1 .4.CHEMOKINE CXCL2 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƢ ĐẠI TRỰC
3.1.3.Kết quả phân tích RFLP
Để phát hiện đƣợc tính đa hình trong đoạn gen CXCL12 sau khi khuếch đại đoạn gen này bằng phƣơng pháp PCR, chúng tôi tiến hành ủ sản phẩm PCR với enzyme MspI. Sau khi ủ 10 phút ở 37oC, sản phẩm cắt đƣợc kiểm tra trên gel polyacrylamide 10%. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 5.
Hình 5. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng 302bp, 202bp và 100bp
(Điện di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)
Giếng M: thang chuẩn ADN 100bp
Giếng 1, 3, 5: sản phẩm PCR trƣớc khi cắt bằng enzyme MspI.
Giếng 2, 4, 6: sản phẩm sau khi cắt bằng enzyme MspI của các giếng 1, 3, 5.
Trên bản gel ta thấy xuất hiện những băng có kích thƣớc khác nhau, có những mẫu sản phẩm PCR sau cắt chỉ cho 1 băng 302bp, có những mẫu cho 2 băng 202bp và 100bp lại có những mẫu sản phẩm bị cắt thành 3 băng 302bp, 202bp, 100bp. Điều này chứng tỏ đã có sự đa hình nucleotide trong đoạn gen này. Ta thấy
sản phẩm cắt xuất hiện các băng có kích thƣớc 302 bp, 202 bp và 100 bp, chứng tỏ đoạn gen 302 bp chỉ có một trình tự nhận biết duy nhất của enzyme MspI và vị trí cắt chính là vị trí xảy ra đa hình nucleotide.
Nhƣ vậy, có ba kiểu đa hình khác nhau nhƣ thể hiện trên bản gel. Đó là đa hình kiểu dại, trên gel điện di chỉ xuất hiện hai băng (giếng 4), đột biến hoặc biến đổi dị hợp tử (xuất hiện 3 băng nhƣ ở giếng 6) và đột biến hoặc biến đổi đồng hợp tử (chỉ có một băng điện di ở giếng 2).
Tiến hành lặp lại các thí nghiệm, chúng tôi thu đƣợc hình ảnh của các kiểu đa hình riêng biệt nhƣ sau:
Genotype kiểu dại, trên gel điện di chỉ xuất hiện hai băng (hình 6):
Hình 6. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 2 băng 202bp và 100 bp (Điện di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)
Giếng M: thang chuẩn ADN 100bp
Giếng 1, 3, 5: sản phẩm PCR trƣớc cắt bằng enzyme MspI Giếng 2, 4, 6 sản phẩm PCR cắt bằng enzyme MspI
Trên hình thấy xuất hiện hai loại băng có kích thƣớc 202bp và 100bp, những mẫu này không bị đột biến hoặc biến đổi tại vị trí enzyme nhận biết. Do đó, enzyme dễ dàng nhận ra trình tự nhận biết CCGG và cắt ở cả hai alen của gen nên trên ảnh điện di chỉ nhìn thấy hai băng có kích thƣớc 202bp và 100 bp. Đây là kiểu genotype
phổ biến ở ngƣời bình thƣờng, còn gọi là kiểu dại, và đƣợc kí hiệu là (G/G). Tuy nhiên, genotype này cũng xuất hiện ở một số ngƣời bệnh ung thƣ đại trực tràng.
Genotype dị hợp tử (hình 7)
Trên bản gel điện di xuất hiện 3 băng có kích thƣớc lần lƣợt là 302 bp, 202 bp và 100 bp nhƣ ở hình 7.
