Phương pháp bố trí thí nghiệm - Phân lập, lưu giữ- 123docz.net

2.2.3.1 Phân lập tảo (Hình 2.2)

Nguồn giống: Tảo thu ở ven biển khu vực Hòn Chồng – Bãi Dương qua lưới lọc thực vật nổi gas 98. Thành phần Hàm lượng (ppm) KNO3 KH2PO4 Na2EDTA FeCl3.6H2O H3BO3 CuSO4.56H2O CoCl3.6H2O MnCl2.6H2O (NH4)6Mo7O4.4H2O B1 B12 ZnSO4.6H2O 100 20 45 1,3 33,6 0,02 0,02 0,36 0,09 0,2 0,01 0,021

2.2.3.2 Lưu giữ tảo

- Phương pháp lưu giữ giống ở môi trường lỏng, nhiệt độ 5÷60C trong tối.

Dịch tảo thuần được thu ở cuối pha logarit khi sức sống và chất lượng tảo là tốt nhất. Tảo được nuôi trong ống nghiệm hoặc bình tam giác 250ml sau đó đặt vào tủ lạnh ở nhiệt độ 5÷ 60C.

Sau 4÷5 ngày đem tảo ra xem chất lượng tảo. Đối với tảo dùng để bố trí thí nghiệm thì để dưới điều kiện ánh sáng yếu (1000÷1500 lux) trong khoảng 1÷2h sau đó dùng tảo để bố trí thí nghiệm.

- Phương pháp lưu giữ tảo ở môi trường bán lỏng, nhiệt độ 5÷60C trong tối. Hình 2.2: Sơ đồ phân lập tảo

Tảo tạp Nhân sinh khối

Cấy san kết hợp thay đổi độ mặn và nhiệt độ, cấy trên thạch

Tảo tương đối thuần Cấy trên thạch

Tảo thuần

Lưu giữ

Nhân sinh khối

Làm thí nghiệm và thử nuôi sinh khối Cấy san kết hợp thay đổi độ mặn

Lấy giống tảo thuần đem nuôi trong ống nghiệm hoặc bình tam giác có đáy thạch. Khi mật độ tảo đạt gần cuối pha logarit, đem cất vào tủ lạnh ở nhiệt độ 5÷60C trong tối.

2.2.3.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng, cường độ ánh sáng, độ mặn, mật độ ban đầu khác nhau lên sự phát triển của tảo Navicula sp. ánh sáng, độ mặn, mật độ ban đầu khác nhau lên sự phát triển của tảo Navicula sp. Các thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác 1000ml.

* Thí nghiệm 1: Chọn môi trường dinh dưỡng phù hợp (Hình 2.3)

Thí nghiệm được tiến hành với 4 môi trường nuôi (TT3, TM, F2, W) lặp lại 3 lần (tổng số là 4x3 =12 nghiệm thức).

Điều kiện nuôi: Nhiệt độ: 250C (đặt trong phòng có máy điều hòa); Cường độ ánh sáng: 3500lux; Độ mặn ban đầu: 25ppt; Mật độ ban đầu: 10 vạntb/ml

* Thí nghiệm 2: Thí nghiệm chọn độ mặn phù hợp(Hình 2.4) Tảo giống Navicula sp.

Xác định được độ mặn thích hợp

15ppt 20ppt 25ppt 30ppt 35ppt

Hình 2.4: Thí nghiệm xác định độ mặn thích hợp Tảo giống Navicula sp.

TT3 F2 WALNE

Xác định được môi trường dinh dưỡng phù hợp TMRL

Thí nghiệm được tiến hành với 5 mức độ mặn 15ppt, 20ppt, 25ppt, 30ppt, 35ppt; lập lại 3 lần (tổng số là 5x3 = 15 nghiệm thức).

Điều kiện nuôi: Nhiệt độ: 250C (đặt trong phòng có máy điều hòa); Cường độ ánh sáng: 3500lux; Mật độ ban đầu: 10vạn tb/ml; Môi trường thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 1.

