1 .4.CHEMOKINE CXCL2 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƢ ĐẠI TRỰC
2.2.5.Khuếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP
2.2.5.1. Xử lý bisulfite ADN bằng kit DNA Methylation-Gold TM kit và xử lý bisulfite ADN theo phương pháp của Herman và cs (1996) [9]
Mục đích của việc xử lý này là nhằm biến đổi toàn bộ cytosine không bị methyl hóa trong trình tự ADN của mẫu thành uracil, còn những cytosine nào bị methyl hóa thì không bị thay đổi.
Quy trình xử lý bisulfite ADN theo phƣơng pháp của Herman và cộng sự bao gồm các bƣớc:
1-2µg ADN đƣợc biến tính trong 0,3M NaOH ở 42oC, 20 phút trong thể tích phản ứng là 50µl.
Thành phần Thể tích
H2O loại ion, vô trùng 17 µl 10X FastDigest® buffer 2 µl Sản phẩm PCR (~0.2 µg) 10 µl
Bổ sung hydroquinone và sodium bisulfite vào dung dịch trên sao cho tổng thể tích cuối cùng là 600µl trong đó nồng độ cuối cùng của hydroquinone là 0,5mM và sodium bisulfite là 3,1M; pH 5,0). Đảo nhẹ tay.
Thêm 50µl dầu khoáng để tránh bay hơi. Ủ hỗn hợp ở 55oC trong vòng 16 giờ.
Sau khi xử lý thì hỗn hợp trên sẽ đƣợc loại muối bằng kit tinh sạch ADN QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.
ADN tinh sạch sẽ đƣợc desulfo hóa trong NaOH 0,3M ở 42oC trong 20 phút, sau đó tủa ADN bằng isopropanol theo tỷ lệ thể tích 1:1 trong 3-4 h ở -20oC và cuối cùng đƣợc hòa tan lại bằng 20µl nƣớc sạch.
Xử lý bisulfite ADN bằng kit ADN Methylation-Gold TM kit
Cùng với việc xử lý bisulfite ADN theo quy trình trên, chúng tôi còn chuẩn hóa việc xử lý này bằng kit ADN Methylation- Gold TM. Quá trình xử lý đƣợc thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất.[26]
2.2.5.2. Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại gen CXCL12
Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR là kỹ thuật dùng để khuếch đại một đoạn trình tự ADN nhờ sự thay đổi của chu trình nhiệt. Mỗi chu kỳ phản ứng gồm ba giai đoạn: giai đoạn biến tính ở nhiệt độ cao, gắn mồi và kéo dài.
Cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng là cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu cho phản ứng khuếch đại trình tự bị methyl hóa và không bị methyl hóa ADN, đƣợc tham khảo từ bài báo của Wendt và cs, (2006) [22] và đã đƣợc kiểm tra lại sử dụng phần mềm MethBLAST và MethPrimer.
Cặp mồi đƣợc thiết kế để nhân đoạn gen thuộc đảo CpG số 4 (theo MethPrimer) nằm trong vùng promoter của gen CXCL12 với trình tự nhƣ sau:
CXCL12-Methyl (kích thƣớc sản phẩm là 242 bp)
Mồi xuôi (M- f ) 5’- GGA GTT TGA GAA GGT TAA AGG TC - 3’ Mồi ngƣợc (M - r) 5’- TTA ACG AAA AAT AAA AAT AGA CGA T - 3’ CXCL12-Unmethyl (kích thƣớc sản phẩm là 241 bp)
Mồi xuôi (U-f) 5’ - GAG TTT GAG AAG GTT AAA GGT TGG - 3’ Mồi ngƣợc (U- r) 5’ - TAA CAA AAA ATA AA ATA CAA CAA T - 3’ Mồi PCR đƣợc thiết kế sao cho tất cả những cytosine không bị methyl hóa trong ADN khuôn sau khi xử lý bisulfite sẽ chuyển thành uracil và những cytosine này sẽ đƣợc chuyển thành timine trong thiết kế mồi [25]. Thành phần phản ứng PCR nhƣ sau (bảng 5): Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR (với thể tích 12,5 µl) Thành phần Thể tích Nồng độ cuối cùng H2O 3,125 µl dNTPs 0,25 µl 200 µM Buffer 10X (có chứa MgCl2 15mM) 1,25 µl 1X Q-solution 2,5 µl 1X
Mồi* 0,625 µl 0,5 µM/ mỗi loại
HotStarTaq ADN Polymerase 0,125 µl 0,625 Unit ADN khuôn (đã xử lý bisulfite) 4 µl 50-100 ng
(*) Cặp mồi U-f và U-r để nhân đoạn trình tự không bị methyl hóa, cặp mồi M-f và M-r để nhân đoạn trình tự bị methyl hóa.
Chu trình nhiệt nhƣ sau: