U: unmethyl; M: methyl
Nhìn vào biểu đồ (hình 13) ta thấy rõ hơn sự khác biệt về tỷ lệ methyl và unmethyl giữa 2 loại mô u và lân cận u. Đối với mô u, tỷ lệ methyl cao gấp gần 2 lần (80%) so với tỷ lệ unmethyl (43,75%). Đối vối mô lân cận u thì tỷ lệ methyl lại thấp hơn (37,5%) so với tỷ lệ unmethyl (62,5%).
Thống kê riêng trên 20 mẫu mô u (trong đó bao gồm cả 11 mẫu mô u thuộc 11 bệnh nhân đã phân tích ở trên) cho thấy tỷ lệ methyl hóa trên mô u là khá cao (chiếm 80%) trong khi tỷ lệ unmethyl chỉ chiếm 43,75% (bảng 13). Còn đối với 16 mẫu mô lân cận u khảo sát riêng (bao gồm cả 11 mẫu mô u thuộc 11 bệnh nhân đã phân tích ở trên) thì tỷ lệ methyl hóa thấp hơn hẳn (chiếm 37,5%) so với tỷ lệ unmethyl trên mô đó (chiếm 62,5%).
Tổng kết chung trên 25 bệnh nhân đã khảo sát thành công thì có tới 21 bệnh nhân (chiếm 84%) bị methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12, trong khi chỉ có 4 bệnh nhân (chiếm 16%) không có sự methyl hóa trên cả hai mô. Qua 11 mẫu bệnh nhân khảo sát thành công trên cả mô u và lân mô cận u ta thấy có những bệnh nhân xuất hiện cả băng methyl và unmethyl cùng lúc trên mô u hoặc mô lân cận u, những bệnh nhân nhƣ vậy gọi là bệnh nhân bị methyl hóa không hoàn toàn. Còn những
bệnh nhân có xuất hiện băng methyl trên cả mô u và mô lân cận u hoặc xuất hiện băng methyl trên mô u và unmethyl trên mô lân cận u là trƣờng hợp bị methyl hóa hoàn toàn (hình 14).
Qua so sánh tỷ lệ methyl hóa giữa mẫu u và mẫu lân cận u ta thấy sự sai khác về tỷ lệ methyl giữa 2 nhóm mẫu này có ý nghĩa thống kê với p<0,05.
Hình 14. Hình ảnh điện di sản phẩm MSP của gen CXCL12 của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng (điê ̣n di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)
M: Thang chuẩn ADN 100 bp; giếng 1-4: Bệnh nhân số 1 (methyl hóa không hoàn toàn trên mô lân cận u); giếng 5-8: Bệnh nhân số 2 (methyl hóa không hoàn toàn trên mô u); giếng 1,3,5,7: Unmethyl; giếng 2,4,6,8: Methyl.Trong đó Giếng 1, 2 là khảo sát trên mô u của bệnh nhân 1. Giếng 3, 4 là trên mô lân cận u của bệnh nhân số 1.
Tóm lại, qua thống kê ta thấy tỷ lệ methyl hóa xảy ra chủ yếu trên mô u là nơi tập trung nhiều tế bào ung thƣ nhất của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Điều đó cho thấy sự methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 có thể là yếu tố liên quan tới sự phát triển của căn bệnh này. Tỷ lệ methyl hóa cũng xảy ra trên mô lân cận là nơi cách xa hơn so với vị trí khối u (cách 5cm) cho thấy có thể mô lân cận này có chứa một số tế bào ung thƣ xâm lấn xen lẫn với các tế bào bình thƣờng. Tuy nhiên, tỷ lệ methyl hóa ở khu vực này thấp hơn nhiều so với ở mô u (chỉ chiếm khoảng 37,5%).
