2.3.3.1. Xác định khả năng chống oxy hóa của dịch thu được bằng test DPPH
Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân bằng Protamex so với dịch thủy phân không bổ sung enzyme.
Xác định khả năng chống oxy hóa thông qua khả năng khử tự do DPPH (2,2-Diphenyl-1-picryl hydrazyl). Khả năng khử tự do DHHP đƣợc xác định dựa vào phƣơng pháp đã đƣợc Bao và cộng sự (2010) sử dụng để kiểm tra khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ nấm [16].
- Nguyên lí: dựa vào độ mất màu của gốc tự do DPPH khi có mặt dịch thủy phân. DPPH là gốc khử, có bản chất dễ bị oxy hóa, có màu tím đậm, khi có mặt chất chống oxy hóa, gốc tự do DPPH sẽ nhận điện tử chuyển thành phân tử DPPH và mất màu tím. Nhƣ vậy, chất có hoạt tính chống oxy hóa càng mạnh sẽ làm mất màu dung dịch gốc tự do DPPH càng mạnh.
- Cách tiến hành: 1 ml DPPH 0,2 mM (dung môi là cồn 96%) và 3 ml mẫu vào mỗi ống nghiệm, lắc đều và ủ trong tối ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút. Sau đó, đo mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 517 nm. So sánh mật độ quang với ống đựng mẫu trắng (chỉ có 1 ml thuốc thử và 3 ml H2O).
- Kết quả đƣợc tính theo công thức:
Trong đó:
DPPH (%): Khả năng kiểm soát gốc tự do DPPH Acontrol: mật độ quang của ống đựng mẫu trắng Amẫu: mật độ quang của ống có mẫu
DPPH (%) = Acontrol – Amẫu Acontrol
2.3.3.2. Xác định khả năng chống oxy hóa của dịch thu được bằng phương pháp tổng năng lực khử
Mô tả: Cho vào ống nghiệm 0,2 ml mẫu cần đo, tiếp đó cho 0,5 ml K3Fe(CN)6 1% bổ sung tiếp 0,8 ml dung dịch đệm (pH = 6,6) cho đủ 1,5 ml. Hỗn hợp đƣợc đem ủ ở 500
C trong 20 phút.
Sau đó ta bổ sung vào ống nghiệm 0,5 ml CCl3COOH 10%. Tiếp tục bổ sung từ từ 2 ml nƣớc cất và 0,4 ml FeCl3 0,1%. Tƣơng tự đo khử gốc tự do DPPH ta tiến hành làm mẫu đối chứng nhƣng không cho mẫu đo mà thay bằng dung dịch đệm. Khả năng khử của hỗn hợp đƣợc đo ở bƣớc sóng 700 nm sử dụng máy đo quang phổ UV-Vis.
2.3.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ Lipit/Myoglobin/H2O2
- Nguyên lý:
Trong hệ lipit/myoglobin/H2O2, phản ứng oxy hóa lipit bị kích hoạt bởi gốc tự do ferrylmyoglobin (ferrylMb) tạo thành từ phản ứng giữa metmyoglobin (metMb) và H2O2.
Sản phẩm oxy hóa lipit tạo thành phản ứng với acid thiobarbituric (TBARS) tạo thành màu đỏ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 535 nm.
Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipit nên cƣờng độ màu đỏ giảm đi. Dựa vào sự thay đổi cƣờng độ màu đỏ để đánh giá hoạt tính của chất chống oxy hóa.
- Dụng cụ, thiết bị:
o Quang phổ kế UV-VIS
o Ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy loại 20 ml o Bể ổn nhiệt có thể thay đổi nhiệt độ từ 30 - 100o
- Hóa chất: o Metmyoglobin o H2O2 o Tween 20 o Lipit o Acid thiobarbituric o KCl o H3PO4 o Butanol - Cách tiến hành:
Cho vào ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy 0,1 ml metmyoglobin 100 µM và 0,1 ml H2O2 100 µM. Lắc đều để phản ứng xảy ra trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó cho tiếp vào ống nghiệm 0,4 ml lipit, 0,2 ml chất chống oxy hóa và 0,2 ml tween 20. Đậy nắp ống nghiệm, trộn đều trên máy (votex) rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 1 giờ.
Lấy 0,2 ml hỗn hợp các chất phản ứng cho vào ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy khác và cho thêm vào 0,3 ml KCl 1,15%, 0,5 ml H3PO4 1%, 1 ml thiobarbituric (TBARS) 0,6%. Đậy nắp ống nghiệm, lắc đều rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 95o
C trong 45 phút.
Sau đó, làm nguội nhanh dƣới vòi nƣớc chảy đến nhiệt độ phòng và tiếp tục cho vào ống nghiệm 4 ml Butanol, lắc đều rồi để yên trong 10 phút. Tách lớp butanol màu đỏ bên trên đem đi đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 520 nm trên quang phổ kế UV - Vis.
