Chuẩn bị nước, dụng cụ thí nghiệm và môi trường di- 123docz.net

2.2.2.1. Nguồn nước thí nghiệm

 Nước biển: Nguồn nước biển được lấy từ các trại sản xuất giống Hải sản của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III.

 Nước dùng để nuôi sinh khối

Nước biển được bơm lên bể chứa, sau đó qua bể lọc cơ học, bể lắng, bơm qua túi lọc rồi xử lý: Cho vào nước 5ppm EDTA +10% ppm chlorine + sục khí mạnh. Sau vài giờ tắt sục khí và đậy bạt. Sau đó tiến hành sục khí, phơi nắng 2÷3 ngày rồi cho vào 15ppm thiosulphat rồi sục khí tiếp trong vòng 1 ngày để trung hòa dư lượng chlrorine. Nước được xử lý xong được bơm qua hệ thống siêu lọc và bể chứa composite đặt trong phòng trước khi sử dụng cho nuôi sinh khối và các mục đích khác nước đều được xử lý qua tia cực tím.

 Nước dùng để nuôi tảo, phân lập, lưu giữ và bố trí các thí nghiệm

Lấy nước biển tự nhiên, xử lý bằng tia cực tím, xác định độ mặn thích hợp bằng cách hòa với nước ngọt đun sôi, pha môi trường cần sử dụng trong các bình tam giác, đậy nút bông, hấp tiệt trùng bằng autoclave ở nhiệt độ 1200C, dưới áp suất 1,5 at trong thời gian 30 phút.

 Nước ngọt: Nước ngọt được lấy từ hệ thống cấp nước của Thành phố.

Lấy vào các thùng chứa khoảng 100÷150 lít, sục khí cho bay hết chlorine. Nước ngọt trước khi sử dụng nuôi tảo, phân lập, lưu giữ, bố trí thí nghiệm đều được nấu sôi để nguội.

2.2.2.2. Chuẩn bị các dụng cụ thí nghiệm

- Bình tam giác 1000ml, 250ml, 500ml, ống nghiệm, cốc đong, pipet, que cấy… được rửa sạch bằng xà phòng, sau đó tráng lại thật sạch với nước ngọt, đậy nút bông và được sấy ở nhiệt độ >1500C, trong thời gian 30 phút.

- Dây sục khí, đá bọt, bình thủy tinh 10 lít dùng để san tảo nuôi sinh khối cũng được rửa sạch bằng xà phòng, sau đó ngâm chlorine rửa sạch lại bằng nước ngọt, phơi khô. Dây sục khí, đá bọt, nắp bình trước khi sử dụng được luộc qua nước sôi.

- Vật bám: Vật bám là miếng nhựa mỏng, trong, có khả năng lắng đáy được cắt 1cm2 đối với mỗi vật bám, góc miếng vật bám có đính chỉ đen để thuận tiện khi lấy mẫu. Vật bám trước khi bố trí được ngâm qua nước sôi khoảng 5 phút sau đó để nguội.

2.2.2.3. Môi trường sử dụng trong quá trình bố trí thí nghiệm

Thành phần Hàm lượng (ppm)

KNO3 70

KH2PO4 10

Acid Citric (C6H8O7.H2O) 7

Urê (NH2CONH2) 5

Silic (Na2SiO3.9H2O) 5

FeCl3.6H2O 2

Môi trường TT3 (đang được sử dụng tại Viện Nghiên Cứu NTTS III) [3]

Môi trường TMRL Erichment (Liao & Huang, 1970) [3]

Thành phần Hàm lượng (ppm)

KNO3 100

NaH2PO4 10

Na2SiO3.9H2O 1

Thành phần Hàm lượng (ppm) KNO3 89,6 KH2PO4 5,6 Na2SiO3.9H2O 30 FeCl3.6H2O 3,15 Na2EDTA 4,36 CuSO4.5H2O 0,01 ZnSO4.6H2O 0,022 CoCl3.6H2O 0,01 MnCl2.6H2O 0,18 NaMoO4.6H2O 0,006 Vitamine: Thianin (B1) 0,1 Biotin (H) 0,0005 Riboflavin (B12) 0,0005

Môi trường Walne[3]

