1 .4.CHEMOKINE CXCL2 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƢ ĐẠI TRỰC
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Sử dụng kit tách chiết ADN từ mô QIAamp ADN Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.
- Cắt 25mg mô cho vào trong ống 1,5ml, thêm 180µl đệm ATL.
- Thêm 20µl proteinase K, trộn bằng vortex, và ủ ở 56ºC cho đến khi mô đƣợc thủy phân hoàn toàn. Vortex thƣờng xuyên trong quá trình ủ.
- Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.
- Thêm 200µl đệm AL vào mẫu, trộn bằng vortex trong 15 giây, và ủ ở 70ºC trong 10 phút. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.
- Thêm 200µl ethanol (96 – 100%) vào mẫu, trộn bằng vortex trong 15 giây. Sau khi trộn, ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.
- Cho toàn bộ hỗn hợp vào cột QIAamp Spin Column. Đóng nắp, ly tâm ở 6000g (8000 vòng/phút) trong 1 phút. Đặt cột vào ống 2ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.
- Thêm 500µl đệm AW1. Đóng nắp, ly tâm ở 6000g (8000 vòng/phút) trong 1 phút. Đặt cột vào ống 2ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.
- Thêm 500µl đệm AW2. Đóng nắp, ly tâm ở tốc độ tối đa 20.000g (14.000 vòng/phút) trong 3 phút. Có thể lặp lại bƣớc này thêm 1 phút nếu chƣa hết dịch trên cột.
- Đặt cột vào ống 1,5ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch. Thêm 200µl đệm AE hoặc nƣớc sạch. Đặt ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 6000g (8000 vòng/phút) trong 1 phút. Lặp lại bƣớc trên 1 lần nữa.
- Kết quả thu đƣợc 400µl ADN
2.2.2. Tách chiết ADN tổng số từ máu
ADN tổng số đƣợc tách chiết từ máu theo phƣơng pháp của PitroChomczy và Nicoleta Sacchi [29] bằng cách dùng phenol: chloroform: isopropanol (25:24:1) bao gồm các bƣớc sau:
- Lấy 250µl máu cho vào ống Eppendorf 1,5 ml.
Bổ sung 250µl đệm phân giải (Tris-HCl 10mM, Succroz 0,32M, MgCl2
5mM, Triton X100 1%), trộn đều và để trong lạnh 10-15 phút.
- Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 6000 vòng/phút trong 7 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn.
- Lặp lại bƣớc 2 và 3 lần thứ 2 để loại bỏ hoàn toàn huyết sắc tố.
- Thêm 250µl đệm PBS 1x (NaCl 3mM, KCl 0,5mM, Na2HPO4 2mM, KH2PO4 0,35M), trộn đều, để trong lạnh 10-15 phút.
- Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 10000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn.
- Bổ sung 500µl đệm Lysis (SDS 2,1%, NaCl 0,1mM, EDTA 10mM, Tris- HCl 10mM, nƣớc cất), thêm Proteinase K (20mg/ml) theo tỷ lệ 1:100, trộn đều, ủ 2h ở 65oC trong bình ổn nhiệt.
- Thêm 500µl dung dịch phenol : chloroform : isopropanol (25:24:1), trộn đều.
- Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trong ở pha trên cùng.
- Thêm 500µl dung dịch chloroform : isopropanol (24:1), trộn đều.
- Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi. - Bổ sung 500µl ethanol 100% và NaCH3COO 3M (pH 5,2) vào dịch thu đƣợc (tỉ lệ dịch nổi/ NaCH3COO = 10:1) để tủa ADN. Giữ ở -20oC trong 3 giờ hoặc qua đêm.
- Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch nổi, thu tủa.
- Làm khô tủa bằng máy Speed vac trong 10 phút hoặc để khô tự nhiên. - Hòa tan tủa trong 30µl đệm TE, bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
- Kiểm tra ADN tổng số bằng điện di trên gel agarose 0,8-1%.