Mẫu đối chứng đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣng thay 0,2 ml chất chống oxy hóa bằng 0,2 ml dung môi dùng để hòa tan chất chống oxy hóa.
- Tính kết quả:
Hoạt tính chống oxy hóa (%) = [(Ao – A)/Ao]*100 Ao: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng ở bƣớc sóng 520 nm
A: Độ hấp thụ của mẫu có chứa chất chống oxy hóa ở bƣớc sóng 520 nm
2.3.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên cơ thịt đỏ cá ngừ bằng hệ kích hoạt H2O2 và Fe2+
- Nguyên lý:
Trong hệ protein cơ thịt cá/ H2O2/ Fe2+, phản ứng oxy hóa lipit bị kích hoạt bỡi gốc tự do ferrylmyoglobin (ferrylMb) có trong cơ thịt đỏ cá ngừ tạo thành từ phản ứng giữa metmyoglobin (metMb) và H2O2. Sản phẩm oxy hóa lipit tạo thành phản ứng với acid thiobarbituric (TBARS) tạo thành màu đỏ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 520 nm. Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipit nên cƣờng độ màu đỏ giảm đi. Dựa vào sự thay đổi cƣờng độ màu đỏ để đánh giá hoạt tính của chất chống oxy hóa.
- Dụng cụ, thiết bị:
o Quang phổ kế UV - vis
o Ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy loại 20 ml o Bể ổn nhiệt có thể thay đổi nhiệt độ từ 30 - 100o
C - Hóa chất: o Cơ thịt đỏ cá ngừ o H2O2 o Fe2+ o Acid thiobarbituric o KCl o H3PO4
o Butanol - Cách tiến hành:
Cân 50 g cơ thịt đỏ cá ngừ sau đó băm nhuyễn rồi đồng hóa trong 500 ml dung dịch KCl 1,15%, với tốc độ 10.000 vòng/ phút trong 7 phút (nhằm phá vỡ tế bào giải phóng lipit).
Sau đó, lấy 50 ml dịch từ hỗn hợp trên cho vào các bình tam giác 100 ml, bổ sung 1 ml dịch có hoạt tính chống oxy hóa và 1 ml hỗn hợp gồm 45 µM Fe2+ và 45 µM H2O2 (tỷ lệ 1:1). Trong đó, mẫu đối chứng ta thay 1 ml dịch có hoạt tính chống oxy hóa bằng 1 ml nƣớc cất, sau đó mẫu sẽ đƣợc ủ ở nhiệt độ 37o
C trong 2 giờ (trong thời gian 2 giờ ta lấy mẫu ra phân tích ở các khoảng thời gian 0, 30, 60, 90, 120 phút với mỗi lần lấy 0,5 ml mẫu).
Sau mỗi lần lấy mẫu ta đi xác định TBARS bằng cách cho 0,5 ml mẫu vừa lấy ra vào các ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy cộng thêm 1ml dung dịch TBARS 0,6%, 0,3 ml H3PO4 1%. Đậy nắp ống nghiệm đem đi vortex rồi ủ ở 95oC trong 45 phút. Sau đó, lấy ra làm mát dƣới vòi nƣớc chảy, rồi bổ sung 4 ml Butanol đem đi vortex, rồi ly tâm tách lấy phần dịch màu đỏ son đem đi đo ở 2 bƣớc sóng là 520 nm.
2.3.3.5. Xác định chỉ số oxy hóa (TBARS) theo phương pháp Buege và Aust (1970) áp dụng trên cơ thịt đỏ cá ngừ
- Nguyên lý:
Dùng dung dịch TBA (Thiobarbituric acid) để bắt màu cho dung dịch mẫu bị oxy hóa sau đó đem đi so màu với máy đo quang phổ ở bƣớc sóng 532 nm. Sản phẩm oxy hóa lipit tạo thành phản ứng với acid thiobarbituric tạo thành màu đỏ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 532 nm. Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ
phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipit nên cƣờng độ màu đỏ giảm đi. Dựa vào sự thay đổi cƣờng độ màu đỏ để đánh giá hoạt tính của chất chống oxy hóa.