3.2.4.2. Phân tích tình trạng methyl hóa theo các đặc điểm lâm sàng của bê ̣nh nhân ung thư đại trực tràng
Tiến hành so sánh tỷ lệ methyl hóa ở vùng promoter của gen CXCL12 với các đặc điểm lâm sàng của 25 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng đã khảo sát thành công, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau (bảng 14): (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 14. Thống kê tỷ lệ methyl hóa trong vùng promoter của gen CXCL12
theo các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng
Đặc điểm Số lƣợng Số bệnh nhân bị methyl Tỷ lệ %
Tuổi ≥70 3 2 66,7
<70 22 20 90,9 Giới tính Nam 15 12 80
Nữ 10 9 90
Dạng ung thƣ
Biểu mô tuyến 15 12 80 Xâm lấn thanh mạc 6 6 100 Cả hai dạng trên 4 2 50 Phân loại TNM T1N0M0 3 3 100 T2N0-1M0 16 12 75 T3N0-1M0 6 6 100 Vị trí ung thƣ Đại tràng 9 8 89,9 Trực tràng 15 12 80 Đại trực tràng 1 1 100 Số Hạch ≤ 3 12 8 66,67 >3 13 13 100 Vị trí hạch Cạnh trực tràng 12 10 88,3 Cạnh đại tràng 8 7 87,5 Khác 5 4 80 Kích thƣớc hạch ≤ 1 cm 19 15 78,9 > 1 cm 6 6 100 Ổ sùi loét Có 14 10 71,4 Không 11 11 100
Nhƣ vậy, tỷ lệ bệnh nhân bị methyl hóa của nhóm trên 70 tuổi (66,7%) thấp hơn so với nhóm dƣới 70 (90,9%), nữ (90%) cao hơn so với nam (80%), Tỷ lệ methyl hóa của nhóm bệnh nhân đại trực tràng cao nhất (100%) sau đó đến nhóm đại tràng (89,9%) và trực tràng (80%). Những bệnh nhân có nhiều hơn 3 hạch (100%) có tỷ lệ methyl hóa cao hơn những bệnh nhân ít hơn 3 hạch (67,67%). Tỷ lệ methyl hóa của nhóm với kích thƣớc hạch lớn hơn 1cm (100%) cao hơn so với nhóm có kích thƣớc nhỏ hơn 1cm, nhóm có ổ sùi loét (71,4%) thấp hơn so với dạng không có ổ sùi loét (100%). Đối với giai đoạn TNM thì tỷ lệ methyl hóa theo thứ tự sau: T1N0M0(100%), T3N0-1M0 là (100%), T2N0-1M0 là (75%) và sự khác nhau về tỷ lệ methyl hóa giữa các giai đoạn bệnh là không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.
Từ các dữ liệu trên, có thể thấy đối với các trƣờng hợp thuộc dạng ung thƣ xâm lấn thanh mạc và có nhiều hơn 3 hạch thì cho tỷ lệ methyl hóa cao (100%) Điều đó cho thấy sự methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 xảy ra chủ yếu vào giai đoạn sau của quá trình phát triển ung thƣ đại trực tràng, hay giai đoạn ung thƣ đã liên quan tới quá trình di căn.
Tuy nhiên, khi phân tích thống kê chúng tôi lại thấy sự khác biệt về tỷ lệ methyl giữa các nhóm: tuổi, giới tính, dạng ung thƣ, vị trí ung thƣ, số hạch, vị trí hạch, kích thƣớc hạch, ổ sùi loét là không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
So sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với kết quả nghiên cƣ́u của mô ̣t số công trình đã công bố nhƣ công bố của Wendt và cs, 2006 [22] khi nghiên cứu tình trạng methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 cho thấy 62% trong số 21 mẫu mô ung thƣ biểu mô trực tràng bị methyl hóa. Đến năm 2008, khi nghiên cứu tình trạng này trên 15 mẫu mô ung thƣ biểu mô vú, nhóm nghiên cứu này đã công bố tỷ lệ methyl hóa là 40%. Tiến hành nghiên cứu tình trạng methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 trên bệnh nhân ung thƣ vú, Zhou và cs, 2008 đã đƣa ra kết quả là 52,4% trong số 63 mẫu mô ung thƣ vú là bị methyl hóa. Các công trình nghiên cứu trên đều ủng hộ vai trò của sự tăng cƣờng methyl hóa vùng promoter của gen
CXCL12 trong việc làm giảm biểu hiện của gen này ở các mẫu mô ung thƣ và có thể đây là yếu tố góp phần vào quá trình di căn ung thƣ [24].