Hình 7. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng 302bp, 202bp và 100bp (genotype dị hợp tử)
(điện di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)
Giếng M: thang chuẩn ADN 100bp
Giếng 1, 3, 5: sản phẩm PCR trƣớc khi cắt bằng enzyme MspI Giếng 2, 4, 6 sản phẩm PCR cắt bằng enzyme MspI
Ở kiểu gen này, trình tự nhận biết CCGG đã bị thay đổi trên 1 alen của gen. Trên alen này, trình tự CCGG đã bị thay thế làm cho emzyme MspI không nhận biết đƣợc ví trí cắt. Do đó, alen này không bị cắt thành hai mảnh có kích thƣớc 202bp và 100bp. Ở alen còn lại, trình tự nhận biết của enzyme không bị thay đổi nên đoạn gen CXCL12 vẫn bị cắt thành hai đoạn có kích thƣớc 202bp và 100bp. Do đó, khi điện di trên gel polyacylamide thấy xuất hiện 3 băng ADN có kích thƣớc lần lƣợt là
302bp, 202bp và 100bp. Những mẫu có kiểu gen nhƣ trên là dạng đột biến/ biến đổi dị hợp tử, kí hiệu G/A.
Genotype đồng hợp tử
Genotype còn lại chỉ có 1 băng ADN duy nhất, có kích thƣớc 302 bp, bằng kích thƣớc của sản phẩm PCR đoạn gen CXCL12-3’- UTR (hình 8).
Hình 8. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 1 băng 302bp (điện di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)
Giếng M: thang chuẩn ADN 100bp;
Giếng 1 sản phẩm PCR trƣớc cắt bằng enzyme MspI Giếng 2 sản phẩm PCR cắt bằng enzyme MspI
Trên hình ảnh điện di, ta thấy chỉ xuất hiện một băng có kích thƣớc 302bp chứng tỏ sản phẩm PCR không bị cắt bởi enzyme MspI. Mẫu này bị đột biến hoặc biến đổi trên cả hai alen của cặp nhiễm sắc thể tƣơng đồng tại vị trí cắt của enzyme (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
MspI. Khi đó, trình tự CCGG trên cả 2 alen đều bị thay thế. Do đó, emzyme MspI không thể nhận biết đƣợc trình tự nhận biết để cắt ADN. Kiểu gen này là kiểu đột biến/biến đổi đồng hợp tử, kí hiệu A/A.
3.1.4. Phân tích số liệu bằng phƣơng pháp thống kê
Qua kết quả thu đƣợc trong quá trình phân tích PCR-RFLP, chúng tôi tiến hành phân tích kết quả đó bằng phép kiểm định thống kê. Trong quá trình thực hiện đề tài, chứng tôi đã tiến hành phân tích PCR-RFLP đối với 86 mẫu, trong đó có 42 mẫu bệnh và 44 mẫu thƣờng làm đối chứng.
Phân bố genotype giữa mẫu bệnh và mẫu đối chứng:
Phân bố genotype giữa mẫu bệnh và mẫu đối chứng đƣợc xác định theo vị trí khối u, theo giới tính và độ tuổi của ngƣời bệnh. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 7, 8 và 9.
Bảng 7. Phân bố genotype giữa mẫu bệnh và mẫu đối chứng theo vị trí khối u
Genotype
Mẫu đối
chứng Mẫu bệnh Vị trí khối u của ngƣời bệnh
(n = 44) (n= 42) Trực tràng Đại tràng Đại trực tràng (n= 24) (n= 11) (n=7) G/G 72,73% 42,85% 37,5% 45,45% 57,14% (32) (18) (9 ) (5) (4) G/A 25% 52,39% 58,33% 45,45% 42,86% (11) (22) (14) (5) (3) A/A 2,27% 4,76% 4,17% 9,09% 0% (1) (2) (1) (1) (0)
Kết quả ở bảng 7 đã cho thấy:
Phân bố genotype giữa mẫu đối chứng và mẫu bệnh khác nhau có ý nghĩa thống kê với p<0,05.
So sánh phân bố genotype giữa mẫu đối chứng và mẫu bệnh theo vị trí khối u cho kết quả nhƣ sau:
+ Phân bố genotype giữa mẫu đối chứng và mẫu ung thƣ trực tràng khác nhau có ý nghĩa thống kê với p<0,05.
+ Phân bố genotype giữa mẫu đối chứng và mẫu ung thƣ đại tràng khác nhau không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.
+ Phân bố genotype giữa mẫu đối chứng và mẫu ung thƣ đại trực tràng khác nhau không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.