2.2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.2.3.1 Phân lập tảo (Hình 2.2) 2.2.3.1 Phân lập tảo (Hình 2.2)

Nguồn giống: Tảo thu ở ven biển khu vực Hòn Chồng – Bãi Dương qua lưới lọc thực vật nổi gas 98. Thành phần Hàm lượng (ppm) KNO3 KH2PO4 Na2EDTA FeCl3.6H2O H3BO3 CuSO4.56H2O CoCl3.6H2O MnCl2.6H2O (NH4)6Mo7O4.4H2O B1 B12 ZnSO4.6H2O 100 20 45 1,3 33,6 0,02 0,02 0,36 0,09 0,2 0,01 0,021

2.2.3.2 Lưu giữ tảo

- Phương pháp lưu giữ giống ở môi trường lỏng, nhiệt độ 5÷60C trong tối.

Dịch tảo thuần được thu ở cuối pha logarit khi sức sống và chất lượng tảo là tốt nhất. Tảo được nuôi trong ống nghiệm hoặc bình tam giác 250ml sau đó đặt vào tủ lạnh ở nhiệt độ 5÷ 60C.

Sau 4÷5 ngày đem tảo ra xem chất lượng tảo. Đối với tảo dùng để bố trí thí nghiệm thì để dưới điều kiện ánh sáng yếu (1000÷1500 lux) trong khoảng 1÷2h sau đó dùng tảo để bố trí thí nghiệm.

- Phương pháp lưu giữ tảo ở môi trường bán lỏng, nhiệt độ 5÷60C trong tối. Hình 2.2: Sơ đồ phân lập tảo

Tảo tạp Nhân sinh khối

Cấy san kết hợp thay đổi độ mặn và nhiệt độ, cấy trên thạch

Tảo tương đối thuần Cấy trên thạch

Tảo thuần

Lưu giữ

Nhân sinh khối

Làm thí nghiệm và thử nuôi sinh khối Cấy san kết hợp thay đổi độ mặn

Lấy giống tảo thuần đem nuôi trong ống nghiệm hoặc bình tam giác có đáy thạch. Khi mật độ tảo đạt gần cuối pha logarit, đem cất vào tủ lạnh ở nhiệt độ 5÷60C trong tối.

2.2.3.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng, cường độ ánh sáng, độ mặn, mật độ ban đầu khác nhau lên sự phát triển của tảo Navicula sp. ánh sáng, độ mặn, mật độ ban đầu khác nhau lên sự phát triển của tảo Navicula sp. Các thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác 1000ml.

* Thí nghiệm 1: Chọn môi trường dinh dưỡng phù hợp (Hình 2.3)

Thí nghiệm được tiến hành với 4 môi trường nuôi (TT3, TM, F2, W) lặp lại 3 lần (tổng số là 4x3 =12 nghiệm thức).

Điều kiện nuôi: Nhiệt độ: 250C (đặt trong phòng có máy điều hòa); Cường độ ánh sáng: 3500lux; Độ mặn ban đầu: 25ppt; Mật độ ban đầu: 10 vạntb/ml

* Thí nghiệm 2: Thí nghiệm chọn độ mặn phù hợp(Hình 2.4) Tảo giống Navicula sp.

Xác định được độ mặn thích hợp

15ppt 20ppt 25ppt 30ppt 35ppt

Hình 2.4: Thí nghiệm xác định độ mặn thích hợp Tảo giống Navicula sp.

TT3 F2 WALNE

Xác định được môi trường dinh dưỡng phù hợp TMRL

Thí nghiệm được tiến hành với 5 mức độ mặn 15ppt, 20ppt, 25ppt, 30ppt, 35ppt; lập lại 3 lần (tổng số là 5x3 = 15 nghiệm thức).

Điều kiện nuôi: Nhiệt độ: 250C (đặt trong phòng có máy điều hòa); Cường độ ánh sáng: 3500lux; Mật độ ban đầu: 10vạn tb/ml; Môi trường thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 1.

* Thí nghiệm 3: Thí nghiệm chọn mật độ ban đầu phù hợp (Hình 2.5)

Thí nghiệm được tiến hành với 6 mức mật độ: 1vạn tb/ml, 5vạn tb/ml, 10vạn tb/ml, 15vạn tb/ml, 20vạn tb/ml, 25vạn tb/ml; lập lại 3 lần (tổng số là 6x3 = 18 nghiệm thức).