* Thí nghiệm 3: Thí nghiệm chọn mật độ ban đầu phù hợp (Hình 2.5)

Thí nghiệm được tiến hành với 6 mức mật độ: 1vạn tb/ml, 5vạn tb/ml, 10vạn tb/ml, 15vạn tb/ml, 20vạn tb/ml, 25vạn tb/ml; lập lại 3 lần (tổng số là 6x3 = 18 nghiệm thức).

Điều kiện nuôi: Nhiệt độ: 250C (đặt trong phòng có máy điều hòa); Cường độ ánh sáng: 3500lux; Môi trường thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 1; Độ mặn thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 2;

* Thí nghiệm 4: Thí nghiệm ảnh hưởng của cường độ ánh sáng (Hình 2.6)

25.104tb/ml

Tảo giống Navicula sp.

Xác định được mật độ ban đầu thích hợp

1x104tb/ml 5x104tb/ml 10x104tb/ml 15x104tb/ml 20x104

tb/ml

Hình 2.5 : Thí nghiệm xác định mật độ ban đầu thích hợp

Tảo giống Navicula sp.

Xác định được cường độ ánh sáng thích hợp

1500lux 2500lux 3500lux 4500lux 5000lux

Thí nghiệm được tiến hành với 5 mức ánh sáng: 1500lux, 2500lux, 3500lux, 4500lux, 5000lux; lặp lại 3 lần (tổng số 5x3 = 15 nghiệm thức).

2.2.3.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của hàm lượng nitơ, phospho, silic khác nhau đến sự phát triển của tảo Navicula sp. nhau đến sự phát triển của tảo Navicula sp.

* Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của hàm lượng Nitơ khác nhau đến sự phát triển

của tảo (Hình 2.7)

Các hàm lượng Nitơ trong thí nghiệm là: 4,39; 7,39; 10,39; 13,39; 16,39 mg nitơ/l; lặp lại 3 lần (tổng số là 5x3 = 15 nghiệm thức).

Điều kiện nuôi: Nhiệt độ: 250C (đặt trong phòng có máy điều hòa); Môi trường thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 1; Độ mặn thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 2; Mật độ ban đầu thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 3; Cường độ ánh sáng thích hợp được rút ra thí nghiệm 4.

* Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của hàm lượng phospho khác nhau đến sự phát triển của tảo (Hình 2.8).

Tảo giống Navicula sp.

Xác định được hàm lượng Nitơ phù hợp

4,39 7,39 10,39 13,39 16,39

Hình 2.7: Xác định hàm lượng Nitơ phù hợp

Tảo giống Navicula sp.

Xác định được hàm lượng Phospho phù hợp

0,00 0,64 1,14

1,64 2,14

Các hàm lượng phospho khác nhau: 0,00; 0,64; 1,14; 1,64; 2,14 mg phospho/l. Các lô thí nghiệm được lặp lại 3 lần ( tổng số là 3x5 = 15 nghiệm thức).

Điều kiện nuôi: Nhiệt độ: 250C (đặt trong phòng có máy điều hòa); Môi trường thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 1; Độ mặn thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 2; Mật độ thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 3; Cường độ ánh sáng thích hợp được rút ra thí nghiệm 4; Hàm lượng Nitơ thích hợp rút ra từ thí nghiệm 5.

* Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của hàm lượng Silic khác nhau đến sự phát triển của tảo (Hình 2.9).

Các hàm lượng silic khác nhau: 0,00; 0,65; 1,8; 2,95; 4,1 mg silic/l; lặp lại 3 lần (tổng số là 3x5 = 15 thí nghiệm).

2.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu 2.3.1. Đếm tế bào 2.3.1. Đếm tế bào

 Phương pháp lấy mẫu tảo

 Đối với thí nghiệm được bố trí trong phòng, mẫu tảo được lấy 1 lần trong ngày vào lúc 8h sáng. Dùng que cấy đốt nóng bằng ngọn lửa đèn cồn để tiệt trùng, để nguội que cấy, dùng que cấy lấy 3 miếng vật bám trong bình thí nghiệm đưa vào

Hình 2.9: Thí nghiệm xác định hàm lượng silic phù hợp Tảo giống Navicula sp.

