2.3.1. Đếm tế bào
Phương pháp lấy mẫu tảo
Đối với thí nghiệm được bố trí trong phòng, mẫu tảo được lấy 1 lần trong ngày vào lúc 8h sáng. Dùng que cấy đốt nóng bằng ngọn lửa đèn cồn để tiệt trùng, để nguội que cấy, dùng que cấy lấy 3 miếng vật bám trong bình thí nghiệm đưa vào
Hình 2.9: Thí nghiệm xác định hàm lượng silic phù hợp Tảo giống Navicula sp.
Xác định được hàm lượng Silic phù hợp
mỗi lọ mẫu, cùng lúc đó hút 6ml nước mẫu trong bình thí nghiệm. Dùng que cấy và kéo loại bỏ dây chỉ trên miếng bám nhằm hạn chế sai số. Sử dụng dung dịch lugol trung tính để cố định mẫu.
Cách pha dung dịch Neutral lugol’s:
20 gam Postasium (KI) + 10g I2 + 200ml nước cất.
* Phương pháp đếm
Việc xác định mật độ tảo được đếm bằng buồng đếm Thomas, buồng đếm có 9 ô lớn, mỗi ô lớn có 16 ô nhỏ riêng ô lớn ở giữa có 25 ô nhỏ. Mỗi ô lớn có diện tích 0, 0025 mm2. Độ sâu buồng đếm là 0,1 mm.
Lấy lamen phủ kín buồng đếm, lắc đều lọ mẫu và dùng pipet paster xịt đều mẫu trong lọ nhằm làm cho tế bào rời ra và phân bố đều. Dùng pipet hút mẫu đưa vào buồng đếm. Chú ý không để mẫu tràn lên mặt trên của lamen, mẫu phải được giọt đầy và tràn ra hai khe buồng đếm. Để mẫu lắng khoảng 2 phút rồi đưa vào xem dưới kính hiển vi ở vật kính 40. Mỗi mẫu được đếm 3 lần và lấy giá trị trung bình.
Hình 2.10: cách đếm tế bào trong buồng đếm
Hướng đếm tế bào trong buồng đếm vị trí. Tế bào đếm không đếm
1
4 5
3
- Đối với những loài tảo có mật độ quá dày đều chỉ đếm 5 ô lớn (1, 2, 3, 4, 5) được đánh dấu ở Hình 2.10
Mật độ tảo (tb/ml) = (số tế bào ở 5 ô) x 5 x 104. - Nếu mật độ tảo thưa thì đếm cả 25 ô lớn
Mật độ tảo (tb/ml)= (số tế bào đếm được) x 104.
* Phương pháp xác định tốc độ tăng trưởng ngày của vi tảo
0 1 0 1 C Ln µ t t LnC [7] Trong đó:
C1 mật độ tảo ở thời điểm t1
C0 mật độ tảo ở thời điểm t0
t1 ngày hôm sau t0 ngày hôm trước
µ tốc độ tăng trưởng theo ngày
2.3.2. Phương pháp xác định các yếu tố môi trường. * Độ mặn (ppt hoặc o/oo): * Độ mặn (ppt hoặc o/oo):
- Phương pháp pha độ mặn: Trong quá trình bố trí thí nghiệm để đạt được độ mặn mong muốn chúng tôi đã tiến hành thao tác pha độ mặn theo công thức sau:
V V1V2 (1) 2 2 1 1. . .N V N V N V (2) Từ (1) và (2) ta có: V1 = 2 1 2) ( N N N N V 1 2 V V V
V1, V2: thể tích nước biển, nước ngọt cần sử dụng để pha độ mặn. N1, N2: lần lượt là độ mặn của nước biển và nước ngọt.
Sau khi pha dung dịch dùng khúc xạ kế (Refractometer) có độ chính xác 1ppt để kiểm tra độ mặn trước khi bố trí thí nghiệm.
* Do cường độ ánh sáng (lux)
Dùng máy đo cường độ ánh sáng (Illuminance) hiệu Ana-F11 của Nhật.
* Xác định pH
Dùng bút đo pH có độ chính xác 0,1. Dùng dung dịch chuẩn để đưa pH của máy về 7,0. Đo trước khi bố trí thí nghiệm. Hằng ngày đo pH ở các lô thí nghiệm.