Điều kiện nuôi: Nhiệt độ: 250C (đặt trong phòng có máy điều hòa); Cường độ ánh sáng: 3500lux; Môi trường thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 1; Độ mặn thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 2;

* Thí nghiệm 4: Thí nghiệm ảnh hưởng của cường độ ánh sáng (Hình 2.6)

25.104tb/ml

Tảo giống Navicula sp.

Xác định được mật độ ban đầu thích hợp

1x104tb/ml 5x104tb/ml 10x104tb/ml 15x104tb/ml 20x104

tb/ml

Hình 2.5 : Thí nghiệm xác định mật độ ban đầu thích hợp

Tảo giống Navicula sp.

Xác định được cường độ ánh sáng thích hợp

1500lux 2500lux 3500lux 4500lux 5000lux

Thí nghiệm được tiến hành với 5 mức ánh sáng: 1500lux, 2500lux, 3500lux, 4500lux, 5000lux; lặp lại 3 lần (tổng số 5x3 = 15 nghiệm thức).

2.2.3.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của hàm lượng nitơ, phospho, silic khác nhau đến sự phát triển của tảo Navicula sp. nhau đến sự phát triển của tảo Navicula sp.

* Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của hàm lượng Nitơ khác nhau đến sự phát triển

của tảo (Hình 2.7)

Các hàm lượng Nitơ trong thí nghiệm là: 4,39; 7,39; 10,39; 13,39; 16,39 mg nitơ/l; lặp lại 3 lần (tổng số là 5x3 = 15 nghiệm thức).

Điều kiện nuôi: Nhiệt độ: 250C (đặt trong phòng có máy điều hòa); Môi trường thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 1; Độ mặn thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 2; Mật độ ban đầu thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 3; Cường độ ánh sáng thích hợp được rút ra thí nghiệm 4.

* Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của hàm lượng phospho khác nhau đến sự phát triển của tảo (Hình 2.8).

Tảo giống Navicula sp.

Xác định được hàm lượng Nitơ phù hợp

4,39 7,39 10,39 13,39 16,39

Hình 2.7: Xác định hàm lượng Nitơ phù hợp

Tảo giống Navicula sp.

Xác định được hàm lượng Phospho phù hợp

0,00 0,64 1,14

1,64 2,14

Các hàm lượng phospho khác nhau: 0,00; 0,64; 1,14; 1,64; 2,14 mg phospho/l. Các lô thí nghiệm được lặp lại 3 lần ( tổng số là 3x5 = 15 nghiệm thức).

Điều kiện nuôi: Nhiệt độ: 250C (đặt trong phòng có máy điều hòa); Môi trường thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 1; Độ mặn thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 2; Mật độ thích hợp được rút ra từ thí nghiệm 3; Cường độ ánh sáng thích hợp được rút ra thí nghiệm 4; Hàm lượng Nitơ thích hợp rút ra từ thí nghiệm 5.

* Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của hàm lượng Silic khác nhau đến sự phát triển của tảo (Hình 2.9).

Các hàm lượng silic khác nhau: 0,00; 0,65; 1,8; 2,95; 4,1 mg silic/l; lặp lại 3 lần (tổng số là 3x5 = 15 thí nghiệm).

2.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu 2.3.1. Đếm tế bào 2.3.1. Đếm tế bào

 Phương pháp lấy mẫu tảo

 Đối với thí nghiệm được bố trí trong phòng, mẫu tảo được lấy 1 lần trong ngày vào lúc 8h sáng. Dùng que cấy đốt nóng bằng ngọn lửa đèn cồn để tiệt trùng, để nguội que cấy, dùng que cấy lấy 3 miếng vật bám trong bình thí nghiệm đưa vào

Hình 2.9: Thí nghiệm xác định hàm lượng silic phù hợp Tảo giống Navicula sp.

Xác định được hàm lượng Silic phù hợp

mỗi lọ mẫu, cùng lúc đó hút 6ml nước mẫu trong bình thí nghiệm. Dùng que cấy và kéo loại bỏ dây chỉ trên miếng bám nhằm hạn chế sai số. Sử dụng dung dịch lugol trung tính để cố định mẫu.