2.2.3. Khuếch đại gen CXCL12 bằng phƣơng pháp PCR
Phản ứng PCR với tổng thể tích 25 µl bao gồm các thành phần đƣợc trộn theo thứ tự trong bảng 3. Bảng 3. Các thành phần của phản ứng PCR Thành phần Thể tích Nồng độ cuối cùng H2O 10,1 µl Buffer 10X 2,5 µl 1X MgCl2 2.5 µl 1,5 mM dNTPs 0,5 µl 200 µM Primer CXCL12f 2,5 µl 0,5 µM Primer CXCL12r 2,5 µl 0,5 µM Taq ADN polymerase 0,4 µl 1 unit
ADN khuôn 4 µl 50-100 ng
Trình tự cặp mồi đƣợc tham khảo theo tài liệu công bố của Dimberg va cs, (2007) [8].
Mồi xuôi: 5'- CAGTCAACCTGGGCAAAGCC -3' Mồi ngƣợc: 5'- AGCTTTGGTCCTGAGAGTCC -3'
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel Agarose 2%, nhuộm ethidium bromide, và đƣợc soi trên đèn UV có bƣớc sóng 245nm.
Sau phản ứng PCR, chúng tôi thu đƣợc đoạn ADN có độ dài 302 bp. Sản phẩm PCR đƣợc sử dụng để phân tích RFLP.
2.2.4. Phân tích RFLP
Trong phân tích này, enzyme giới hạn đƣợc sử dụng để cắt một đoạn ADN của hai hay nhiều mẫu phân tích thành các đọan có chiều dài khác nhau MspI (HpaII) không cắt các vị trí m4CCGG, m5CCGG, Cm4CGG và hm5 Chm5CGG, nhƣng lại cắt tại vị trí Cm5CGG. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng enzyme MspI để cắt sản phẩm PCR. Enzyme MspI là enzyme endonuclease nhận biết ADN tại trình tự: 3'...GGC/C...5'
Lọai enzyme đƣợc sử dụng là FastDigest® MspI của hãng Fermentas có tác dụng cắt nhanh chỉ trong 5 -10 phút ủ ở 37oC.
Tiến hành ủ enzyme:
Chuẩn bị sản phẩm PCR (đoạn ADN của gen CXCL12 đã đƣợc nhân lên qua phản ứng PCR).
Tiến hành trộn các thành phần theo tỉ lệ dƣới đây trong một ống nhỏ 200 µl ở nhiệt độ phòng (bảng 4).
Bảng 4. Các thành phần của phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme FastDigest MspI
Trộn đều và ly tâm nhẹ lắng xuống.
Ủ dung dịch đã trộn enzyme trong 10 phút ở 37oC để enzyme hoạt động cắt ADN.
Sau đó, tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm thu đƣợc sau khi ủ enzyme trên gel polyacylamide 10%.
2.2.5. Khuếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP
2.2.5.1. Xử lý bisulfite ADN bằng kit DNA Methylation-Gold TM kit và xử lý bisulfite ADN theo phương pháp của Herman và cs (1996) [9]
Mục đích của việc xử lý này là nhằm biến đổi toàn bộ cytosine không bị methyl hóa trong trình tự ADN của mẫu thành uracil, còn những cytosine nào bị methyl hóa thì không bị thay đổi.
Quy trình xử lý bisulfite ADN theo phƣơng pháp của Herman và cộng sự bao gồm các bƣớc:
1-2µg ADN đƣợc biến tính trong 0,3M NaOH ở 42oC, 20 phút trong thể tích phản ứng là 50µl.
Thành phần Thể tích
H2O loại ion, vô trùng 17 µl 10X FastDigest® buffer 2 µl Sản phẩm PCR (~0.2 µg) 10 µl
Bổ sung hydroquinone và sodium bisulfite vào dung dịch trên sao cho tổng thể tích cuối cùng là 600µl trong đó nồng độ cuối cùng của hydroquinone là 0,5mM và sodium bisulfite là 3,1M; pH 5,0). Đảo nhẹ tay.
Thêm 50µl dầu khoáng để tránh bay hơi. Ủ hỗn hợp ở 55oC trong vòng 16 giờ.