* Đo nhiệt độ (0C)
Sử dụng nhiệt kế rượu có độ chính xác 10C. Theo dõi nhiệt độ phòng thí nghiệm và đo nhiệt độ tảo nuôi sinh khối.
2.4 Xử lý số liệu
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập tảo Navicula sp. thuần chủng
Để có được tảo thuần, tiến hành phân lập bằng cách cấy san kết hợp thay đổi độ mặn (vì mỗi loài thủy sinh vật nói chung chỉ sống ở nơi có nồng độ muối thích hợp [17]. Theo Nguyễn Trọng Nho (1985), ở các đầm nước lợ, nhiều sinh vật bị chết vì nồng độ muối thay đổi đột ngột. Ngoài ra, độ mặn là yếu tố dễ khống chế hơn các yếu tố sinh thái khác).
* Sau khi lấy nước trực tiếp từ biển vào sô nhựa 100 lít và bón phân để tảo tự nhiên ngoài biển tự phát triển. Một tuần sau tiến hành thu mẫu ở đáy (vì Navicula sp. sống ở đáy) và bắt đầu tiến hành phân lập.
Dùng pipét lấy tảo từ thùng 100 lít ra sau đó cho vào 5 ống nghiệm khác nhau, ở các độ mặn khác nhau: 10 ppt, 15ppt, 20 ppt, 25ppt, 30ppt .
- Sau một tuần tảo phát triển, tiến hành quan sát và thu được kết quả sau:
Bảng 3.1: Mức độ thuần của tảo Navicula sp. ở các độ mặn khác nhau Đặc điểm của dịch tảo Ống nghiệm 10ppt Ống nghiệm 15ppt Ống nghiệm 20ppt Ống nghiệm 25ppt Ống nghiệm 30ppt Độ thuần 35% 44% 75% 82% 80%
Màu sắc Xanh, nâu đậm
Xanh, vàng nâu
Vàng nâu Vàng nâu Vàng nâu Qua số liệu được trình bày thấy được tảo Navicula sp.ở ống nghiệm có độ mặn 25ppt, 30ppt là thuần nhất, mức độ thuần của tảo đạt 80÷82%. Tiếp tục tiến hành lấy tảo ở ống nghiệm có độ mặn là 25ppt, 30ppt cấy trên thạch. Mỗi mẫu cấy trên 3 ống nghiệm thạch đông khác nhau (tảo lấy ra ở độ mặn 25ppt, 30 ppt cấy ra 6 ống nghiệm có thạch đông). 10÷15 ngày sau trên các mẫu cấy đã xuất hiện khuẩn lạc. Các khuẩn lạc lúc này có hình dạng và màu sắc khác nhau: màu xanh lục và màu vàng nâu.
Bảng 3.2. Số lượng khuẩn lạc khi phân lập trên môi trường dinh dưỡng thạch đông TT3. Ống nghiệm 25ppt Ống nghiệm 30ppt Đặc điểm khuẩn lạc ống nghiệm thạch 1 ống nghiệm thạch 2 ống nghiệm thạch 3 ống nghiệm thạch 1 ống nghiệm thạch 2 ống nghiệm thạch 3 Số lượng, màu sắc khuẩn lạc 23 nâu 14 xanh 40 nâu 3 xanh 29 nâu 13 xanh 27 nâu 14 xanh 25 nâu 10 xanh 37 nâu 5 xanh
Dựa vào đặc điểm của tảo khuê là có màu vàng nâu, khuẩn lạc có hình dạng tròn nên đã loại được tảo có khuẩn lạc màu xanh lục[1]. Sau đó tiến hành quan sát mẫu trên kính hiển vi, lấy khuẩn lạc (loại tế bào có hình dạng và kích thước gần giống với Navicula sp.) cho vào nuôi trong 5 ống nghiệm khác nhau, với các độ mặn khác nhau: 10ppt, 15ppt, 20ppt, 25ppt, 30ppt (Môi trường dinh dưỡng: TT3, pH: 8,5, nhiệt độ 250C). Một tuần sau khi khuẩn lạc của tảo phát triển trong môi trường nuôi, tiếp tục quan sát dưới kính hiển vi các mẫu trong ống nghiệm. Kết quả cho thấy ống nghiệm có độ mặn 20ppt, độ mặn 25ppt các cá thể tảo tương đối mỏng và nhỏ, sống riêng lẻ, mặt vỏ của tế bào hình thoi, một mặt hơi thon dài còn mặt vỏ bên kia ít thon dài hơn có hình chữ nhật, các góc cong tròn, nhân có 1 điểm sáng chính giữa. Dựa vào phân loại tảo silic phù du biển Việt Nam, Trương Ngọc An (1995), nhận thấy rằng những đặc điểm này giống với chi tảo Navicula sp. nên tiếp tục tiến hành cấy các mẫu này trên thạch lần thứ 2.