 Cách pha dung dịch Neutral lugol’s:

20 gam Postasium (KI) + 10g I2 + 200ml nước cất.

* Phương pháp đếm

Việc xác định mật độ tảo được đếm bằng buồng đếm Thomas, buồng đếm có 9 ô lớn, mỗi ô lớn có 16 ô nhỏ riêng ô lớn ở giữa có 25 ô nhỏ. Mỗi ô lớn có diện tích 0, 0025 mm2. Độ sâu buồng đếm là 0,1 mm.

Lấy lamen phủ kín buồng đếm, lắc đều lọ mẫu và dùng pipet paster xịt đều mẫu trong lọ nhằm làm cho tế bào rời ra và phân bố đều. Dùng pipet hút mẫu đưa vào buồng đếm. Chú ý không để mẫu tràn lên mặt trên của lamen, mẫu phải được giọt đầy và tràn ra hai khe buồng đếm. Để mẫu lắng khoảng 2 phút rồi đưa vào xem dưới kính hiển vi ở vật kính 40. Mỗi mẫu được đếm 3 lần và lấy giá trị trung bình.

Hình 2.10: cách đếm tế bào trong buồng đếm

Hướng đếm tế bào trong buồng đếm vị trí. Tế bào đếm không đếm

4 5

- Đối với những loài tảo có mật độ quá dày đều chỉ đếm 5 ô lớn (1, 2, 3, 4, 5) được đánh dấu ở Hình 2.10

Mật độ tảo (tb/ml) = (số tế bào ở 5 ô) x 5 x 104. - Nếu mật độ tảo thưa thì đếm cả 25 ô lớn

Mật độ tảo (tb/ml)= (số tế bào đếm được) x 104.

* Phương pháp xác định tốc độ tăng trưởng ngày của vi tảo

0 1 0 1 C Ln µ t t LnC    [7] Trong đó:

C1 mật độ tảo ở thời điểm t1

C0 mật độ tảo ở thời điểm t0

t1 ngày hôm sau t0 ngày hôm trước

µ tốc độ tăng trưởng theo ngày

2.3.2. Phương pháp xác định các yếu tố môi trường. * Độ mặn (ppt hoặc o/oo): * Độ mặn (ppt hoặc o/oo):

- Phương pháp pha độ mặn: Trong quá trình bố trí thí nghiệm để đạt được độ mặn mong muốn chúng tôi đã tiến hành thao tác pha độ mặn theo công thức sau:

V V1V2 (1) 2 2 1 1. . .N V N V N V   (2) Từ (1) và (2) ta có: V1 = 2 1 2) ( N N N N V   1 2 V V V  

V1, V2: thể tích nước biển, nước ngọt cần sử dụng để pha độ mặn. N1, N2: lần lượt là độ mặn của nước biển và nước ngọt.

Sau khi pha dung dịch dùng khúc xạ kế (Refractometer) có độ chính xác 1ppt để kiểm tra độ mặn trước khi bố trí thí nghiệm.

* Do cường độ ánh sáng (lux)

Dùng máy đo cường độ ánh sáng (Illuminance) hiệu Ana-F11 của Nhật.

* Xác định pH

Dùng bút đo pH có độ chính xác 0,1. Dùng dung dịch chuẩn để đưa pH của máy về 7,0. Đo trước khi bố trí thí nghiệm. Hằng ngày đo pH ở các lô thí nghiệm.

* Đo nhiệt độ (0C)

Sử dụng nhiệt kế rượu có độ chính xác 10C. Theo dõi nhiệt độ phòng thí nghiệm và đo nhiệt độ tảo nuôi sinh khối.

2.4 Xử lý số liệu

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập tảo Navicula sp. thuần chủng

Để có được tảo thuần, tiến hành phân lập bằng cách cấy san kết hợp thay đổi độ mặn (vì mỗi loài thủy sinh vật nói chung chỉ sống ở nơi có nồng độ muối thích hợp [17]. Theo Nguyễn Trọng Nho (1985), ở các đầm nước lợ, nhiều sinh vật bị chết vì nồng độ muối thay đổi đột ngột. Ngoài ra, độ mặn là yếu tố dễ khống chế hơn các yếu tố sinh thái khác).