Sau khi xử lý thì hỗn hợp trên sẽ đƣợc loại muối bằng kit tinh sạch ADN QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.
ADN tinh sạch sẽ đƣợc desulfo hóa trong NaOH 0,3M ở 42oC trong 20 phút, sau đó tủa ADN bằng isopropanol theo tỷ lệ thể tích 1:1 trong 3-4 h ở -20oC và cuối cùng đƣợc hòa tan lại bằng 20µl nƣớc sạch.
Xử lý bisulfite ADN bằng kit ADN Methylation-Gold TM kit
Cùng với việc xử lý bisulfite ADN theo quy trình trên, chúng tôi còn chuẩn hóa việc xử lý này bằng kit ADN Methylation- Gold TM. Quá trình xử lý đƣợc thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất.[26]
2.2.5.2. Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại gen CXCL12
Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR là kỹ thuật dùng để khuếch đại một đoạn trình tự ADN nhờ sự thay đổi của chu trình nhiệt. Mỗi chu kỳ phản ứng gồm ba giai đoạn: giai đoạn biến tính ở nhiệt độ cao, gắn mồi và kéo dài.
Cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng là cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu cho phản ứng khuếch đại trình tự bị methyl hóa và không bị methyl hóa ADN, đƣợc tham khảo từ bài báo của Wendt và cs, (2006) [22] và đã đƣợc kiểm tra lại sử dụng phần mềm MethBLAST và MethPrimer.
Cặp mồi đƣợc thiết kế để nhân đoạn gen thuộc đảo CpG số 4 (theo MethPrimer) nằm trong vùng promoter của gen CXCL12 với trình tự nhƣ sau:
CXCL12-Methyl (kích thƣớc sản phẩm là 242 bp)
Mồi xuôi (M- f ) 5’- GGA GTT TGA GAA GGT TAA AGG TC - 3’ Mồi ngƣợc (M - r) 5’- TTA ACG AAA AAT AAA AAT AGA CGA T - 3’ CXCL12-Unmethyl (kích thƣớc sản phẩm là 241 bp)
Mồi xuôi (U-f) 5’ - GAG TTT GAG AAG GTT AAA GGT TGG - 3’ Mồi ngƣợc (U- r) 5’ - TAA CAA AAA ATA AA ATA CAA CAA T - 3’ Mồi PCR đƣợc thiết kế sao cho tất cả những cytosine không bị methyl hóa trong ADN khuôn sau khi xử lý bisulfite sẽ chuyển thành uracil và những cytosine này sẽ đƣợc chuyển thành timine trong thiết kế mồi [25]. Thành phần phản ứng PCR nhƣ sau (bảng 5): Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR (với thể tích 12,5 µl) Thành phần Thể tích Nồng độ cuối cùng H2O 3,125 µl dNTPs 0,25 µl 200 µM Buffer 10X (có chứa MgCl2 15mM) 1,25 µl 1X Q-solution 2,5 µl 1X
Mồi* 0,625 µl 0,5 µM/ mỗi loại
HotStarTaq ADN Polymerase 0,125 µl 0,625 Unit ADN khuôn (đã xử lý bisulfite) 4 µl 50-100 ng
(*) Cặp mồi U-f và U-r để nhân đoạn trình tự không bị methyl hóa, cặp mồi M-f và M-r để nhân đoạn trình tự bị methyl hóa.
Chu trình nhiệt nhƣ sau:
2.2.6. Điện di kiểm tra sản phẩm
Do tính chất tích điện âm của các phân tử acid nucleic nên dƣới tác dụng của dòng điện một chiều, các phân tử này sẽ chuyển động từ cực âm sang cực dƣơng. Tốc độ di chuyển của các phân tử này phụ thuộc chủ yếu vào kích thƣớc phân tử acid nucleic, nhờ đó mà những đoạn ADN khác nhau có khả năng phân biệt với nhau trên gel điện di. Gel điện di thƣờng sử dụng là agarose và polyacrylamide. Tùy vào kích thƣớc đoạn ADN muốn phân tách ngƣời ta sẽ sử dụng chúng ở những nồng độ khác nhau. Trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi đã sử dụng 2 phƣơng pháp:
Điện di trên gel agarose 2%
Chuẩn bị gel agarose 2%: 2 gam agarose dạng bột (Invitrogen) đƣợc hòa tan trong 100ml đệm TBE 1X pH 8,3 (tris–base 0,09M, acid boric 0,09M, EDTA 4mM) đun bằng lò vi sóng cho đến khi agarose tan hết.