Xác định được hàm lượng Silic phù hợp

mỗi lọ mẫu, cùng lúc đó hút 6ml nước mẫu trong bình thí nghiệm. Dùng que cấy và kéo loại bỏ dây chỉ trên miếng bám nhằm hạn chế sai số. Sử dụng dung dịch lugol trung tính để cố định mẫu.

 Cách pha dung dịch Neutral lugol’s:

20 gam Postasium (KI) + 10g I2 + 200ml nước cất.

* Phương pháp đếm

Việc xác định mật độ tảo được đếm bằng buồng đếm Thomas, buồng đếm có 9 ô lớn, mỗi ô lớn có 16 ô nhỏ riêng ô lớn ở giữa có 25 ô nhỏ. Mỗi ô lớn có diện tích 0, 0025 mm2. Độ sâu buồng đếm là 0,1 mm.

Lấy lamen phủ kín buồng đếm, lắc đều lọ mẫu và dùng pipet paster xịt đều mẫu trong lọ nhằm làm cho tế bào rời ra và phân bố đều. Dùng pipet hút mẫu đưa vào buồng đếm. Chú ý không để mẫu tràn lên mặt trên của lamen, mẫu phải được giọt đầy và tràn ra hai khe buồng đếm. Để mẫu lắng khoảng 2 phút rồi đưa vào xem dưới kính hiển vi ở vật kính 40. Mỗi mẫu được đếm 3 lần và lấy giá trị trung bình.

Hình 2.10: cách đếm tế bào trong buồng đếm

Hướng đếm tế bào trong buồng đếm vị trí. Tế bào đếm không đếm

4 5

- Đối với những loài tảo có mật độ quá dày đều chỉ đếm 5 ô lớn (1, 2, 3, 4, 5) được đánh dấu ở Hình 2.10

Mật độ tảo (tb/ml) = (số tế bào ở 5 ô) x 5 x 104. - Nếu mật độ tảo thưa thì đếm cả 25 ô lớn

Mật độ tảo (tb/ml)= (số tế bào đếm được) x 104.

* Phương pháp xác định tốc độ tăng trưởng ngày của vi tảo

0 1 0 1 C Ln µ t t LnC    [7] Trong đó:

C1 mật độ tảo ở thời điểm t1

C0 mật độ tảo ở thời điểm t0

t1 ngày hôm sau t0 ngày hôm trước

µ tốc độ tăng trưởng theo ngày

2.3.2. Phương pháp xác định các yếu tố môi trường. * Độ mặn (ppt hoặc o/oo): * Độ mặn (ppt hoặc o/oo):

- Phương pháp pha độ mặn: Trong quá trình bố trí thí nghiệm để đạt được độ mặn mong muốn chúng tôi đã tiến hành thao tác pha độ mặn theo công thức sau:

V V1V2 (1) 2 2 1 1. . .N V N V N V   (2) Từ (1) và (2) ta có: V1 = 2 1 2) ( N N N N V   1 2 V V V  

V1, V2: thể tích nước biển, nước ngọt cần sử dụng để pha độ mặn. N1, N2: lần lượt là độ mặn của nước biển và nước ngọt.

Sau khi pha dung dịch dùng khúc xạ kế (Refractometer) có độ chính xác 1ppt để kiểm tra độ mặn trước khi bố trí thí nghiệm.

* Do cường độ ánh sáng (lux)

Dùng máy đo cường độ ánh sáng (Illuminance) hiệu Ana-F11 của Nhật.

* Xác định pH

Dùng bút đo pH có độ chính xác 0,1. Dùng dung dịch chuẩn để đưa pH của máy về 7,0. Đo trước khi bố trí thí nghiệm. Hằng ngày đo pH ở các lô thí nghiệm.

* Đo nhiệt độ (0C)

Sử dụng nhiệt kế rượu có độ chính xác 10C. Theo dõi nhiệt độ phòng thí nghiệm và đo nhiệt độ tảo nuôi sinh khối.