Sau khoảng10÷15 ngày, khuẩn lạc phát triển và tăng dần kích thước. Lúc này khuẩn lạc đã thuần hơn, màu vàng nâu, hình dạng tròn không xuất hiện khuẩn lạc có màu xanh như lần phân lập đầu tiên. Quan sát chúng trên kính hiển vi và cho tảo vào trong các ống nghiệm nuôi ở các độ mặn khác nhau: 10ppt, 15ppt, 20ppt, 25ppt, 30ppt. Môt tuần sau quan sát thấy tảo tương đối thuần khoảng 85%, có hình dạng như đã mô tả ở trên và ở hầu hết tất cả các ống nghiệm có độ mặn khác nhau.
Tiến hành pha loãng dung dịch tảo ở hai ống nghiệm có độ mặn là 25ppt và 30ppt (vì ở hai ống nghiệm này tảo có màu sáng, sắc tố rõ ràng, dịch tảo màu vàng nâu). Sau 5 ngày thấy tảo phát triển tốt ở các độ pha loãng khác nhau:
Ống nghiệm có độ pha loãng 10-1: Vẫn còn lẫn một ít tảo tạp có màu xanh 10-2: Tảo tương đối thuần khoảng 83% 10-3: Tảo tương đối thuần khoảng 90% 10-4: Tảo tương đối thuần khoảng 95% 10-5: Tảo thuần khoảng 100%
10-6: Tảo thuần khoảng 100%
Chọn ống nghiệm thuần nhất tại độ pha loãng 10-6 tiếp tục cấy tảo trên thạch. 15 ngày sau, khuẩn lạc phát triển rất đều, thuần hoàn toàn. Quan sát dưới kính hiển vi, lần quan sát này lại thấy tảo có hình dạng và màu sắc giống với lần quan sát thứ 2.
* Sau khi phân lập được tảo Navicula sp. thuần tiến hành nhân sinh khối và lưu giữ.
3.2. Lưu giữ
3.2.1. Phương pháp lưu giữ giống ở môi trường lỏng, nhiệt độ 5÷60C trong tối.
Dịch tảo thuần được thu ở cuối pha logarit khi sức sống và chất lượng tảo là tốt nhất. Tảo được nuôi trong ống nghiệm hoặc bình tam giác 250ml ở các độ mặn 25ppt, môi trường lưu giữ là F2.
Kiểm tra chất lượng tảo lưu sau 1 tuần cho thấy: màu sắc và chất lượng tảo rất tốt, nguyên sinh chất khá rõ ràng, dịch tảo không bị nhạt màu tế bào bám chắc vào đáy nhưng rời và không bám vào nhau thành từng đám. Sau 4 tuần lưu giữ thấy chất lượng tảo vẫn tốt, tuy nhiên màu sắc của dịch tảo nhạt hơn so với sau 1, 2, 3 tuần lưu giữ. Sau 6, 7, 8 tuần lưu giữ thì tế bào tảo không còn đẹp như trước, nguyên sinh chất ít rõ ràng hơn, tuy nhiên tảo vẫn rời nhau và không có hiện tượng bám dính.
Kiểm tra sự phát triển của tảo sau khi lưu giữ với thời gian khác nhau bằng cách đưa tảo lưu giữ ra nhân sinh khối, kết quả được thể hiện ở Hình 3.1, Bảng 3.3, Bảng 3.4
Bảng 3.3. Sự phát triển của tảo Navicula sp. sau khi lưu giữ trong các khoảng thời gian khác nhau
Thời gian lưu giữ tảo Navicula sp.