Quá trình di căn ung thƣ là một quá trình phức tạp đòi hỏi rất nhiều bƣớc khác nhau bao gồm sự xâm nhập vào mạch máu từ các khối u nguyên phát, sự chống lại quá trình apoptosis, sự di chuyển tới các cơ quan thứ hai và sự tăng sinh của các tế bào ung thƣ tại mô đích. Một số dữ liệu cho thấy phức hệ CXCL12/CXCR4 đã tham gia vào hầu hết các con đƣờng của quá trình di căn và CXCR4 đƣợc điều hòa bởi rất nhiều các yếu tố hóa sinh hay di truyền ở nhiều mức độ khác nhau liên quan tới quá trình phiên mã, dịch mã. Trong sự di căn theo đƣờng máu thì các yếu tố cơ học sẽ quyết định số phận của các tế bào ung thƣ sau khi rời khỏi vị trí ung thƣ nguyên phát và cơ quan đích sẽ chịu sự điều khiển của các tế bào di cƣ tới đây đầu tiên. Nhƣ đối với trục tín hiệu CXCL12/CXCR4 thì không chỉ biểu hiện của CXCR4 đóng vai trò chủ chốt điều khiển quá trình di căn khối u mà còn có cả CXCL12 cũng đóng vai trò thiết yếu đối với quá trình di căn đặc hiệu theo vị trí. Biểu hiện của CXCR4 vẫn đƣợc duy trì trong các khối u nguyên phát, trái lại, một số nghiên cứu lại cho thấy biểu hiện CXCL12 là khá hạn chế trong nhiều trƣờng hợp ung thƣ biểu mô, điều này có thể liên quan tới sự methyl hóa vùng promoter của CXCL12 từ đó dẫn tới ức chế quá trình phiên mã của gen này. Phục hồi biểu hiện CXCL12 và thử nghiệm trên chuột SCID thì thấy rằng sự tái biểu hiện nội sinh của CXCL12 ở các tế bào ung thƣ biểu mô trực tràng đã làm giảm sự hình thành khối u di căn trong cơ thể chuột, điều này phù hợp với vai trò của CXCL12 trong việc hàn gắn các tổn thƣơng, khiến cho các tế bào ung thƣ tập trung thành tụ điểm và khó xâm lấn hơn. Nhƣ vậy, có thể giả thiết là chính sự im lặng của gen
CXCL12 trong các tế bào ung thƣ đã làm biến đổi trục tín hiệu CXCL12/CXCR4 dẫn tới quá trình di căn xảy ra. Các tế bào di căn thiếu đi biểu hiện của CXCL12 nhƣng vẫn duy trì biểu hiện của CXCR4 sẽ tuân theo gradient tín hiệu hƣớng hóa CXCL12, xâm nhập vào mạch máu, tồn tại và xâm lấn ra các mô cơ quan khác, nơi có nguồn CXCL12 ngoại sinh để đáp ứng lại trục tín hiệu này [22].
Nhiều bằng chứng gần đây đã xác định vai trò của sự tăng cƣờng methyl hóa ADN có liên quan tới sự im lặng gen CXCL12 ở các tế bào ung thƣ đại trực tràng [22]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào việc tìm ra mối liên hệ giữa tình trạng methyl hóa của gen CXCL12 với các đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Tỷ lệ methyl hóa đƣợc phát hiện thấy là khá cao, chiếm 84% trong số 25 mẫu ung thƣ đại trực tràng. Quan trọng hơn là tình trạng methyl hóa xảy ra ở phần lớn các bệnh nhân ung thƣ đại tràng (66,7%) thuộc nhóm tuổi trên 70, 90,9% với nhóm <70 tuổi, (100%) với các trƣờng hợp có nhiều hơn 3 hạch. Do đó, đây có thể là những dữ liệu bệnh học có ý nghĩa có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc tìm ra chỉ thị sinh học đặc hiệu cho căn bệnh này.