- Dụng cụ, thiết bị:
o Quang phổ kế UV - vis
o Ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy loại 20 ml o Bể ổn nhiệt có thể thay đổi nhiệt độ từ 30 - 100o
C - Hóa chất: o Cơ thịt đỏ cá ngừ o Acid thiobarbituric o HCl o TCA - Cách tiến hành:
Mẫu sau khi bổ sung dịch tôm ở 2 nồng độ khác nhau là 1/2 và 1/3 so với 50 g cơ thịt đỏ cá ngừ. Tiến hành phân tích mẫu theo các khoảng thời gian khác nhau lần lƣợt là 0, 1, 2 giờ, mỗi lần lấy 0,5 g mẫu và 2,5 ml dung dịch gồm 0,375% acid thiobarbituric (w/v), 15% tricloroacetic acid (w/v), 0,25 M HCl. Sau đó đồng nhất rồi đun sôi (95 -100o
C) trong 10 phút, làm lạnh dƣới vòi nƣớc chảy, ly tâm ở 3600 vòng ở 25oC trong 20 phút và đo ở bƣớc sóng 532 nm.
2.3.4 Phƣơng pháp xử lí số liệu
Dùng các phần mềm Excel 2007, DX6.01, minitab 16 để tính toán, thiết kế thí nghiệm và xử lý số liệu. Tất cả các số liệu đƣợc lấy từ kết quả trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm (độ tin cậy 95%).
2.3.5 Thiết bị
a. Bể ổn nhiệt
- Hãng sản xuất: Memmert - Đức b. Máy vortex
- Model: ZX3
- Hãng sản xuất: VELP - Italy c. Thiết bị đo UV - vis
- Model: Uvmini - 1240
- Hãng sản xuất: Công ty (Nhà máy) và nƣớc sản xuất: Shimazu, Nhật
Hình 2.6. Thiết bị ổn nhiệt Memmert
Hình 2.7 Thiết bị đo UV-vis
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CHẾ ĐỘ THU DỊCH THỦY PHÂN PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
3.1.1. Ảnh hƣởng của loại enzyme đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein thủy phân protein
Nghiên cứu ảnh hƣởng của loại enzyme khác nhau tới quá trình thủy phân protein từ đầu tôm để thu dịch có hoạt tính chống oxy hóa đƣợc thực hiện thông qua xác định:
- Khả năng khử gốc tự do DPPH ở các mẫu thủy phân và tổng năng lực khử
Kết quả đánh giá khả năng kiểm soát gốc DPPH và tổng năng lực khử ở các mẫu thủy phân với 4 loại enzyme khác nhau (gồm Pepsin, Protamex, Alcalase, Flavourzyme) đƣợc thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của loại enzyme đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein.
Hình (A) Khả năng khử gốc tự do DPPH Hình (B) Tổng năng lực khử
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của bốn loại enzyme: Pepsin, Alcalase, Protamex và Flavourzyme đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng ở hình 3.1 cho thấy ảnh hƣởng của bốn enzyme đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân là khác nhau thể hiện ở sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về kết quả đo khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử.
Kết quả này tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác: Nghiên cứu của Imelda W.Y. Cheung, Eunice C.Y. Li-Chan cũng cho thấy rằng loại enzyme đƣợc sử dụng trong thủy phân là yếu tố chính ảnh hƣởng đến sản phẩm hoạt tính sinh học của sản phẩm thủy phân [27].
Ở cùng nồng độ enzyme là 5%, thời gian 2 giờ thì tổng năng lực khử của dịch thủy phân khi bổ sung enzyme Pepsin ở nhiệt độ 40oC, pH = 2 là cao nhất đạt giá trị là 0,32, cao thứ hai là enzyme Protamex ở nhiệt độ 55o
C, pH = 7 là cao nhất đạt giá trị là 0,15. Tổng năng lực khử của dịch khi bổ sung enzyme Alcalase ở nhiệt độ 60oC là 0,12 và thấp nhất là dịch có bổ sung enzyme Flavourzyme 0,58 ở nhiệt độ 55o
C, pH = 7.
Từ kết quả trên có thể kết luận rằng: Các loại enzyme khác nhau ở cùng nồng độ 5%, thời gian 2 giờ và pH, nhiệt độ tối thích của mỗi loại enzyme thủy phân thu đƣợc dịch protein từ đầu tôm thẻ có hoạt tính chống oxy hóa khác nhau.
Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ DPPH bị khử ở mẫu thủy phân bằng enzyme Protamex là cao nhất (19,46 mM) cao gần gấp 2 so với nồng độ DPPH bị khử của dịch thủy phân bằng enzyme pepsin (9,94 mM), gấp 2,64 lần dịch bổ dung enzyme flavourzyme (7,37 mM), gấp 3 lần dịch bổ dung enzyme Alcalase (6,47 mM).
Nhƣ vậy, bổ sung enzyme Protamex vào trong quá trình thủy phân protein của đầu tôm sẽ giúp làm tăng nồng độ DPPH bị khử lên cao nhất và cao hơn gấp hai, ba lần so với khi bổ sung các enzyme còn lại.