Đổ agarose vào khuôn điện di, chờ 15–20 phút cho gel đông lại.
Sản phẩm PCR đƣợc trộn với loading dye (glycerol 30% v/v, bromphenol blue dạng vết) và tra lên giếng điện di.
Bản gel sau điện di đƣợc nhuộm ethidium bromide trong 20 phút sẽ đƣợc quan sát dƣới đèn cực tím ở bƣớc sóng 245 nm.
Sau khi phân tích kết quả điện di trên gel agarose 2% có thể lựa chọn những mẫu nghi ngờ, khó xác định để điện di trên gel polyacrylamide 10% cho kết quả phân tích chính xác hơn. Bản gel đƣợc chuẩn bị với thành phần nhƣ sau (bảng 6):
Bảng 6. Thành phần bản gel polyacrylamide 10% (bản 7cm) Thành phần Thể tích Monoacrylamide 30% 1,65 ml TBE 3,31 ml APS 37,5 µl TEMED 3 µl
Tiến hành điện di ở 175V trong 1 giờ sau đó nhuộm bạc để phân tích kết quả.
2.2.7. Kỹ thuật nhuộm bạc
Bản gel sau điện di trên gel polyacrylamide sẽ đƣợc nhuộm bạc theo phƣơng pháp của Bassam (1991) [5] gồm các bƣớc sau:
- Cố định bản gel bằng dung dịch acid acetic 7,5% trong 30 phút. - Rửa bằng nƣớc cất ba lần, mỗi lần cách nhau 5 phút.
- Nhuộm bằng dung dịch bạc nitrat trong 30 – 40 phút, tránh ánh sáng. - Rửa nƣớc khoảng 30 giây – 1 phút.
- Hiện băng bằng dung dịch (30g/l Na2CO3, 0,056% formaldehyde, 400µg/l natri thiosulfate) trong 3 – 5 phút.
- Dừng phản ứng bằng dung dịch acid acetic 7,5% trong 3 – 5 phút. - Bảo quản gel bằng nƣớc cất.
2.2.8. Dự đoán vùng promoter và xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã của gen CXCL12 quanh vị trí khởi đầu phiên mã của gen CXCL12
Tra cơ sở dữ liệu NCBI để xác định trình tự của gen CXCL12, vị trí khởi đầu phiên mã, dịch mã từ đó chọn ra một đoạn trình tự xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã để tiến hành xác định phân bố của đảo CpG.
Sử dụng phần mềm MethPrimer [13] và cpgplot (EMBOSS) để xác định các đảo CpG với các tiêu chuẩn: Kích thƣớc mỗi đảo > 100 bp, tỷ lệ GC > 50% và tỷ số CpG giữa giá trị quan sát trên giá trị mong đợi > 0,6.
Sử dụng hai chƣơng trình dự đoán vùng promoter là FirstEF (Davuluri và cs, 2001) và Proscan (BIMAS) để dự đoán vùng promoter của gen CXCL12 [7].
- Chƣơng trình FirstEF với các tiêu chuẩn:
+ P(exon) > 0,5 (xác suất dƣ̣ đoán chính xác exon 1)
+ P(promoter) > 0,4 (xác suất dƣ̣ đoán chính xác promoter)
+ P(donor) > 0,4 (xác suất dƣ̣ đoán chính xác một trình tự khớp với vi ̣ trí giả thiết)
Dùng phần mềm MethBLAST (Li Lab, UCSF) để so sánh trình tự mồi với trình tự tƣơng đồng trong cơ sở dữ liệu từ đó xác định kích thƣớc của đoạn trình tự nhân lên.