Nhƣ vậy qua quá trình nghiên cứu đa hình và sự methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 chúng tôi thấy rằng:
Khi nghiên cứu đa hình gen CXCL12 trên nhóm bệnh nhân và nhóm đối chứng thấy có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về kiểu gen. Vậy có thể suy luận rằng đã có sự thay đổi gen CXCL12 ở một mức độ nào đó dẫn đến ung thƣ đại trực tràng.
Khi nghiên cứu quá trình methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 giữa 2 loại mô là mô u và lân cận u trên cùng một bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng, đặc biệt trong những bệnh nhân ung thƣ đã bị di căn thì sự khác biệt này càng rõ rệt. Điều này chứng tỏ rằng sự methyl vùng promoter của gen CXCL12 có thể là một nguyên nhân quan trọng trong quá trình di căn ung thƣ đại trực tràng.
KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu đƣợc chúng tôi rút ra đƣợc những kết luận sau: 1. Sử dụng kĩ thuật PCR-RFLP, đã xác định đƣợc tính đa hình của gen CXCL12: - Về kiểu gen: mẫu đối chứng có 72,73% dạng G/G, 25% dạng G/A, 2,27% dạng A/A; mẫu bệnh có 42,86% dạng G/G, 52,39% dạng G/A, 4,76% dạng A/A.
- Về tần xuất alen: mẫu đối chứng có 85,22% dạng G, 14,78% dạng A, mẫu bệnh có 69,05% dạng G, 30,95% dạng A.
Sự phân bố kiểu gen và tần xuất alen giữa nhóm đối chứng và nhóm bệnh khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Sự phân bố kiểu gen và tần xuất alen CXCL12
không phụ thuộc vào tuổi, vào vị trí ung thƣ, vào giới tính giữa nam và nữ, giữa ung thƣ trực tràng và đại tràng (p>0,05).
2. Đã xác đi ̣nh đƣợc 5 đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã của gen
CXCL12 và vùng promoter dƣ̣ đoán có vị trí tƣơng ƣ́ng nằm trong đảo CpG số 4, đã nhân lên đƣợc đoạn ADN tƣơng ứng với vùng promoter đã dự đoán.
3. Bằng phƣơng pháp MSP đã xác đi ̣nh đƣợc tỷ lê ̣ methyl hóa vùn g promoter của gen CXCL12 ở bê ̣nh nhân ung thƣ đa ̣i trƣ̣c tràng là 80% ở mô u, và 37,5% ở mô lân cận u. Sự sai khác về tỷ lệ methyl hóa ở 2 nhóm mẫu này có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Tình trạng methyl hóa của gen CXCL12 không phụ thuộc vào các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhƣ tuổi, giới tính, vị trí ung thƣ và các giai đoạn bệnh theo TNM (p> 0,05).
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục phân tích đa hình gen CXCL12 và sự methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 trên bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng với số lƣợng mẫu lớn hơn.
2. Sử dụng thêm phƣơng pháp định lƣợng chemokine để thấy rõ đƣợc mối liên hệ giữa hàm lƣợng chemokine với sự methyl hóa vùng promoter, và đa hình gen CXCL12. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Nhƣ Hiền (2005), Di truyền ung thư, NXB ĐH Quốc gia Hà Nội,
Hà Nội, tr.12.
2. Phạm Thu Huyền, Trịnh Hồng Thái (2011), “Phân tích tình trạng Methyl hóa Promoter của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng”, Tạp
chí y học Việt Nam tập 384(2), tr. 72-77.
3. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở di truyền học phân tử và tế
bào, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
4. Nguyễn Thị Hồng Vân, Trần Thị Thùy Anh, Lƣơng Tuấn Nghĩa, Lê Văn Quảng, Hà Hoài Nam (2011) “ Ứng dụng kỹ thuật PCR- SSCP để phát