+ So sánh phân bố genotype của bệnh nhân ung thƣ đại tràng và ung thƣ trực tràng thấy khác nhau không mang ý nghĩa thống kê với p>0,05.
+ So sánh phân bố genotype của bệnh nhân ung thƣ trực tràng và ung thƣ đại trực tràng thấy khác nhau không mang ý nghĩa thống kê với p>0,05.
+So sánh phân bố genotype của bệnh nhân ung thƣ đại tràng và ung thƣ đại trực tràng thấy khác nhau không mang ý nghĩa thống kê với p>0,05.
Bảng 8. Phân bố genotype theo giới tính của bệnh nhân
Genotype Mẫu bệnh Nam (n=23) Nữ (n=19) Tổng (n = 42) G/G 30,43% (7) 63,16% (12) 42,85% (18) G/A 69,57% (16) 26,32% (5) 52,38% (22) A/A 0% (0) 10,52% (2) 4,77% (2)
Tìm hiểu mối liên hệ giữa ung thƣ đại trực tràng và giới tính, chúng tôi đã tính tỷ lệ genotype theo giới tính. Kết quả ở bảng 8 đã cho thấy, bằng phép kiểm định khi bình phƣơng thấy có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê trong phân bố genotype theo giới tính (nam - nữ) của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng (p<0,05).
Nhƣ chúng ta đã biết, càng lớn tuổi thì nguy cơ mắc ung thƣ đại trực tràng càng cao. Do đó, chúng tôi tiến hành kiểm tra mối liên quan giữa độ tuổi và tính đa hình trong gen CXCL12 ở ngƣời bệnh. Trong tổng số 42 mẫu bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng, chúng tôi chia làm hai nhóm tuổi khác nhau là: nhóm trên 70 tuổi (7mẫu) và nhóm dƣới 70 tuổi (35mẫu) (bảng 9).
Bảng 9. So sánh phân bố genotype giữa nhóm ngƣời bệnh trên 70 tuổi và dƣới 70 tuổi Genotype ≥ 70 tuổi (n= 7) < 70 tuổi (n= 35)
G/G 28,57 % (2) 48,57% (17) G/A 57,14 % (4) 48,57% (17) A/A 14,29% (1) 2,86% (1)
Kiểm định thống kê cho thấy sai khác trong phân bố genotype của nhóm ngƣời bệnh trên 70 tuổi và dƣới 70 tuổi không có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa α = 0,05 (p<0,05).
So sánh tần xuất alen ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng và đối chứng
Tần xuất alen đã đƣợc tính toán theo vị trí khối u, giới tính và độ tuổi của ngƣời bệnh. Kết quả đƣợc trình bày ở các bảng 10, 11 và 12.
Bảng 10. Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu đối chứng và mẫu bệnh theo vị trí khối u Alen Mẫu đối chứng (n = 88) Mẫu bệnh Tổng số (n = 84) Trực tràng (n = 48) Đại tràng (n = 22) Đại trực tràng (n = 14) G 85,22% (75) 69,05% (58) 66,67% (32) 68,18% (15) 78,57% (11) A 14,78 % (13) 30,95% (26) 33,33% (16) 31,82% (7) 21,43% (3)
Kết quả ở bảng 10 đã cho thấy, tần xuất alen khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức p<0,05 giữa bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng và đối chứng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tần xuất alen giữa mẫu ung thƣ đại trực tràng và mẫu đối chứng, sai khác không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.
- Tần xuất alen giữa mẫu ung thƣ trực tràng và mẫu đại tràng, sai khác không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.
- Tần xuất alen giữa mẫu ung thƣ trực tràng và mẫu đại trực tràng, sai khác không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.
Tính toán tần xuất alen của gen CXCL12 của ngƣời bệnh theo giới tính đƣợc trình bày ở bảng 11.
Bảng 11. Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo giới tính Alen Mẫu bệnh Nam (n = 46) Nữ (n = 38) Tổng số (n = 84) G 65,21 % (30) 76,32% (29) 70,23% (59) A 34,79% (16) 23,68 % (9) 29,77% (25)
Kết quả ở bảng 11 đã cho thấy, tần xuất alen giữa mẫu ung thƣ đại trực tràng ở nam và nữ sai khác không mang ý nghĩa thống kê với p>0,05.