Từ các dữ liệu trên, tiến hành xác định vị trí của đoạn trình tự khảo sát trong vùng promoter của gen CXCL12 và thuộc đảo CpG nào tìm đƣợc.
2.2.9. Phân tích số liệu bằng phƣơng pháp thống kê
Sử dụng phép kiểm định thống kê χ2 với mức ý nghĩa α = 0,05 để đánh giá mối liên quan giữa tính đa hình gen CXCL12 và tình trạng methyl hóa promoter của gen với các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng.
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PCR - RFLP
3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu
Bằng cách dùng phenol : chloroform : isopropanol theo tỷ lệ 25:24:1 chúng tôi đã tách chiết đƣợc ADN tổng số từ mẫu máu của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng và mẫu máu đối chứng của ngƣời bình thƣờng. Sản phẩm ADN tách chiết đƣợc hòa trong 30µl đệm TE, bảo quản ở -20oC, kiểm tra nhờ điện di trên gel agarose 0,8% và quan sát dƣới đèn cực tím ở bƣớc sóng 245nm (hình 3):
Hình 3. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ máu
(Điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm ethidium bromide)
Giếng 1, 2, 3, 4: Mẫu thƣờng Giếng 5, 6, 7, 8: Mẫu bệnh
Kết quả điện di cho thấy các băng ADN thu đƣợc sạch, khá sắc nét và ít bị đứt gẫy. Do đó, ADN tách chiết theo phƣơng pháp này đủ điều kiện để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen CXCL12 bằng PCR
Mẫu ADN sau khi đƣợc tách chiết đạt độ tinh sạch, không đứt gãy chúng tôi tiến hành nhân đoạn gen CXCL12 ở vị trí 3’- UTR bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi CXCL12.
Kết quả chúng tôi đã nhân đƣợc thành công đoạn gen CXCL12 dài 302 bp ở vị trí 3’ UTR với 42 mẫu bệnh và 44 mẫu đối chứng. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 2%, nhuộm ethidium bromide và soi trên đèn tử ngoại có bƣớc sóng 245nm, thu đƣợc hình ảnh trên hình 4.
Hình 4. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12 (Điện di trên gel agarose 2% và nhuộm ethidium bromide)
Giếng M: : thang chuẩn ADN 100bp; Giếng (-): Đối chứng âm. Giếng 1, 2, 3: Mẫu đối chứng; Giếng 4, 5, 6: Mẫu bệnh.
Từ hình ảnh điện di, ta thấy, sản phẩm PCR thu đƣợc có kích thƣớc 302 bp. Các băng sáng rõ nét, không xuất hiện các băng phụ, chứng tỏ, không xảy ra hiện tƣợng bắt cặp không đặc hiệu.
Giếng đối chứng âm không hiện băng chứng tỏ cặp mồi không bị nhiễm ADN lạ. Tất cả các dấu hiệu trên cho thấy đã thành công trong việc nhân đoạn gen
CXCL12-3’-UTR dài 302 bp.
3.1.3. Kết quả phân tích RFLP
Để phát hiện đƣợc tính đa hình trong đoạn gen CXCL12 sau khi khuếch đại đoạn gen này bằng phƣơng pháp PCR, chúng tôi tiến hành ủ sản phẩm PCR với enzyme MspI. Sau khi ủ 10 phút ở 37oC, sản phẩm cắt đƣợc kiểm tra trên gel polyacrylamide 10%. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 5.
Hình 5. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng 302bp, 202bp và 100bp
(Điện di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)
Giếng M: thang chuẩn ADN 100bp
Giếng 1, 3, 5: sản phẩm PCR trƣớc khi cắt bằng enzyme MspI.
Giếng 2, 4, 6: sản phẩm sau khi cắt bằng enzyme MspI của các giếng 1, 3, 5.
Trên bản gel ta thấy xuất hiện những băng có kích thƣớc khác nhau, có những mẫu sản phẩm PCR sau cắt chỉ cho 1 băng 302bp, có những mẫu cho 2 băng 202bp và 100bp lại có những mẫu sản phẩm bị cắt thành 3 băng 302bp, 202bp,