Khi bổ sung enzyme Pepsin sẽ thu dịch có tổng năng khử cao nhất, bổ sung enzyme Protamex sẽ có tổng năng lực khử cao thứ hai. Tuy nhiên, enzyme Pepsin hoạt động pH tối thích là 2 và enzyme Protamex hoạt động pH tối thích là 7.
Vì vậy, bổ sung enzyme Protamex sẽ có môi trƣờng pH gần với pH tự nhiên của dịch thủy phân tạo điều kiện các enzyme nội tại có thể hoạt động nhằm tăng khả năng thủy phân dịch và thuận lợi, dễ thực hiện trong quá trình tiến hành
thí nghiệm. Do đó chọn enzyme Protamex để thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng nhằm thu dịch có hoạt tính chống oxy hóa cao.
3.1.2. Tối ƣu quá trình thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Protamex enzyme Protamex
Từ kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của các loại enzyme đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng đã chọn đƣợc enzyme Protamex để thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng nhằm thu dịch có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất.
Tiến hành tối ƣu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Protamex. Sử dụng phần mềm DX6 để tiến hành xử lý tối ƣu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Protamex nhằm thu đƣợc dịch có khả năng chống oxy hóa cao nhất thể hiện qua giá trị nồng độ DPPH (mM) bị khử cao nhất khi thủy phân với điều kiện các biến trong miền khảo sát:
- Nhiệt độ: tối thích của enzyme Protamex là 55oC. - pH: Từ 7 – 9.
- Thời gian: Từ 2 - 10 giờ.
- Nồng độ enzyme bổ sung: Từ 0,05 - 0,3%.
Hàm mục tiêu của thí nghiệm là nồng độ DPPH bị khử là cao nhất.
Từ đó xác định điều kiện các biến để thủy phân bằng enzyme Protamex thu đƣợc dịch khi có hoạt tính sinh học của dịch thủy phân là cao nhất.
Khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Protamex thể hiện qua kết quả thí nghiệm xác định DPPH thu đƣợc từ ma trận thực nghiệm nhƣ bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả chống oxy hóa của dịch thủy phân protein đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Protamex
Mã số thí nghiệm pH Nồng độ enzyme bổ sung (%) Thời gian (giờ) DPPH (Mm) 1 7 0,300 2 17,37 2 7 0,050 2 17,01 3 8 0,175 6 18,91 4 9 0,050 10 11,89 5 8 0,175 6 18,58 6 9 0,050 2 20,18 7 7 0,300 2 18,84 8 9 0,300 2 19,54 9 9 0,300 2 18,47 10 9 0,050 10 14,82 11 7 0,300 10 15,47 12 9 0,300 10 13,56 13 7 0,300 10 16,45 14 9 0,300 10 15,27 15 7 0,050 2 17,46 16 7 0,050 10 17,16 17 9 0,050 2 16,48 18 8 0,175 6 17,54 19 7 0,050 10 18,66 20 8 0,175 6 18,23
Kết quả xử lý tối ƣu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Protamex bằng DX6 ở các điều kiện tối ƣu khác nhau của các yếu tố ảnh hƣởng đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả xử lý tối ƣu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Protamex bằng DX6
Mã số thí nghiệm
Điều kiện tối ƣu
lựa chọn pH Nồng độ enzyme (%) Thời gian (giờ) DPPH (mM) Giá trị thống kê 1 Giá trị các biến trong miền khảo
sát 9,00 0,29 2,00 18,99 a 2 9,00 0,26 2,00 18,91 b 3 9,00 0,20 2,00 18,73 c 4 9,00 0,16 2,00 18,63 d 5 7,62 0,30 2,00 18,38 e 6 7,05 0,28 2,00 18,06 f 7 7,00 0,05 9,55 17,87 g 8 Giá trị các biến khảo sát là cực tiểu 7,00 0,05 2,04 17,25 j 9 7,21 0,05 2,00 17,35 i 10 Giá trị các biến khảo sát là cực đại 9,00 0,30 8,20 15,49 t 11 9,00 0,30 8,04 15,54 r 12 9,00 0,30 8,63 15,20 u 13 8,99 0,30 7,79 15,69 n
14 9,00 0,30 7,62 15,78 m 15 9,00 0,30 8,96 14,99 v 16 9,00 0,29 8,00 15,52 s 17 9,00 0,30 9,69 14,59 w 18 pH và enzyme bổ sung: cực tiểu, thời gian: cực đại
7,31 0,05 10,00 17,20 k
19 7,00 0,06 10,00 17,80 h
20
pH = 8, enzyme bổ sung: cực tiểu, thời gian: cực đại
8,00 0,05 10,00 15,63 o
21
pH = 7,5, enzyme bổ sung: cực tiểu, thời gian: cực đại
7,50 0,05 10,00 16,76 l