Tính toán tần xuất alen của gen CXCL12 của ngƣời bệnh theo độ tuổi đƣợc trình bày ở bảng 12.
Bảng 12. Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo độ tuổi Alen ≥ 70 tuổi (n = 14) < 70 tuổi (n = 70)
G 57,14% (8) 72,85% (51) A 42,86% (6) 27,15% (19)
Kết quả ở bảng 12 đã cho thấy, tần xuất alen khác biệt không có ý nghĩa thống kê với mức p>0,05 giữa nhóm bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng trên 70 tuổi và dƣới 70 tuổi.
Nhƣ vậy, qua quá trình nghiên cứu và sử lý số liệu chúng tôi nhận thấy ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng và mẫu đối chứng có sai khác mang ý nghĩa thống kê về kiểu gen và tần suất alen, điều đó chứng tỏ đã có sự thay đổi đáng kể trong kiểu gen giữa bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng và mẫu đối chứng, và sự thay đổi này có thể ảnh hƣởng đến sự biểu hiện của CXCL12 trong ung thƣ đại trực tràng.
Khi so sánh kết quả của chúng tôi với môt số nghiên cứu khác trên thế giới nhƣ nghiên cứu của Dimberg và cs (2007) tiến hành trên các mẫu bệnh nhân ngƣời Thụy Điển, kết quả nghiên cứu này thấy không có sự khác biệt đáng kể trong phân bố genotype và tần xuất alen giữa bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng và mẫu đối chứng [8]. So sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với kết quả của nhóm nghiên cứu của Dimberg, đã có sự khác biệt đáng kể trong ảnh hƣởng của đa hình gen
CXCL12 đối với bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng ở Thụy Điển và ở Việt Nam. Một câu hỏi đƣợc đặt ra là tại sao lại có sự khác biệt đó, liệu sự khác biệt này có phải do bắt nguồn từ nguồn gốc phân tử của sự phát sinh ung thƣ và nguyên nhân dẫn đến sự phát sinh của hai nhóm bệnh nhân này.
Tƣơng tự một nghiên cứu khác của Hidalgo-Pascual và cs (2007) đã nghiên cứu đa hình gen CXCL12 trên mẫu bệnh nhân ngƣời Tây Ban Nha. Kết quả cho
thấy, không có khác biệt đáng kể trong phân bố genotype và tần xuất alen của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng so với đối chứng [10].
Chúng tôi tiếp tục tiến hành so sánh phân bố genotype giữa mẫu đối chứng và mẫu bệnh theo vị trí khối u cho kết quả nhƣ sau:
Phân bố genotype giữa mẫu đối chứng và mẫu ung thƣ trực tràng, ung thƣ đại tràng, đại trực tràng thấy khác nhau không có ý nghĩa thống kê.
Xét theo giới tính, kết quả cho thấy có sự khác biệt đáng kể trong phân bố genotype theo giới tính bệnh nhân (nam - nữ). Trong khi đó, lại không thấy sự khác biệt trong tần xuất alen giữa hai giới nam - nữ. Nhƣ vậy đã có sự thay đổi trong kiểu gen giữa 2 nhóm bệnh nam nữ.
Xét theo độ tuổi chúng tôi chia bệnh nhân thành 2 nhóm lớn hơn hoặc bằng 70 tuổi và nhỏ hơn 70 tuổi. Cơ sở của việc phân tuổi này là khi lớn hơn 70 tuổi thì ít nhất 50% ngƣời bình thƣờng mang u lành tính ở đại tràng hoặc trực tràng và khoảng 10 % trong số đó sẽ phát triển thành khối u ác tính, nhanh chóng phát triển thành ung thƣ [1]. Kết quả là phân bố genotype và tần xuất alen ở ngƣời bệnh trên 70 tuổi và dƣới 70 tuổi khác biệt không có ý nghĩa thống kê.