Ngày
2 tuần lưu giữ 4 tuần lưu giữ 6 tuần lưu giữ 8 tuần lưu giữ
1 21,3±2,1 25,7±2,4 17,2±1,1 20,2±2,5 2 60,2±5,1 54,3±13,1 49,7±7,9 39,7±4,7 3 84,2±11,3 71,5±6,7 77,8±29,6 88,8±14,5 4 170,7±12,4 148,8±24,4 123,3±25,4 133,3±15,5 5 237,5±6,4 220,5±21,8 215,7±36,7 155,7±26,4 6 310,5±29,5 273,5±21,3 255,8±21,5 257,8±11,4c 7 317,8±5,9a 293,5±7,7ab 276,7±12,9b 193,4±11,2 8 261,2±24,6 269,2±14,5 134,0±11,2 104,0±10,4 9 187,0±21,2 181,7±21,0 104,2±11,2 84,2±7,5 10 145,3±17,2 127,8±22,3 96,0±11,0 86,0±12,3
Ghi chú: Số liệu trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD)(Vạn tb/ml). Các chữ cái khác nhau chỉ sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05).
Vào 4 ngày đầu tiên, mật độ của tảo không có sự sai khác nhiều ở các lô thí nghiệm. Nhưng qua ngày thứ 5 thì sự phát triển này có sự sai khác rõ, mật độ tảo sau 8 tuần lưu giữ là 155,7±26,4vạn tb/ml so với mật độ tảo sau 2 tuần lưu giữ là 237,5±6,4vạn tb/ml, mật độ tảo sau 4 tuần lưu giữ là 220,5±21,8vạn tb/ml, mật độ
tảo sau 6 tuần lưu giữ là 215,7±36,7vạn tb/ml. MĐCĐ của tảo được lưu giữ sau 8 tuần cũng thấp hơn nhiều so với MĐCĐ của tảo ở các lô còn lại. Thời gian lưu giữ ngắn hơn thì tảo đạt MĐCĐ cao hơn, ngày đạt MĐCĐ là ngày thứ 7 chậm hơn so với tảo lưu giữ trong thời gian dài. Tuy nhiên, MĐCĐ của tảo được lưu giữ sau 8 tuần chỉ tương đương thập chí còn thấp hơn so với mật độ của tảo ở các lô còn lại vào ngày thứ 6(ngày các lô còn lại chưa đạt cực đại). Theo kiểm định thống kê thì không có sự sai khác về MĐCĐ của tảo giữa tảo sau 2 tuần lưu giữ và sau 4 tuần lưu giữ, MĐCĐ của tảo lần lượt là 317,8±5,9vạn tb/ml và 293,5±7,7vạn tb/ml,
nhưng có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê so với MĐCĐ của tảo sau 6 tuần lưu giữ và 8 tuần lưu giữ, và MĐCĐ lần lượt là 276,7±12,9vạn tb/ml và 257,8±11,4vạn tb/ml. MĐCĐ của tảo ở lô sau 4 tuần lưu giữ và 6 tuần lưu giữ không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê.
Ở lô tảo được lưu giữ trong 8 tuần tốc độ tăng trưởng theo ngày của tảo cho đến lúc tảo đạt MĐCĐ dao động trong khoảng µ = 0,15÷0,81 nhỏ hơn so với những lô thí nghiệm còn lại: lô tảo được lưu giữ trong 6 tuần là µ = 0,16÷1,06; lô tảo được lưu giữ trong 4 tuần là µ = 0,22÷1,92; lô tảo lưu giữ trong 2 tuần là µ = 0,27÷1,05. Tốc độ tăng trưởng của tảo theo ngày nhỏ hơn 0 vào ngày thứ 7 ở lô tảo lưu giữ trong 8 tuần và những lô còn lại tảo lưu giữ trong 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần tốc độ tăng trưởng âm vào ngày thứ 8.