* Sau khi lấy nước trực tiếp từ biển vào sô nhựa 100 lít và bón phân để tảo tự nhiên ngoài biển tự phát triển. Một tuần sau tiến hành thu mẫu ở đáy (vì Navicula sp. sống ở đáy) và bắt đầu tiến hành phân lập.

Dùng pipét lấy tảo từ thùng 100 lít ra sau đó cho vào 5 ống nghiệm khác nhau, ở các độ mặn khác nhau: 10 ppt, 15ppt, 20 ppt, 25ppt, 30ppt .

- Sau một tuần tảo phát triển, tiến hành quan sát và thu được kết quả sau:

Bảng 3.1: Mức độ thuần của tảo Navicula sp. ở các độ mặn khác nhau Đặc điểm của dịch tảo Ống nghiệm 10ppt Ống nghiệm 15ppt Ống nghiệm 20ppt Ống nghiệm 25ppt Ống nghiệm 30ppt Độ thuần 35% 44% 75% 82% 80%

Màu sắc Xanh, nâu đậm

Xanh, vàng nâu

Vàng nâu Vàng nâu Vàng nâu Qua số liệu được trình bày thấy được tảo Navicula sp.ở ống nghiệm có độ mặn 25ppt, 30ppt là thuần nhất, mức độ thuần của tảo đạt 80÷82%. Tiếp tục tiến hành lấy tảo ở ống nghiệm có độ mặn là 25ppt, 30ppt cấy trên thạch. Mỗi mẫu cấy trên 3 ống nghiệm thạch đông khác nhau (tảo lấy ra ở độ mặn 25ppt, 30 ppt cấy ra 6 ống nghiệm có thạch đông). 10÷15 ngày sau trên các mẫu cấy đã xuất hiện khuẩn lạc. Các khuẩn lạc lúc này có hình dạng và màu sắc khác nhau: màu xanh lục và màu vàng nâu.

Bảng 3.2. Số lượng khuẩn lạc khi phân lập trên môi trường dinh dưỡng thạch đông TT3. Ống nghiệm 25ppt Ống nghiệm 30ppt Đặc điểm khuẩn lạc ống nghiệm thạch 1 ống nghiệm thạch 2 ống nghiệm thạch 3 ống nghiệm thạch 1 ống nghiệm thạch 2 ống nghiệm thạch 3 Số lượng, màu sắc khuẩn lạc 23 nâu 14 xanh 40 nâu 3 xanh 29 nâu 13 xanh 27 nâu 14 xanh 25 nâu 10 xanh 37 nâu 5 xanh

Dựa vào đặc điểm của tảo khuê là có màu vàng nâu, khuẩn lạc có hình dạng tròn nên đã loại được tảo có khuẩn lạc màu xanh lục[1]. Sau đó tiến hành quan sát mẫu trên kính hiển vi, lấy khuẩn lạc (loại tế bào có hình dạng và kích thước gần giống với Navicula sp.) cho vào nuôi trong 5 ống nghiệm khác nhau, với các độ mặn khác nhau: 10ppt, 15ppt, 20ppt, 25ppt, 30ppt (Môi trường dinh dưỡng: TT3, pH: 8,5, nhiệt độ 250C). Một tuần sau khi khuẩn lạc của tảo phát triển trong môi trường nuôi, tiếp tục quan sát dưới kính hiển vi các mẫu trong ống nghiệm. Kết quả cho thấy ống nghiệm có độ mặn 20ppt, độ mặn 25ppt các cá thể tảo tương đối mỏng và nhỏ, sống riêng lẻ, mặt vỏ của tế bào hình thoi, một mặt hơi thon dài còn mặt vỏ bên kia ít thon dài hơn có hình chữ nhật, các góc cong tròn, nhân có 1 điểm sáng chính giữa. Dựa vào phân loại tảo silic phù du biển Việt Nam, Trương Ngọc An

Chuẩn bị nước, dụng cụ thí nghiệm và môi trường dinh dưỡng

Phương pháp bố trí thí nghiệm

Phương pháp xác định các chỉ tiêu