2.4 Xử lý số liệu

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập tảo Navicula sp. thuần chủng

Để có được tảo thuần, tiến hành phân lập bằng cách cấy san kết hợp thay đổi độ mặn (vì mỗi loài thủy sinh vật nói chung chỉ sống ở nơi có nồng độ muối thích hợp [17]. Theo Nguyễn Trọng Nho (1985), ở các đầm nước lợ, nhiều sinh vật bị chết vì nồng độ muối thay đổi đột ngột. Ngoài ra, độ mặn là yếu tố dễ khống chế hơn các yếu tố sinh thái khác).

* Sau khi lấy nước trực tiếp từ biển vào sô nhựa 100 lít và bón phân để tảo tự nhiên ngoài biển tự phát triển. Một tuần sau tiến hành thu mẫu ở đáy (vì Navicula sp. sống ở đáy) và bắt đầu tiến hành phân lập.

Dùng pipét lấy tảo từ thùng 100 lít ra sau đó cho vào 5 ống nghiệm khác nhau, ở các độ mặn khác nhau: 10 ppt, 15ppt, 20 ppt, 25ppt, 30ppt .

- Sau một tuần tảo phát triển, tiến hành quan sát và thu được kết quả sau:

Bảng 3.1: Mức độ thuần của tảo Navicula sp. ở các độ mặn khác nhau Đặc điểm của dịch tảo Ống nghiệm 10ppt Ống nghiệm 15ppt Ống nghiệm 20ppt Ống nghiệm 25ppt Ống nghiệm 30ppt Độ thuần 35% 44% 75% 82% 80%

Màu sắc Xanh, nâu đậm

Xanh, vàng nâu

Vàng nâu Vàng nâu Vàng nâu Qua số liệu được trình bày thấy được tảo Navicula sp.ở ống nghiệm có độ mặn 25ppt, 30ppt là thuần nhất, mức độ thuần của tảo đạt 80÷82%. Tiếp tục tiến hành lấy tảo ở ống nghiệm có độ mặn là 25ppt, 30ppt cấy trên thạch. Mỗi mẫu cấy trên 3 ống nghiệm thạch đông khác nhau (tảo lấy ra ở độ mặn 25ppt, 30 ppt cấy ra 6 ống nghiệm có thạch đông). 10÷15 ngày sau trên các mẫu cấy đã xuất hiện khuẩn lạc. Các khuẩn lạc lúc này có hình dạng và màu sắc khác nhau: màu xanh lục và màu vàng nâu.

Bảng 3.2. Số lượng khuẩn lạc khi phân lập trên môi trường dinh dưỡng thạch đông TT3. Ống nghiệm 25ppt Ống nghiệm 30ppt Đặc điểm khuẩn lạc ống nghiệm thạch 1 ống nghiệm thạch 2 ống nghiệm thạch 3 ống nghiệm thạch 1 ống nghiệm thạch 2 ống nghiệm thạch 3 Số lượng, màu sắc khuẩn lạc 23 nâu 14 xanh 40 nâu 3 xanh 29 nâu 13 xanh 27 nâu 14 xanh 25 nâu 10 xanh 37 nâu 5 xanh

Dựa vào đặc điểm của tảo khuê là có màu vàng nâu, khuẩn lạc có hình dạng tròn nên đã loại được tảo có khuẩn lạc màu xanh lục[1]. Sau đó tiến hành quan sát mẫu trên kính hiển vi, lấy khuẩn lạc (loại tế bào có hình dạng và kích thước gần giống với Navicula sp.) cho vào nuôi trong 5 ống nghiệm khác nhau, với các độ mặn khác nhau: 10ppt, 15ppt, 20ppt, 25ppt, 30ppt (Môi trường dinh dưỡng: TT3, pH: 8,5, nhiệt độ 250C). Một tuần sau khi khuẩn lạc của tảo phát triển trong môi trường nuôi, tiếp tục quan sát dưới kính hiển vi các mẫu trong ống nghiệm. Kết quả cho thấy ống nghiệm có độ mặn 20ppt, độ mặn 25ppt các cá thể tảo tương đối mỏng và nhỏ, sống riêng lẻ, mặt vỏ của tế bào hình thoi, một mặt hơi thon dài còn mặt vỏ bên kia ít thon dài hơn có hình chữ nhật, các góc cong tròn, nhân có 1 điểm sáng chính giữa. Dựa vào phân loại tảo silic phù du biển Việt Nam, Trương Ngọc An (1995), nhận thấy rằng những đặc điểm này giống với chi tảo Navicula sp. nên tiếp tục tiến hành cấy các mẫu này trên thạch lần thứ 2.