Sau khi đạt MĐCĐ vào ngày thứ 7, sang đến ngày thứ 8 tốc độ tăng trưởng âm của lô tảo được lưu trong 2 tuần và tảo được lưu trong 4 lần lược là µ = -0,19 và µ = -0,09 nhỏ hơn nhiều so với lô tảo lưu giữ trong 6 tuần là µ = -0,72. Điều này chứng tỏ rằng sau khi đạt MĐCĐ thì mật độ của tảo ở lô 2 tuần và 4 tuần thời gian tàn lịu cũng như tốc độ tàn lịu của tảo chậm hơn so với lô tảo được lưu giữ trong 6 tuần.
Bảng 3.4: Tốc độ tăng trưởng của tảo Navicula sp. sau khi lưu giữ trong các khoảng thời gian khác nhau
Ngày 2 Tuần 4 Tuần 6 Tuần 8 Tuần 1 0,74 0,92 0,53 0,69 2 1,05 0,77 1,06 0,67 3 0,34 0,27 0,45 0,81 4 0,70 0,73 0,47 0,41 5 0,33 0,40 0,56 0,15 6 0,27 0,22 0,17 0,51 7 0,02 0,07 0,08 -0,29 8 -0,19 -0,09 -0,72 -0,62 9 -0,33 -0,40 -0,25 -0,21 10 -0,25 -0,35 -0,08 0,02
Đồ thị cho thấy tảo được lưu giữ trong 8 tuần kể từ ngày phát triển thứ 4 trở đi sinh trưởng chậm hơn nhiều so với tảo được lưu giữ ở thời gian ngắn hơn sau 2, 4, 6 tuần. Đường cong sinh trưởng của tảo được lưu giữ trong 2 tuần và 4 tuần phát triển đều, tảo không tăng trưởng đột ngột và tàn lụi sớm như lô tảo được lưu giữ trong 6 tuần và 8 tuần. Bên cạnh đó cũng nhận thấy rằng tảo lưu giữ trong thời gian càng lâu thì MĐCĐ của tảo đạt được càng giảm.
Thời gian lưu giữ tảo ở môi trường lỏng, nhiệt độ 5÷60C trong tối có thể kéo dài tới 2 tháng đối với tảo Silic [7], [10]. Tuy nhiên dựa vào hình 3.1 và số liệu ở Bảng 3.3, Bảng 3.4 ta thấy tảo lưu càng lâu thì khi đưa ra môi trường nuôi tảo không phát triển tốt do tảo phải làm quen lại với các yếu tố môi trường thay đổi. Tảo sau 8 tuần lưu thì chất lượng tảo đã không còn được tốt, màu sắc bên ngoài và nguyên sinh chất của tảo không rõ ràng.
3.2.2. Phương pháp lưu giữ tảo ở môi trường bán lỏng, nhiệt độ 5÷60C trong tối. tối.
Số liệu thí nghiệm được trình bày ở Hình 3.2, Bảng 3.5, Bảng 3.6
Ghi chú: Số liệu trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD)(Vạn tb/ml). Các chữ
cái khác nhau chỉ sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).
Khi tảo lưu giữ từ 2÷12 tuần MĐCĐ của tảo khi đưa ra nhân sinh khối không có sự sai khác nhiều và MĐCĐ của tảo đạt vào ngày thứ 7. Khi kiểm định thống kê thì cũng không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê về MĐCĐ của tảo ở các lô này. Tuy nhiên ở các lô thí nghiệm mà tảo sau khi được lưu trong thời gian 12 tuần đem ra nhân sinh khối thì sau khi đạt MĐCĐ, mật độ tảo giảm mạnh vào ngày hôm sau chỉ còn là 197,3±15,3 vạntb/ml so với mật độ các lô còn lại (lô tảo được lưu giữ từ 2÷10tuần) mật độ > 234,0±9,4 vạntb/ml.
MĐCĐ của tảo lưu giữ trong 14, 16 tuần đạt được chậm hơn 1 ngày so với các lô còn lại tức là đạt cực đại vào ngày thứ 8(các lô thí nghiệm còn lại MĐCĐ đạt được vào ngày thứ 7). Sau 16 tuần lưu giữ MĐCĐ của tảo đạt được là
285,0±17,9vạn tb/ml thấp hơn khá nhiều so với tất cả các lô còn lại MĐCĐ đạt được là > 311,2±9,5vạn tb/ml. Có sự sai khác khi kiểm định thống kê về MĐCĐ