Sau khoảng10÷15 ngày, khuẩn lạc phát triển và tăng dần kích thước. Lúc này khuẩn lạc đã thuần hơn, màu vàng nâu, hình dạng tròn không xuất hiện khuẩn lạc có màu xanh như lần phân lập đầu tiên. Quan sát chúng trên kính hiển vi và cho tảo vào trong các ống nghiệm nuôi ở các độ mặn khác nhau: 10ppt, 15ppt, 20ppt, 25ppt, 30ppt. Môt tuần sau quan sát thấy tảo tương đối thuần khoảng 85%, có hình dạng như đã mô tả ở trên và ở hầu hết tất cả các ống nghiệm có độ mặn khác nhau.

Tiến hành pha loãng dung dịch tảo ở hai ống nghiệm có độ mặn là 25ppt và 30ppt (vì ở hai ống nghiệm này tảo có màu sáng, sắc tố rõ ràng, dịch tảo màu vàng nâu). Sau 5 ngày thấy tảo phát triển tốt ở các độ pha loãng khác nhau:

Ống nghiệm có độ pha loãng 10-1: Vẫn còn lẫn một ít tảo tạp có màu xanh 10-2: Tảo tương đối thuần khoảng 83% 10-3: Tảo tương đối thuần khoảng 90% 10-4: Tảo tương đối thuần khoảng 95% 10-5: Tảo thuần khoảng 100%

10-6: Tảo thuần khoảng 100%

Chọn ống nghiệm thuần nhất tại độ pha loãng 10-6 tiếp tục cấy tảo trên thạch. 15 ngày sau, khuẩn lạc phát triển rất đều, thuần hoàn toàn. Quan sát dưới kính hiển vi, lần quan sát này lại thấy tảo có hình dạng và màu sắc giống với lần quan sát thứ 2.

* Sau khi phân lập được tảo Navicula sp. thuần tiến hành nhân sinh khối và lưu giữ.

3.2. Lưu giữ

3.2.1. Phương pháp lưu giữ giống ở môi trường lỏng, nhiệt độ 5÷60C trong tối.

Dịch tảo thuần được thu ở cuối pha logarit khi sức sống và chất lượng tảo là tốt nhất. Tảo được nuôi trong ống nghiệm hoặc bình tam giác 250ml ở các độ mặn 25ppt, môi trường lưu giữ là F2.

Kiểm tra chất lượng tảo lưu sau 1 tuần cho thấy: màu sắc và chất lượng tảo rất tốt, nguyên sinh chất khá rõ ràng, dịch tảo không bị nhạt màu tế bào bám chắc vào đáy nhưng rời và không bám vào nhau thành từng đám. Sau 4 tuần lưu giữ thấy chất lượng tảo vẫn tốt, tuy nhiên màu sắc của dịch tảo nhạt hơn so với sau 1, 2, 3 tuần lưu giữ. Sau 6, 7, 8 tuần lưu giữ thì tế bào tảo không còn đẹp như trước, nguyên sinh chất ít rõ ràng hơn, tuy nhiên tảo vẫn rời nhau và không có hiện tượng bám dính.

Kiểm tra sự phát triển của tảo sau khi lưu giữ với thời gian khác nhau bằng cách đưa tảo lưu giữ ra nhân sinh khối, kết quả được thể hiện ở Hình 3.1, Bảng 3.3, Bảng 3.4

Bảng 3.3. Sự phát triển của tảo Navicula sp. sau khi lưu giữ trong các khoảng